Beobachtung der systolischen Funktion isolierter rechter Vorhöfe von Meerschweinchen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren zum Screening von Arzneimitteln, die die Myokardkontraktilität erhöhen, unter Verwendung isolierter rechter Vorhöfe von Meerschweinchen.

Zusammenfassung

Die häufige chronische Herzinsuffizienz (CHF) ist gekennzeichnet durch eine Beeinträchtigung der ventrikulären Füllung und/oder der Ejektionsfunktion, die zu einem unersättlichen Herzzeitvolumen und einer erhöhten Inzidenz führt. Die Abnahme der systolischen Funktion des Herzens ist ein Schlüsselfaktor in der Pathogenese der CHF. Die systolische Funktion ist einfach das Auffüllen des linken Ventrikels mit sauerstoffreichem Blut, gefolgt von der Pumpung des Blutes durch den Körper während eines Herzschlags. Ein schwaches Herz und die Unfähigkeit des linken Ventrikels, sich während des Herzschlags angemessen zusammenzuziehen, deuten auf eine schlechte systolische Funktion hin. Viele traditionelle Kräuter werden vorgeschlagen, um die systolische Funktion des Herzens bei Patienten zu stärken. Allerdings fehlen in der ethnischen Medizin noch stabile und effiziente experimentelle Methoden zum Screening von Verbindungen, die die Kontraktilität des Myokards verbessern. Hier wird am Beispiel von Digoxin ein systematisches und standardisiertes Protokoll für das Screening von Verbindungen zur Verbesserung der Myokardkontraktilität unter Verwendung isolierter rechter Vorhöfe von Meerschweinchen bereitgestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass Digoxin die Kontraktilität des rechten Vorhofs deutlich verbessern kann. Dieses systematische und standardisierte Protokoll soll als methodische Referenz für das Screening der Wirkstoffe von ethnischen Arzneimitteln bei der Behandlung von CHF dienen.

Einleitung

Herzinsuffizienz wird durch Myokardinfarkt, Myokardiopathie, hämodynamische Überlastung, Entzündungen und andere Ursachen für Myokardverletzungen verursacht, die die Anatomie und Aktivität des Myokards verändern und letztendlich zu einem Versagen des ventrikulären Pumpens oder der Füllung führen. Herzklopfen, Müdigkeit und Flüssigkeitsansammlungen sind die wichtigsten primären klinischen Symptome¹. CHF ist eine chronische Herzinsuffizienz, die im Laufe der Zeit aufrechterhalten, sich verschlechtern oder eine Dekompensation zeigen kann, und deren Inzidenz und Prävalenz mit dem Alter^{von 2} Jahren zunimmt. Die Abnahme der systolischen Funktion des Herzens ist ein Schlüsselfaktor für die Pathogenese von^{CHF 3}. Die derzeitige medizinische Behandlung der Krankheit besteht hauptsächlich aus der Verwendung von blutdrucksenkenden Arzneimitteln wie Angiotensin-Converting-Enzym-Inhibitoren, β-Adrenozeptoren (die die übermäßige Aktivierung des neurohormonellen Systems, nämlich des sympathischen Systems und des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems, hemmen) oder Diuretika (die Stauungen reduzieren)⁴. Die klinischen Anzeichen einer Herzinsuffizienz, die durch ein vermindertes Herzzeitvolumen und eine verminderte Herzreserve verursacht werden, werden in Studien, die die Auswirkungen dieser medikamentösen Behandlungen untersuchen, jedoch häufig nicht behandelt⁵.

