Dieser Artikel berichtet über die Konstruktion von Zentromer-assoziierten Protein-E (CENP-E) Knockout-Zellen unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems und drei phänotypbasierter Screening-Strategien. Wir haben die CENP-E-Knockout-Zelllinie verwendet, um einen neuartigen Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität der CENP-E-Inhibitoren zu etablieren, der für die Arzneimittelentwicklung und die biologische Forschung nützlich ist.
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Methodenartikel
Erzeugung von Zentromer-assoziierten Protein-E CENP-E-/- Knockout-Zelllinien mit dem CRISPR/Cas9-System
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9-System hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die präzise und effiziente Genbearbeitung in einer Vielzahl von Organismen entwickelt. Das Zentromer-assoziierte Protein-E (CENP-E) ist ein Plus-End-gerichtetes Kinesin, das für die Kinetochor-Mikrotubuli-Erfassung, die Chromosomenausrichtung und den Kontrollpunkt der Spindelassemblierung benötigt wird. Obwohl die zellulären Funktionen der CENP-E-Proteine gut untersucht wurden, war es schwierig, die direkten Funktionen von CENP-E-Proteinen mit herkömmlichen Protokollen zu untersuchen, da die CENP-E-Ablation in der Regel zur Aktivierung des Checkpoints der Spindelassemblierung, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod führt. In dieser Studie haben wir das CENP-E-Gen in humanen HeLa-Zellen vollständig ausgeschaltet und die CENP-E-/- HeLa-Zellen mit dem CRISPR/Cas9-System erfolgreich erzeugt.
Es wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter Zellkolonie-Screening, Chromosomenausrichtungsphänotypen und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-E-Proteinen, die die Screening-Effizienz und die experimentelle Erfolgsrate der CENP-E-Knockout-Zellen effektiv verbessern. Wichtig ist, dass die CENP-E-Deletion zu einer Chromosomenfehlstellung, der abnormalen Position der BUB1-mitotischen Checkpoint-Serin/Threonin-Kinase-B-Proteine (BubR1) und mitotischen Defekten führt. Darüber hinaus haben wir das CENP-E-Knockout-HeLa-Zellmodell verwendet, um eine Identifizierungsmethode für CENP-E-spezifische Inhibitoren zu entwickeln.
In dieser Studie wurde ein nützlicher Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität von CENP-E-Inhibitoren etabliert. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die Protokolle der CENP-E-Geneditierung mit dem CRISPR/Cas9-System vorgestellt, das ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen von CENP-E bei der Zellteilung sein könnte. Darüber hinaus würde die CENP-E-Knockout-Zelllinie zur Entdeckung und Validierung von CENP-E-Inhibitoren beitragen, die wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von Antitumormedikamenten, die Untersuchung von Zellteilungsmechanismen in der Zellbiologie und klinische Anwendungen haben.
Einleitung
Engineered Genome Editing vermittelt die gezielte Modifikation von Genen in einer Vielzahl von Zellen und Organismen. In Eukaryoten kann die ortsspezifische Mutagenese durch die Anwendung sequenzspezifischer Nukleasen eingeführt werden, die die homologe Rekombination der Ziel-DNAstimulieren 1. In den letzten Jahren wurden mehrere Genom-Editing-Technologien, darunter Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs)2,3, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs)4,5 und Homing-Meganukleasen 6,7
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Protokoll
1. Aufbau der CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Vektoren
- Wählen Sie die genomische Ziel-DNA-Sequenz auf dem humanen CENP-E-Gen (GenBank Accession No. NM_001286734.2) und entwerfen Sie die sgRNA mit einem Online-CRISPR-Design-Tool (http://crispor.tefor.net/).
- Geben Sie eine einzelne genomische Sequenz ein, wählen Sie das Genom von "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148" und wählen Sie das Protospacer-benachbarte Motiv "20 bp-NGG-spCas9" aus. Wählen Sie zwei Leitsequenzen, einschließlich sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' und sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3....
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Ergebnisse
Die CENP-E-/- HeLa-Zellen wurden erfolgreich mit dem CRISPR/Cas9-System erzeugt (Abbildung 1). Der Zeitplan und die kritischen experimentellen Schritte dieser Methode sind in Abbildung 1 dargestellt. Zuerst haben wir die CENP-E-spezifischen sgRNAs entworfen und synthetisiert, die sgRNAs in das pX458-Plasmid getempert und ligiert, das Plasmid in HeLa-Zellen transfiziert und sie 48 h lang kultiviert. Die transfizierten Zellen wurden di.......
