Method Article

Erzeugung von Zentromer-assoziierten Protein-E CENP-E-/- Knockout-Zelllinien mit dem CRISPR/Cas9-System

DOI:

10.3791/65476

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel berichtet über die Konstruktion von Zentromer-assoziierten Protein-E (CENP-E) Knockout-Zellen unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems und drei phänotypbasierter Screening-Strategien. Wir haben die CENP-E-Knockout-Zelllinie verwendet, um einen neuartigen Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität der CENP-E-Inhibitoren zu etablieren, der für die Arzneimittelentwicklung und die biologische Forschung nützlich ist.

Abstract

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Das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9-System hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die präzise und effiziente Genbearbeitung in einer Vielzahl von Organismen entwickelt. Das Zentromer-assoziierte Protein-E (CENP-E) ist ein Plus-End-gerichtetes Kinesin, das für die Kinetochor-Mikrotubuli-Erfassung, die Chromosomenausrichtung und den Kontrollpunkt der Spindelassemblierung benötigt wird. Obwohl die zellulären Funktionen der CENP-E-Proteine gut untersucht wurden, war es schwierig, die direkten Funktionen von CENP-E-Proteinen mit herkömmlichen Protokollen zu untersuchen, da die CENP-E-Ablation in der Regel zur Aktivierung des Checkpoints der Spindelassemblierung, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod führt. In dieser Studie haben wir das CENP-E-Gen in humanen HeLa-Zellen vollständig ausgeschaltet und die CENP-E-/- HeLa-Zellen mit dem CRISPR/Cas9-System erfolgreich erzeugt.

Es wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter Zellkolonie-Screening, Chromosomenausrichtungsphänotypen und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-E-Proteinen, die die Screening-Effizienz und die experimentelle Erfolgsrate der CENP-E-Knockout-Zellen effektiv verbessern. Wichtig ist, dass die CENP-E-Deletion zu einer Chromosomenfehlstellung, der abnormalen Position der BUB1-mitotischen Checkpoint-Serin/Threonin-Kinase-B-Proteine (BubR1) und mitotischen Defekten führt. Darüber hinaus haben wir das CENP-E-Knockout-HeLa-Zellmodell verwendet, um eine Identifizierungsmethode für CENP-E-spezifische Inhibitoren zu entwickeln.

In dieser Studie wurde ein nützlicher Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität von CENP-E-Inhibitoren etabliert. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die Protokolle der CENP-E-Geneditierung mit dem CRISPR/Cas9-System vorgestellt, das ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen von CENP-E bei der Zellteilung sein könnte. Darüber hinaus würde die CENP-E-Knockout-Zelllinie zur Entdeckung und Validierung von CENP-E-Inhibitoren beitragen, die wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von Antitumormedikamenten, die Untersuchung von Zellteilungsmechanismen in der Zellbiologie und klinische Anwendungen haben.

Introduction

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Engineered Genome Editing vermittelt die gezielte Modifikation von Genen in einer Vielzahl von Zellen und Organismen. In Eukaryoten kann die ortsspezifische Mutagenese durch die Anwendung sequenzspezifischer Nukleasen eingeführt werden, die die homologe Rekombination der Ziel-DNAstimulieren 1. In den letzten Jahren wurden mehrere Genom-Editing-Technologien, darunter Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs)2,3, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs)4,5 und Homing-Meganukleasen 6,7, entwickelt, um Genome an bestimmten Stellen zu spalten, aber diese Ansätze erfordern komplexes Protein-Engineering und redundante experimentelle Verfahren. Studien haben gezeigt, dass das prokaryotische CRISPR/Cas-System (CRISPR)/Cas-System (Typ II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) eine effiziente Gen-Editing-Technologie ist, die spezifisch die RNA-gesteuerte, ortsspezifische DNA-Spaltung in einer Vielzahl von Zellen und Spezies vermittelt 8,9,10,11. Die CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Technologie hat die Bereiche Grundlagenbiologie, Biotechnologie und Medizin revolutioniert12.