Positive inotrope Medikamente sollen die Kontraktilität des Myokards erhöhen. Herzglykoside, Phosphodiesterasehemmer und β-adrenerge Rezeptoragonisten werden als positive inotrope Arzneimittel zur Behandlung von Herzinsuffizienz eingesetzt. Herzglykoside sind in erster Linie Digitalis-Derivate ; Ein Beispiel ist Digoxin, das am häufigsten verwendete Digitalis-Derivat , das aus Digitalis lanata (weißer Fingerhut) gewonnen ^wird6. Sie binden selektiv an Na⁺/K⁺-ATPase auf der Zellmembran, um die intrazelluläre Kalziumkonzentration zu erhöhen und so die Kontraktilität des Herzens und das Schlagvolumen zu erhöhen, ohne die Sauerstoffaufnahme zu erhöhen, wodurch die kardiale Effizienz verbessert^{wird 7}. Abgesehen von kardialen Glykosiden, erhöhen die meisten positiven inotropen Medikamente, wie Phosphodiesterase-Hemmer und β-adrenerge Rezeptoragonisten, die Herzfrequenz und den myokardialen Sauerstoffverbrauch, während sie die Kalziumbelastung in den Myokardzellen erhöhen, um die myokardiale Kontraktilität zu verbessern, was zu klinisch schweren Herzrhythmusstörungen und Hypotonie und damit zu einer erhöhten Mortalität führen kann⁸. Daher ist die klinische Anwendung dieser inotropen Arzneimittel begrenzt. Um Komplikationen zu vermeiden, die durch erhöhte intrazelluläre Kalziumspiegel verursacht werden, ist es notwendig, sicherere und hochwirksame inotrope Modulatoren für die Behandlung von CHF zu entwickeln (Abbildung 1).

In den letzten Jahrzehnten wurden viele Studien durchgeführt, um Verbindungen zu generieren und zu analysieren, die die positiven inotropen Eigenschaften der kardialen Hämodynamik unterstützen können. Viele traditionelle chinesische Arzneimittel (TCM), wie z.B. Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth., Apocynum venetum L. und Sophora alopecuroides L. können unter anderem die Kontraktilität des Myokards verbessern ^9,10,11. Studien haben gezeigt, dass die TCM und ihre aktiven Monomere im Vergleich zu inotropen Arzneimitteln durch andere Mechanismen positive inotrope Effekte ausüben können. Zum Beispiel kann Liguzinediol, eine Form von Ligustrazin, die an C₂ und C₅ methyliert ist (ein Wirkstoff des Szechwaner Liebstöckel-Rhizoms), die die Kontraktilität isolierter Rattenherzen signifikant erhöht, indem sie die Calciumtransienten des sarkoplasmatischen Retikulums erhöht, ohne die Herzfrequenz zu erhöhen, weniger Nebenwirkungen haben und eine bessere Behandlung für^{CHF 12} sein. Darüber hinaus ist Matrin ein Alkaloid, das aus der TCM-Pflanze Sophora flavescens Ait gewonnen wird. Matrin kann die Hochregulierung der β 3-AR-Proteinexpression hemmen und die eNOS-Expression bei Herzinsuffizienz-Modellratten verringern, wodurch ihre myokardiale Kontraktilität verbessert^{wird 13}. In der ethnischen Medizin mangelt es jedoch an stabilen und effizienten experimentellen Methoden für das Screening von Verbindungen, die die Kontraktilität des Myokards verbessern können.

Es ist allgemein bekannt, dass Meerschweinchen im Vergleich zu anderen Nagetieren elektrophysiologische und kalziumarme Eigenschaften aufweisen, die denen des Menschen ähnlicher sind¹⁴. Einerseits ist das Elektrokardiogramm von Meerschweinchen dem des Menschen hinreichend ähnlich, und ihre Behandlung von Schlag zu Schlag mit Ca2⁺ ähnelt eher der menschlichen Physiologie als der von Ratten oder Mäusen^15,16. Auf der anderen Seite wurden Computermodelle von Kardiomyozyten von Meerschweinchen umfassend erforscht und umfassen wichtige zelluläre Subsysteme, einschließlich der Energetik und des Stoffwechsels reaktiver Sauerstoffspezies¹⁷. Daher werden isolierte rechte Vorhöfe von Meerschweinchen häufig verwendet, um Verbindungen zu untersuchen, die die Kontraktilität des Myokards erhöhen. Hier nehmen wir Digoxin als Beispiel, um ein systematisches und standardisiertes Protokoll für das Screening von Verbindungen bereitzustellen, die die Myokardkontraktilität verbessern, indem wir isolierte rechte Vorhöfe von Meerschweinchen verwenden. Daher bietet diese Arbeit eine methodische Referenz für das Screening der Wirkstoffe ethnischer Arzneimittel bei der Behandlung von CHF.