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Diskussion
Kinesin-7 CENP-E ist ein wichtiger Regulator bei der Chromosomenausrichtung und dem Kontrollpunkt der Spindelassemblierung während der Zellteilung 17,19,20. Die genetische Deletion von CENP-E führt in der Regel zur Aktivierung des Spindelmontage-Checkpoints, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod 27,29,51,52.<.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken allen Mitgliedern des Zytoskelett-Labors der Fujian Medical University für hilfreiche Gespräche. Wir danken Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin und Min-Xia Wu vom Public Technology Service Center der Fujian Medical University für ihre technische Unterstützung. Wir danken Si-Yi Zheng, Ying Lin und Qi Ke vom Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences an der Fujian Medical University für ihre Unterstützung. Diese Studie wurde durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: National Natural Science Foundation of China (Fördernummer 82001608 und 82101678), Natural Science Foundation of Fujian Province, China (Fördernum....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1,5 mL Zentrifugenröhrchen | Axygen | MCT-150-C | |
| 24-Well-Platte | Corning | 3524 | |
| 4S Geliert, 10.000x in Wasser | Sangon Biotech (Shanghai) | A616697 | |
| 50 mL Zentrifugenröhrchen | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petrischale | Corning | ||
| 95%iges Ethanol | Sinopharm Chemisches Reagenz | 10009164 | |
| 96-Well-Platte | Corning | 3599 | |
| Essigsäure | Sinopharm Chemisches Reagenz | 10000218 | In H2O auflösen, um eine 10%ige Arbeitslösung herzustellen. |
| Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) | A620014 | |
| Alexa Fluor 488-markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG(H+L) | Beyotime | A0428 | Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:500 Verdünnung. |
| Alexa Fluor 488-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG(H+L) | Beyotime | A0423 | Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:500 Verdünnung. |
| Alexa Fluor 555-markiertes Esel-Anti-Maus-IgG(H+L) | Beyotime | A0460 | Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:500 Verdünnung. |
| Wasserfreies Ethanol | Sinopharm Chemisches Reagenz | 100092690 | |
| monoklonaler Anti-BubR1-Kaninchen-Antikörper | Abcam | ab254326 | Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:100 Verdünnung |
| Monoklonaler Anti-CENP-B-Maus-Antikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-376392 | Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:50 Verdünnung. |
| Monoklonaler Anti-CENP-E-Kaninchen-Antikörper | Abcam | ab133583 | Für Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:100 Verdünnung. |
| Anti-Fade-Eindeckmittel | Beyotime | P0131 | Verlangsamt das Löschen von Fluoreszenzsignalen. |
| Monoklonaler Anti-&Alpha-Tubulin-Maus-Antikörper | Abcam | ab7291 | Für die Immunfluoreszenz. In 1 % BSA/PBST auflösen. 1:100 Verdünnung. |
| Biotek Epoch Mikrotiterplatten-Spektralphotometer | Biotek Instruments | Biotek Epoch | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sinopharm Chemisches Reagenz | 69003435 | |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | |
| CellTiter 96 wässriger Einlösungs-Zellproliferationsassay | Promega | G3580 | |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Colchicin | Sinopharm Chemisches Reagenz | 61001563 | |
| Konfokales Rastermikroskop | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Deckglas | CITOTEST | 80344-1220 | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| DH5α kompetente Zellen | Sangon Biotech (Shanghai) | B528413 | |
| DL2000 DNA-Marker | TaKaRa | 3427A | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Endo-freies Plasmid Mini-Kit  | Omega | D6950 | |
| Ezup Säule Tiergenomisches DNA-Aufreinigungskit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518251 | |
| Fötales Rinderserum | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 11011-8611 | |
| Enzianviolett | Sinopharm Chemisches Reagenz | 71019944 | In PBS auflösen, um 0,1 % Enzianviolett/PBS herzustellen. |
| Giemsa Färbelösung | Sinopharm Chemisches Reagenz | 71020260 | |
| GraphPad Prism Version 8.0 Software | GraphPad | www.graphpad.com | Statistische Analyse. |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| HeLa-Zelllinie | ATCC | CCL-2 | |
| Befeuchteter Inkubator | Heal Force | HF90/HF240 | |
| Image J Software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Bildverarbeitung und -analyse. |
| Inverses Mikroskop | Nanjing Jiangnan Novel Optics | XD-202 | |
| LB Agar Pulver | Sangon Biotech (Shanghai) | A507003 | |
| Lipo6000 Transfektionsreagenz | Beyotime | C0526 | |
| Nikon Ti-S2 Mikroskop | Nikon | Ti-S2 | |
| Opti-MEM reduziert Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Paraformaldehyd | Sinopharm Chemisches Reagenz | 80096618 | In PBS auflösen, um 4% Paraformaldehyd/PBS herzustellen. |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | HyClone | SV30010 | |
| SanPrep Säule DNA-Gel-Extraktionskit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518131 | |
| SanPrep Kolumne Plasmid Mini-Vorbereitungen Kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518191 | |
| TaKaRa | 2011A | ||
| T4-Polynukleotidkinase | TaKaRa | 2021A | |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemisches Reagenz | 30188928 | In PBS auflösen, um 0,25 % Triton X-100/PBS herzustellen. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemisches Reagenz | 30189328 | PBS auflösen, um 0,1 % Tween 20/PBS herzustellen. |
Referenzen
- Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
- Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases.<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