Bakterien und die meisten Archaeen haben ein RNA-basiertes adaptives Immunsystem entwickelt, das CRISPR- und Cas-Proteine verwendet, um Viren und Plasmide zu identifizieren und zu zerstören13. Streptococcus pyogenes Die Cas9 (SpCas9)-Endonuklease enthält die RuvC-ähnliche Holliday-Junction-Resolvase (RuvC) und die His-Asn-His (HNH)-Domäne, die sequenzspezifische, doppelsträngige Brüche (DSBs) effizient vermitteln kann, indem sie eine synthetische Single-Guide-RNA (sgRNA) bereitstellt, die CRISPR-RNAs (crRNA) und transaktivierende crRNA (tracrRNA) enthält14,15,16. DSBs können über den Indel-bildenden nicht-homologen Endverknüpfungsweg (NHEJ) oder den homologiegesteuerten Reparaturweg (HDR) repariert werden, der mehrere Mutationen, einschließlich Insertionen, Deletionen oder narbenlose Einzelnukleotidsubstitutionen, in Säugetierzellen einführt 1,8. Sowohl der fehleranfällige NHEJ- als auch der High-Fidelity-HDR-Signalweg können verwendet werden, um Gen-Knockout durch Insertionen oder Deletionen zu vermitteln, was zu Frameshift-Mutationen und vorzeitigen Stoppcodons führen kann10.

Kinesin-7 CENP-E wird für die Kinetochor-Mikrotubuli-Bindung und die Chromosomenausrichtung während der Zellteilung benötigt 17,18,19. Antikörper-Mikroinjektion 20,21, siRNA-Depletion22,23, chemische Hemmung 24,25,26 und genetische Deletion 27,28,29 von CENP-E führt zu einer Chromosomenfehlstellung, der Aktivierung des Spindelanordnungs-Checkpoints und mitotischen Defekten, was zu Aneuploidie und chromosomaler Instabilität führt 19,30. Bei Mäusen führt die CENP-E-Deletion zu einer abnormalen Entwicklung und embryonalen Letalität in den sehr frühen Entwicklungsstadien 27,29,31. Die genetische Deletion von CENP-E führt in der Regel zu einer Chromosomenfehlstellung und zum Zelltod 26,27,29, was ein Hindernis für die Untersuchung der Funktionen und Mechanismen der CENP-E-Proteine darstellt.

Eine kürzlich durchgeführte Studie hat eine bedingte CENP-E-Knockout-Zelllinie unter Verwendung einer Auxin-induzierbaren CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Methode32 etabliert, die einen schnellen Abbau von CENP-E-Proteinen in relativ kurzer Zeit ermöglicht33. Bisher wurden jedoch keine stabilen CENP-E-Knockout-Zelllinien etabliert, was eine ungelöste technische Herausforderung in der CENP-E-Biologie darstellt. Unter Berücksichtigung der genetischen Robustheit34, der genetischen Kompensationsreaktionen 35,36,37 und der komplexen intrazellulären Umgebungen, da die direkten Folgen einer vollständigen Deletion von CENP-E komplex und unvorhersehbar sein können, ist es wichtig, CENP-E-Knockout-Zelllinien für die Untersuchung von Mechanismen der Chromosomenausrichtung, des Spindelassemblierungs-Checkpoints und der nachgeschalteten Signalwege zu etablieren.

Die Entdeckung und Anwendung von CENP-E-Inhibitoren ist wichtig für die Krebsbehandlung. Bisher wurden sieben Arten von CENP-E-Inhibitoren gefunden und synthetisiert, darunter GSK923295 und seine Derivate24,25, PF-277138,39, Imidazo[1,2-a]pyridin-Gerüstderivate40,41, Compound-A42,43, Syntelin44,45, UA6278446 und Benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazol-Derivate47. Unter diesen Inhibitoren ist GSK923295 ein allosterischer und effizienter CENP-E-Inhibitor, der an die motorische Domäne von CENP-E bindet und die CENP-E-Mikrotubuli-stimulierte ATPase-Aktivität mit einem Ki von 3,2 ± 0,2 nMhemmt 24,25. Im Vergleich zu den hemmenden Wirkungen von GSK923295 auf kultivierte Krebszellen sind die therapeutischen Wirkungen von GSK923295 bei klinischen Krebspatienten jedoch nicht ideal48,49, was auch Bedenken hinsichtlich der Spezifität der GSK923295 für CENP-E aufkommen ließ. Darüber hinaus sind die Spezifität und die Nebenwirkungen anderer CENP-E-Inhibitoren auf die CENP-E-Proteine zentrale Themen in der Krebsforschung.