Protokoll

Das Versuchsprotokoll wurde in Übereinstimmung mit den Anforderungen des Ausschusses für die Verwendung von Labortieren und des institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung an der Ningxia Medical University durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden männliche Dunkin-Hartley-Meerschweinchen mit einem Gewicht von 300-450 g verwendet. Die Wirkung von Digoxin auf die Kontraktilität wurde in isolierten rechten Vorhöfen der Meerschweinchen beobachtet (Abbildung 2).

1. Oxygenierungsvorbereitung für die isolierten rechten Vorhöfe von Meerschweinchen

1. Bereiten Sie die experimentellen Instrumente vor, einschließlich eines biologischen Signalerfassungs- und -verarbeitungssystems, eines JH-2-Muskelkraftwandlers, eines Magnus-Bades, eines L-förmigen Beatmungshakens, einer dicken Schere, einer Petrischale, Paraffin usw. (siehe Materialtabelle).
2. Bereiten Sie 1.000 ml Krebs-Henseleit-Lösung (K-H-Lösung) vor, indem Sie 7,02 g NaCl (120,0 mM), 2,10 g NaHCO₃ (25,0 mM), 0,30 g KCl (4,0 mM), 0,07 g MgSO₄ (0,6 mM), 0,07 g NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,28 g CaCl₂ (2,5 mM) und 1,98 g Glukose (11,0 mM) in 1.000 ml doppelt destilliertes Wasser geben. und spülen Sie das Magnus-Bad zwei- bis dreimal aus (siehe Tabelle 1 und Materialtabelle).
   HINWEIS: Halten Sie die Temperatur der K-H-Lösung bei 37 °C ± 1 °C.
3. Bereiten Sie 100 ml kalziumarme K-H-Lösung vor, indem Sie 0,70 g NaCl (120,0 mM), 0,21 g NaHCO₃ (25,0 mM), 0,03 g KCl (4,0 mM), 0,01 g MgSO₄ (0,6 mM), 0,01 g NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,01 g CaCl₂ (0,8 mM) und 0,20 g Glukose (11,0 mM) in 100 mL doppelt destilliertes Wasser geben (siehe Tabelle 1 und Materialtabelle).
4. Geben Sie ca. 20 mL der 37 °C K-H-Lösung in das Operationsbecken (siehe Materialtabelle).
5. Verteilen Sie 5 mm dickes Paraffin auf dem Boden der Petrischale und füllen Sie die Petrischale mit der 37 °C K-H-Lösung (siehe Materialtabelle).
6. Montieren Sie den L-förmigen Belüftungshaken am Ende des Latexschlauchs an der Blase, legen Sie ihn in die Petrischale und stellen Sie ihn auf 1-2 Blasen/s ein (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Passen Sie die Blasen langsam an; Wenn die Aktion zu schnell erfolgt, kann der Sauerstoff bald ausgehen.

2. Zubereitung von isolierten rechten Vorhöfen aus Meerschweinchen

1. Wiegen Sie Meerschweinchen auf einer Waage (siehe Materialtabelle).
2. Induzieren Sie die Anästhesie mit einer Induktionsbox mit 5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff und wechseln Sie dann zur Aufrechterhaltung zu einem Nasenkonus mit 1,5 % bis 3 % Isofluran (siehe Materialtabelle).
3. Schneiden Sie die Halsschlagader mit einer groben Schere ab und leiten Sie die Blutung ein, bevor Sie sie auf einen Teller legen. Öffnen Sie dann mit einer Schere den Thorax (beginnend mit dem Xiphoid-Prozess und trennen Sie die Seiten vollständig, um das Herz freizulegen) und ziehen Sie das Perikard ab.
   1. Halten Sie das Herz mit der linken Hand hoch, schneiden Sie mit der rechten Hand das Herz aus der Wurzel der Aorta ab und legen Sie es schnell mit der K-H-Lösung in das Operationsbecken. Zum Schluss drücken Sie mit der Hand vorsichtig zwei- bis dreimal auf die Herzkammer, drücken das ventrikuläre Blut aus und legen das Herz in die Petrischale.
      HINWEIS: Die Aktion sollte zügig sein und in 2-5 Minuten abgeschlossen sein, und die Temperatur muss auf 35 °C geregelt werden. Die Temperatur der K-H-Lösung muss auf 37 °C geregelt werden.
4. Befestigen Sie die Spitze des Herzens mit einer Nadel an der paraffinbeschichteten Petrischale und geben Sie dabei Sauerstoff (60 Blasen/min).
5. Identifizieren Sie den rechten Vorhof.
   HINWEIS: Bei Meerschweinchen sind die Vorhöfe auf ihrer ventralen Oberfläche durch die Lungenarterie und dorsal durch die Aorta getrennt. Sowohl der linke als auch der rechte Vorhof sind wie ein "umgekehrtes Dreieck" mit den Ventrikeln verbunden, und der rechte Vorhof ist etwas kleiner als der linke Vorhof und hat unebene Ränder. Das Myokard des rechten Ventrikels ist dünn, und das obere Ende des Kollapses ist der rechte Vorhof; der linke Ventrikel ist stärker aufgebläht und die Verteilung der Herzkranzgefäße ist reichhaltig¹⁸ (Abbildung 3).
6. Heben Sie den Rand des rechten Vorhofs vorsichtig mit einer ophthalmischen Zange an und schneiden Sie entlang des atrioventrikulären Übergangs (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Vermeiden Sie eine Beschädigung des Sinusknotens und versuchen Sie, näher am Ventrikel zu schneiden, während Sie entlang des atrioventrikulären Übergangs schneiden. In diesem Schritt ist eine automatische rhythmische Kontraktion des rechten Vorhofs zu beobachten.
7. Verwenden Sie 4-0 chirurgische Nähte (siehe Materialtabelle), um den oberen bzw. unteren Teil des rechten Vorhofs (beide Enden der "diagonalen Linie") zu ligieren, wobei ein Ende mit einer Schlaufe und das andere Ende mit einem langen Fadenende links von einem langen Fadenende versehen ist, das ebenfalls geschlungen ist.
   HINWEIS: Versuchen Sie, so wenig Gewebe wie möglich zu ligieren, wenn Sie beide Enden der "diagonalen Linie" der Vorhöfe ligieren.

3. Messung und Aufzeichnung der systolischen Funktion von isolierten rechten Vorhöfen von Meerschweinchen

1. Schalten Sie den Computer ein und rufen Sie das biologische Signalerfassungs- und -verarbeitungssystem auf (siehe Materialtabelle). Passen Sie die Verstärkung (50 mV), die Zeitkonstante (DC), den Filter (20 Hz) und die Abtastgeschwindigkeit (1,00 s/div) an, nachdem Sie den Verbindungskanal (erster Kanal, Spannung) bestimmt haben.
2. Hängen Sie ein Ende der Probe mit der Petrischale und dem Sauerstoff neben dem Magnus-Bad an den L-förmigen Belüftungshaken. Hängen Sie das andere Ende der Probe an den Muskelkraftaufnehmer JH-2 (siehe Materialtabelle).
3. Beobachten Sie die atriale systolische Kurve, stellen Sie die Vorspannung auf 0,5-1,0 g ein und warten Sie, bis sie sich stabilisiert hat (ca. 30 min).
   HINWEIS: Wechseln Sie die K-H-Lösung alle 20 Minuten. Wenn normal, nehmen Sie die beobachtete Kurve als Standard und markieren Sie "normal". Wenn der Bildschirm etwas schnell gescannt wird, muss dies verlangsamt werden.
4. Verabreichen Sie 0,2 ml kalziumarme K-H-Lösung und beobachten Sie 5 Minuten lang, bis die Kurve nicht mehr abnimmt.
5. Verabreichen Sie 0,2 ml 5 % Digoxin (siehe Materialtabelle), beobachten Sie 5 Minuten lang, waschen Sie es dreimal und kehren Sie dann zum Normalzustand zurück.
   HINWEIS: Markieren Sie die Administration. Wenn der Effekt offensichtlich ist, scannen Sie den Bildschirm schneller. Wenn die Kurve nicht mehr ansteigt, dh wenn die Kontraktionsamplitude nicht mehr zunimmt, waschen Sie dreimal schnell; Andernfalls kommt es zu Herzrhythmusstörungen, die sich auf die Ergebnisse der nachfolgenden Arzneimittelexperimente auswirken.
6. Sammeln Sie die Daten, und speichern Sie sie auf einer Diskette.