In dieser Studie haben wir das CENP-E-Gen in HeLa-Zellen mit dem CRISPR/Cas9-System vollständig ausgeschaltet. Es wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter Zellkolonie-Screening, Phänotypen der Chromosomenausrichtung und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-E-Proteinen, um die Screening-Effizienz und Erfolgsrate der CENP-E-Geneditierung zu verbessern. Darüber hinaus können CENP-E-Knockout-Zelllinien verwendet werden, um die Spezifität von Kandidatenverbindungen für CENP-E zu testen.

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Protocol

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1. Aufbau der CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Vektoren

  1. Wählen Sie die genomische Ziel-DNA-Sequenz auf dem humanen CENP-E-Gen (GenBank Accession No. NM_001286734.2) und entwerfen Sie die sgRNA mit einem Online-CRISPR-Design-Tool (http://crispor.tefor.net/).
  2. Geben Sie eine einzelne genomische Sequenz ein, wählen Sie das Genom von "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148" und wählen Sie das Protospacer-benachbarte Motiv "20 bp-NGG-spCas9" aus. Wählen Sie zwei Leitsequenzen, einschließlich sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' und sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', entsprechend den Spezifitätswerten50, der vorhergesagten Effizienz10 und den minimalen Off-Targets.
  3. Bestellen und synthetisieren Sie die einzelsträngigen DNA-Oligonukleotide (ssODNs). Die ssODNs werden in ddH2O auf eine Endkonzentration von 100 μM verdünnt. Um die sgRNA-Oligos zu phosphorylieren und zu annealisieren, geben Sie 1 μl Vorwärtsoligo, 1 μl Reverse-Oligo, 0,5 μl T4-Polynukleotidkinase, 1 μl T4-Polynukleotidkinase-Puffer und 6,5 μl RNase-freies Wasser in ein Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen (PCR) und inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 30 min, 95 °C für 5 min; dann auf 25 °C bei 5 °C min-1 herunterfahren.
  4. Verdauen Sie das pX458-Plasmid mit dem Bbs-Restriktionsenzymfigure-protocol-1 . 1 μg des pX458-Plasmids, 2 μl 10x-Puffer G, 1 μl Bbsfigure-protocol-2 und RNase-freies ddH2O bis 20 μl in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 2 h. Reinigen Sie dann das lineare Plasmid mit dem DNA-Gel-Extraktionskit der Säule gemäß den Protokollen des Herstellers.
  5. Ligate der sgRNA-Oligos in das pX458-Plasmid (pSpCas9(BB)-2A-grün fluoreszierendes Protein (GFP)-Plasmid, Addgene ID. 48138). Fügen Sie 1 μl der geannealten Oligonukleotide, 25 ng des linearen Plasmids, 1 μl 10x T4-DNA-Ligationspuffer, 0,5 μl T4-DNA-Ligase (350 U/μl) hinzu und stellen Sie bis zu 10 μl mit ddH2O in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen her. Die Ligaturlösung wird 2 h lang bei 16 °C inkubiert.
  6. 10 μl des konstruierten Plasmids mit den kompetenten DH5α-Zellen 30 min auf Eis inkubieren, 45 s bei 42 °C einen Hitzeschock versetzen und sofort für 5 min auf Eis legen. Fügen Sie 500 μl Luria-Bertani (LB)-Medium hinzu und säen Sie die Zellen auf einer LB-Platte mit Ampicillin (100 μg/ml). Inkubieren Sie es bei 37 °C für 16 h und screenen Sie die resistenten Klone.
  7. Wählen Sie 5-10 Einzelkolonien mit einer sterilisierten Pipettenspitze aus und überführen Sie sie in eine 1-ml-Kultur von LB-Medium mit Ampicillin (100 μg/ml). Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 180 U/min für 12-16 h.
  8. Isolieren Sie die Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Extraktionskit gemäß den Protokollen des Herstellers. Validieren Sie die Plasmid-DNA jeder Kolonie durch Sanger-Sequenzierung von der U6-Promotorstelle mit dem U6-Fwd-Primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. Extrahieren und reinigen Sie die Plasmide mit dem endofreien Plasmid-DNA-Kit gemäß den Protokollen des Herstellers.

2. Transfektion, Isolierung und Screening der CENP-E Knockout-HeLa-Zellen

  1. Kultur von HeLa-Zellen in Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
  2. Inkubieren Sie die HeLa-Zellen mit 0,25 % Trypsin/Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) bei 37 °C für 2-3 Minuten, dissoziieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und säen Sie die Zellen dann in neue Platten in einem Verdünnungsverhältnis von 1:4 für die Zellpassage.
  3. Die Zellen in eine 12-Well-Platte aussäen und vor der Transfektion auf 60-70 % Konfluenz kultivieren. Transfizieren Sie die pX458-sgRNA-Plasmide in HeLa-Zellen unter Verwendung der referenzierten Reagenzien gemäß den Protokollen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
    1. Mischen Sie vorsichtig 1 μg validiertes pX458-sgRNA-Plasmid und 50 μl reduziertes Serummedium in Röhrchen A. Mischen Sie dann vorsichtig 2 μl des Transfektionsreagenzes und 50 μl reduziertes Serummedium in Röhrchen B. Inkubieren Sie die Röhrchen A und B separat bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
    2. Sowohl Röhrchen A als auch Röhrchen B vorsichtig mischen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie die Mischung in eine 12-Well-Platte, inkubieren Sie die Zellen 6 Stunden lang und ersetzen Sie das Medium durch ein frisches DMEM-Medium.
  4. Untersuchen Sie HeLa-Zellen nach 24 h oder 48 h mit einem Fluoreszenzmikroskop auf Transfektionseffizienz. Nach der Transfektion für 48 h werden die transfizierten HeLa-Zellen mit 0,25 % Trypsin/EDTA bei 37 °C für 3-5 Minuten vollständig dissoziiert, die Anzahl der Zellen mit einer Neubauer-Kammer oder einem automatisierten Zellzähler gezählt und die Zellen in drei separate 96-Well-Platten für jede transfizierte Population gemäß den seriellen Verdünnungsmethoden10 plattiert.
  5. Stellen Sie die Zellen wieder in einen befeuchteten Inkubator und kultivieren Sie sie dann weitere 1-2 Wochen. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 3 Tage. Für das phänotypbasierte Screening und die Validierung des CENP-E-Knockouts dissoziieren und expandieren Sie die Zellen 5-7 Tage lang in 24-Well- oder 12-Well-Platten.
  6. Untersuchen Sie die mutierten Zellen mit kleineren Zellkoloniedurchmessern mit einem inversen Mikroskop, das mit 10x- und 20x-Objektivlinsen ausgestattet ist.
    HINWEIS: CENP-E-Mutationen führen in der Regel zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl der sich teilenden Zellen in Zellkolonien, was einer der Schlüsselindikatoren für das Screening der CENP-E-Mutantenzellen sein kann.
  7. Ernten Sie die Zellen für die DNA-Extraktion mit dem Säulen-Tiergenom-DNA-Extraktionskit gemäß den Protokollen des Herstellers. Richten Sie die PCR-Reaktionen wie folgt ein: 0,25 μl Taq-Polymerase, 5 μl 10x-Puffer (Mg2+ plus), 4 μl dNTP-Mischungen, 500 ng DNA-Template, 1 μl Vorwärtsoligo, 1 μl reverse Oligo und passen Sie ddH2O auf 50 μl an. Verwenden Sie die folgenden PCR-Programmeinstellungen für die Genamplifikation: 98 °C, 10 s; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s für 33 Zyklen; 72 °C, 10 min und dann bei 4 °C halten.
    HINWEIS: Die spezifischen Primer für die Klonierung des Zielortes sind wie folgt aufgeführt: CENP-E-Ziel F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E-Ziel R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTCTC-3'; CENP-E-Ziel F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E-Ziel R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Ligate der Ziel-DNA in den pMD18-T-Vektor gemäß den Protokollen des Herstellers. Transfizieren Sie das ligierte Plasmid in kompetente DH5α-Zellen und kultivieren Sie es zur Auswahl von Klonen.
  9. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch, um die Arten von CENP-E-Knockout zu bestimmen. Isolieren Sie die Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Extraktionskit gemäß den Protokollen des Herstellers. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung der Plasmid-DNA jeder Kolonie mit den M13-Vorwärts- und Rückwärtsprimern durch. M13F Zündhütchen, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; M13R-Zündhütchen, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Aussaat der Wildtyp- und CENP-E-Mutanten-HeLa-Zellen auf 12-mm-Glasdeckgläsern in einer 24-Well-Platte. Entfernen Sie das gesamte DMEM-Medium und fixieren Sie die Zellen in 4% paraformaldehyd/phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
  11. Färben Sie die Kerne mit der 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung bei Raumtemperatur für 5 min. Screening und Validierung der CENP-E-Mutantenzellen basierend auf dem Phänotyp der Chromosomenausrichtung mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Plan Fluor 40x/ Numerical Aperture (NA) 0,75 Objektiv ausgestattet ist.
  12. Screening und Validierung der CENP-E-Knockout-Zellen durch Immunfluoreszenzfärbung und -analyse (siehe Abschnitt 3) von CENP-E-Proteinen.