Ergebnisse

Eine Abnahme der myokardialen Kontraktilität führt zu einem unzureichenden Herzzeitvolumen, was zu CHF führt (Abbildung 1). Dieses Protokoll ermöglichte die Aufzeichnung der Auswirkungen verschiedener Medikamente auf die systolische Funktion isolierter rechter Vorhöfe von Meerschweinchen und dann das schnelle Screening von Verbindungen aus ethnischen Medikamenten, die die Myokardkontraktilität erhöhen. Nach dem schrittweisen Anschließen des rechten Vorhofs, des Muskelkraftwandlers JH-2 und d...

Diskussion

Die normale rhythmische Aktivität des Herzens erfordert eine geeignete physikalische und chemische Umgebung, ebenso wie die Aktivität isolierter rechter Vorhöfe. Isolierte rechte Vorhöfe sind von der Innervation des Körpers isoliert und der direkte Einfluss systemischer humoraler Faktoren, d.h. Veränderungen in der Aktivität der rechten Vorhöfe beim Wechsel der Medikamente, denen sie ausgesetzt sind, können beobachtet werden. Die grundlegenden Ursachen für die bioelektrische Aktivität in...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4-0 Chirurgische Naht	Yangzhou  Fuda  Medizin  Geräte Co.,
5% Digoxin (löslich in Dimethylsulfoxid)	TCI Shanghai	D1828	CAS: 20830-75-5; Reinheit: >96,0%
BL-420N biologisches Signalerfassungs- und Verarbeitungssystem	Chengdu Tai Meng Software Co., Ltd	1700142S
CaCl2	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24110	CAS: 10043-52-4; Reinheit: 96%
Glukose	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S11022	CAS: 50-99-7; Reinheit: 99%
Isofluran	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22-16
JH-2 Muskelkraftwandler	Institut für Luft- und Raumfahrt Medizintechnik, Peking, China
KCl	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24120	CAS: 7447-40-7; Reinheit: 99,5%
Magnusbad	Shanghai Future Experimental Equipment Co., Ltd	L046525
MgSO4	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24253	CAS: 7487-88-9; Reinheit: 98%
NaCl	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24119	CAS: 7647-14-5; Reinheit: 99,5%
NaH2PO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24161	CAS: 7558-80-7; Reinheit: 99%
NaHCO3	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24153	CAS: 144-55-8; Reinheit: 99,8%
Operationsbecken	Guangzhou Telekuan Medical Instrument Co., Ltd		305 mm x 230 mm
Ophthalmische Pinzette	Suzhou  Shuanglu  Medizin  Instrument Co.,
Ophthalmologische Operationsschere	Suzhou  Shuanglu  Medizin  Instrument Co.,
Paraffin	Leica Biosystems
Petrischale	Corning	430167	100 mm x 20 mm
Nagetier-Anästhesiegerät	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd		ABS-Typ (Einkanal)
Waage	Shanghai Yueping Scientific Instrument Co., Ltd	YP1002
Chirurgische Platte	Zhengzhou  Ketai  Experimentieren  Ausrüstung Co.,		21 cm x 31 cm
Gewebeschere	Suzhou  Shuanglu  Medizin  Instrument Co.,  GmbH	SL0023