3. Immunfluoreszenzfärbung und hochauflösende konfokale Mikroskopie

  1. Fixieren Sie die Zellen mit 4%iger Paraformaldehyd/PBS-Fixierlösung bei Raumtemperatur für 10 min und tauchen Sie sie für 2 x 5 min in 1x PBS.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen in einem gesunden Zustand befinden und die Zellen vorsichtig gesammelt und fixiert werden, um eine Ablösung der Metaphase-Zellen zu vermeiden.
  2. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,25% Triton X-100/PBS bei Raumtemperatur für 10 min und tauchen Sie sie für 2 x 5 min in 1x PBS.
  3. Blockieren Sie die Zellen mit 1 % BSA/PBST (0,1 % Tween 20 in PBS) bei Raumtemperatur für 1 h. Die Primärantikörper werden mit 1 % BSA/PBST verdünnt und die Proben 12 h lang bei 4 °C inkubiert.
  4. Die primären Antikörperlösungen verwerfen, die Zellen 3 x 5 min mit 1x PBS spülen und die Zellen mit verdünnten Sekundärantikörpern 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Entsorgen Sie die sekundären Antikörper und spülen Sie die Zellen in 1x PBS für 3 x 5 min.
  6. Färben Sie die Kerne mit DAPI bei Raumtemperatur für 5 min. Montieren Sie die Dias mit dem Montagemedium. Versiegeln Sie die Objektträger mit Nagellack.
  7. Beobachten und zeichnen Sie die Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen Rastermikroskop auf, das mit einem 63x/NA 1.40-Objektiv ausgestattet ist.

4. Chromosomenpräparation und Karyotypanalyse

  1. Kultivieren Sie die Wildtyp- und CENP-E-/- HeLa-Zellen 24 h lang in vollständigem DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin, und inkubieren Sie dann die Wildtyp - und CENP-E-/- HeLa-Zellen 5 h lang mit 300 nM Colchicin.
  2. Inkubieren Sie die Zellen 3 Minuten lang mit 0,25 % Trypsin/EDTA bei 37 °C und sammeln Sie die Zellen in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
  3. Die Zellen werden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.000 × g zentrifugiert, die Überstände verworfen, 1,2 ml 0,075 mol/l KCl-Lösung hinzugefügt und 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur, verwerfen Sie die Überstände, fügen Sie 0,2 ml der Fixierlösung (Methanol: Eisessig = 3:1) zur Präfixierung hinzu und mischen Sie vorsichtig für 1 min.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur, sammeln Sie die Pellets, fügen Sie 1,5 ml der Fixierlösung bei Raumtemperatur für 10 min hinzu und zentrifugieren Sie dann bei 1.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  6. Verwerfen Sie die Überstände, fügen Sie 0,6 ml der Fixierlösungen hinzu und bereiten Sie eine Zellsuspension vor. Geben Sie 3-5 Tropfen der Zellsuspensionen aus einer Höhe von 35-40 cm auf die Eisobjektträger.
    Anmerkungen: Halten Sie die Höhe zum Lösen der Zellenaufhängungen auf den Objektträgern bei 35-40 cm; Andernfalls können die Chromosomen zu weit verstreut oder nicht voneinander getrennt sein.
  7. Trocknen Sie die Objektträger sofort mit einer Alkohollampe, färben Sie die Proben 7 Minuten lang mit 10%iger Giemsa-Färbelösung, spülen Sie die Objektträger 2 Minuten lang mit fließendem Wasser ab und beobachten Sie die Proben mit einem Lichtmikroskop, das mit einem Plan Fluor 40x/NA 0,75-Objektiv ausgestattet ist.

5. Assay zur Bildung von Zellkolonien

  1. Bereiten Sie die Zellsuspensionen in den 6-Well-Platten mit einer Zelldichte von 1.000-2.000 Zellen/Well vor. Schütteln Sie die Platten vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
  2. Legen Sie die 6-Well-Platten in einen CO2 -Inkubator und inkubieren Sie sie 2-3 Wochen lang bei 37 °C mit 5 % CO2. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 5 Tage. Nehmen Sie die Bilder mit einem inversen Mikroskop auf, das mit 10x- und 20x-Objektivlinsen ausgestattet ist. Ernten Sie die Zellen, wenn Kolonien sichtbar sind (Hunderte von Zellen innerhalb eines Klons).
  3. Um die Auswirkungen von GSK923295 zu untersuchen, kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in den 6-Well-Platten und fügen Sie 2 ml GSK923295 in den Endkonzentrationen von 10, 25, 50, 100 und 200 nM hinzu.
    HINWEIS: Bewegen Sie die Kulturschale nicht im frühen Stadium der Klonbildung, um Zellablösung zu vermeiden, die neue Klone bilden und das Screening transfizierter Zellen beeinträchtigen kann.
  4. Entsorgen Sie das Kulturmedium und fixieren Sie die Zellen mit 1% PFA bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Färben Sie die Kolonien mit 0,1% kristallvioletter Färbelösung bei Raumtemperatur für 15 min. Spülen Sie die Proben dreimal mit 1x PBS. Zeichnen Sie die Bilder von Zellkolonien auf und quantifizieren Sie die Durchmesser jeder Kolonie mit der ImageJ-Software. Wählen Sie das Auswahlwerkzeug für gerade Linien , klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie Messen und zeichnen Sie die Länge auf.
  5. Spülen Sie die Kolonien 5 Minuten lang mit 1 ml 10%iger Essigsäurelösung. Übertragen Sie 200 μl der überstehenden Lösungen in eine 96-Well-Platte und messen Sie die Absorptionswerte mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer beiA 600 nm.

6. Zellviabilitäts-Assay

  1. Aussaat der Zellen in den 24-Well-Platten und Kultivierung der Zellen für 48 h bis 80-90% Dichte.
  2. Inkubieren Sie die Zellen mit 100 μl 0,25 % Trypsin/EDTA bei 37 °C für 3 Minuten.
  3. Mischen Sie 400 μl PBS mit einer Pipettenpistole mit den Zellen. Übertragen Sie 100 μl der Zellsuspensionen in die 96-Well-Platte.
  4. Geben Sie 20 μl MTS-Lösung mit einer Endkonzentration von 317 μg/ml in jede Vertiefung und mischen Sie vorsichtig gemäß den Protokollen des Herstellers. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 1-3 h in einem CO2 -Inkubator.
  5. Zeichnen Sie die Absorptionswerte jedes Wells bei der Absorptionsspitze von A490 nm mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer auf. Verwenden Sie eine Referenzwellenlänge von A630 nm , um den Hintergrund zu subtrahieren, der durch Zelltrümmer und unspezifische Absorption verursacht wird (Zellviabilität = A490 nm - A630 nm).

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Results

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Die CENP-E-/- HeLa-Zellen wurden erfolgreich mit dem CRISPR/Cas9-System erzeugt (Abbildung 1). Der Zeitplan und die kritischen experimentellen Schritte dieser Methode sind in Abbildung 1 dargestellt. Zuerst haben wir die CENP-E-spezifischen sgRNAs entworfen und synthetisiert, die sgRNAs in das pX458-Plasmid getempert und ligiert, das Plasmid in HeLa-Zellen transfiziert und sie 48 h lang kultiviert. Die transfizierten Zellen wurden di...

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Discussion

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Kinesin-7 CENP-E ist ein wichtiger Regulator bei der Chromosomenausrichtung und dem Kontrollpunkt der Spindelassemblierung während der Zellteilung 17,19,20. Die genetische Deletion von CENP-E führt in der Regel zur Aktivierung des Spindelmontage-Checkpoints, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod 27,29,51,52.<...

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken allen Mitgliedern des Zytoskelett-Labors der Fujian Medical University für hilfreiche Gespräche. Wir danken Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin und Min-Xia Wu vom Public Technology Service Center der Fujian Medical University für ihre technische Unterstützung. Wir danken Si-Yi Zheng, Ying Lin und Qi Ke vom Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences an der Fujian Medical University für ihre Unterstützung. Diese Studie wurde durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: National Natural Science Foundation of China (Fördernummer 82001608 und 82101678), Natural Science Foundation of Fujian Province, China (Fördernummer 2019J05071), die Joint Funds for the Innovation of Science and Technology, die Provinz Fujian, China (Fördernummer 2021Y9160) und das Fujian Medical University High-Level Talents Scientific Research Start-up Funding Project (Fördernummer XRCZX2017025).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25 % Trypsin-EDTAGibco25200056
1,5 mL ZentrifugenröhrchenAxygenMCT-150-C
24-Well-PlatteCorning3524
4S Geliert, 10.000x in WasserSangon Biotech (Shanghai)A616697
50 mL ZentrifugenröhrchenCorning430828
6 cm PetrischaleCorning
95%iges EthanolSinopharm Chemisches Reagenz10009164
96-Well-PlatteCorning3599
EssigsäureSinopharm Chemisches Reagenz10000218In H2O auflösen, um eine 10%ige Arbeitslösung herzustellen.
AgaroseSangon Biotech (Shanghai)A620014
Alexa Fluor 488-markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG(H+L)BeyotimeA0428Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:500 Verdünnung.
Alexa Fluor 488-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG(H+L)BeyotimeA0423Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:500 Verdünnung.
Alexa Fluor 555-markiertes Esel-Anti-Maus-IgG(H+L)BeyotimeA0460Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:500 Verdünnung.
Wasserfreies EthanolSinopharm Chemisches Reagenz100092690
monoklonaler Anti-BubR1-Kaninchen-AntikörperAbcamab254326Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:100 Verdünnung 
Monoklonaler Anti-CENP-B-Maus-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-376392Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:50 Verdünnung.
Monoklonaler Anti-CENP-E-Kaninchen-AntikörperAbcamab133583Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:100 Verdünnung.
Anti-Fade-EindeckmittelBeyotimeP0131Verlangsamt das Löschen von Fluoreszenzsignalen.
Monoklonaler Anti-&Alpha-Tubulin-Maus-AntikörperAbcamab7291Für die Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:100 Verdünnung.
Biotek Epoch Mikrotiterplatten-SpektralphotometerBiotek InstrumentsBiotek Epoch
Rinderserumalbumin (BSA)Sinopharm Chemisches Reagenz69003435
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011
CellTiter 96 wässriger Einlösungs-ZellproliferationsassayPromegaG3580
ZentrifugeEppendorf5424BK745380
ColchicinSinopharm Chemisches Reagenz61001563
Konfokales RastermikroskopLeicaLeica TCS SP8
DeckglasCITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5α kompetente ZellenSangon Biotech (Shanghai)B528413
DL2000 DNA-MarkerTaKaRa3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
Endo-freies Plasmid Mini-Kit figure-materials-1OmegaD6950
Ezup Säule Tiergenomisches DNA-AufreinigungskitSangon Biotech (Shanghai)B518251
Fötales RinderserumZhejiang Tianhang Biotechnology11011-8611
EnzianviolettSinopharm Chemisches Reagenz71019944In PBS auflösen, um 0,1 % Enzianviolett/PBS herzustellen.
Giemsa FärbelösungSinopharm Chemisches Reagenz71020260
GraphPad Prism Version 8.0 SoftwareGraphPadwww.graphpad.comStatistische Analyse.
GSK923295MedChemExpressHY-10299
HeLa-ZelllinieATCCCCL-2
Befeuchteter InkubatorHeal ForceHF90/HF240
Image J SoftwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Bildverarbeitung und -analyse.
Inverses MikroskopNanjing Jiangnan Novel OpticsXD-202
LB Agar PulverSangon Biotech (Shanghai)A507003
Lipo6000 TransfektionsreagenzBeyotimeC0526
Nikon Ti-S2 MikroskopNikonTi-S2
Opti-MEM  reduziert  Serum  MediumGibco31985070
ParaformaldehydSinopharm Chemisches Reagenz80096618In PBS auflösen, um 4% Paraformaldehyd/PBS herzustellen.
Penicillin-Streptomycin-LösungHyCloneSV30010
SanPrep Säule DNA-Gel-ExtraktionskitSangon Biotech (Shanghai)B518131
SanPrep  Kolumne  Plasmid  Mini-Vorbereitungen  KitSangon Biotech (Shanghai)B518191
TaKaRa2011A
T4-PolynukleotidkinaseTaKaRa2021A
TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001A
Triton X-100Sinopharm Chemisches Reagenz30188928In PBS auflösen, um 0,25 % Triton X-100/PBS herzustellen.
Tween 20Sinopharm Chemisches Reagenz30189328PBS auflösen, um 0,1 % Tween 20/PBS herzustellen.
430166 T4-DNA-Ligase In

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