Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Summary

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Abstract

Die Verwendung von In-vivo - und In-vitro-Darmmodellen zur Untersuchung der Pathophysiologie entzündlicher Darmerkrankungen, zum pharmakologischen Screening potenziell nützlicher Substanzen und zur Toxizitätsuntersuchung potenziell schädlicher Lebensmittelbestandteile hat zugenommen. Relevant ist, dass derzeit ein Bedarf an der Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen besteht, um Tiermodelle zu ersetzen. Hier wird ein Protokoll für ein grundlegendes, dreidimensionales (3D) intestinales Äquivalentmodell aus "gesundem Gewebe" unter Verwendung von Zelllinien vorgestellt, das sowohl experimentelle Einfachheit (standardisiertes und leicht wiederholbares System) als auch physiologische Komplexität (Caco-2-Enterozyten mit einer unterstützenden Immunkomponente von U937-Monozyten und L929-Fibroblasten) bietet. Das Protokoll beinhaltet auch eine Paraffineinbettung zur lichtmikroskopischen Auswertung von fixierten Darmäquivalenten, wodurch der Vorteil der Analyse mehrerer visueller Parameter in einem einzigen Experiment geboten wird. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte (H&E)-gefärbte Schnitte, die zeigen, dass die Caco-2-Säulenzellen eine dichte und regelmäßige Monoschicht in Kontrollbehandlungen bilden, werden verwendet, um die Wirksamkeit des Modells als experimentelles System zu überprüfen. Zu den Parametern, die aus den Schnitten analysiert wurden, gehören eine reduzierte Monoschichtdicke sowie eine Störung und Ablösung von der zugrunde liegenden Matrix (H&E), eine verminderte Expression von Tight-Junction-Proteinen, wie sie aus der Occludin-Färbung (statistisch quantifizierbar) hervorgeht, und die Immunaktivierung migrierender U937-Zellen, wie sie durch die Cluster-of-Differentiation 14 (CD14)-Färbung und die CD11b-bezogene Differenzierung in Makrophagen nachgewiesen wird. Wie die Verwendung von Lipopolysaccharid zur Simulation einer Darmentzündung zeigt, sind zusätzliche Parameter, die gemessen werden können, eine erhöhte Schleimfärbung und Zytokinexpression (z. B. Midkin), die vor der Fixierung aus dem Medium extrahiert werden können. Das grundlegende dreidimensionale (3D) Darmschleimhautmodell und die fixierten Schnitte können für Studien zum Entzündungsstatus und zur Barriereintegrität empfohlen werden, wobei die Möglichkeit besteht, mehrere visuell quantifizierbare Parameter zu analysieren.

Introduction

Die intestinale Epithelbarriere, eine eine Zelle dicke innere Auskleidung, die verschiedene Arten von Epithelzellen enthält, stellt die erste physikalische Abwehrbarriere oder Schnittstelle zwischen dem äußeren und dem inneren Milieu des Körpers dar ^1,2. Enterozyten vom Säulentyp stellen die am häufigsten vorkommende Art von Epithelzellen dar. Diese sind für die Aufrechterhaltung der Integrität der epithelialen Barriere durch Wechselwirkungen zwischen mehreren Barrierekomponenten, einschließlich Tight Junctions (TJs), verantwortlich und spielen eine wichtige Rolle bei der Straffung der Barriere ^1,3. Die TJ-Struktur besteht aus intrazellulären Plaqueproteinen wie Zonula occludens (ZO) und Cingulin, die mit Transmembranproteinen zusammenarbeiten, einschließlich Occludinen, Claudinen und junktionalen Adhäsionsmolekülen (JAMs), die eine reißverschlussartige Struktur bilden, die die benachbarten Zellen fest miteinander verbindet ^3,4. Die Transmembranproteine regulieren die passive parazelluläre Diffusion kleiner Verbindungen und schließen toxische große Moleküle aus.

Potenziell toxische Lebensmittelverbindungen und Lebensmittelkontaminanten stimulieren die Produktion von entzündlichen Zytokinen, die die epitheliale Permeabilität stören, Immunzellen aktivieren und chronische Entzündungen des Darmgewebes verursachen ^5,6,7. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass verschiedene antioxidative und entzündungshemmende Phytochemikalien die inflammatorische Zytokinexpression reduzieren und die Integrität der intestinalen TJ-Barriere durch die Wiederherstellung der TJ-Proteinexpression und -assemblierung verbessern ^4,6,8. Daher hat die Regulierung der Integrität der Epithelbarriere sowohl durch nützliche als auch durch schädliche Verbindungen zu einer Zunahme der Verwendung von In-vivo- und In-vitro-Modellen geführt, die darauf abzielen, die Darmbarriere für pharmazeutische Screening- und Toxizitätsstudien nachzuahmen. Dies ist besonders relevant angesichts des zunehmenden Interesses am Verständnis der Pathophysiologie von Darmerkrankungen (CED), nekrotisierender Enterokolitis und Krebs, die in experimentellen Modellen simuliert werden können ^8,9,10.

Gefragt ist die Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen, um das Ziel der "3R" im Tierversuch zu erreichen. Dazu gehören Ersatzalternativen zur Verwendung von Tieren, die Verringerung der Anzahl der verwendeten Tiere und die Verfeinerung der Anwendung von Methoden zur Linderung von Not 11,12,13. Darüber hinaus sind die zugrundeliegenden molekularen, zellulären und physiologischen Mechanismen zwischen menschlichen und murinen Modellen (Nagetiere sind die am weitesten verbreitete Spezies) unterschiedlich, was zu einer Kontroverse über die Wirksamkeit der murinen Modelle als Prädiktoren für menschliche Reaktionen führt^12,13. Zu den zahlreichen Vorteilen von In-vitro-Modellen humaner Zelllinien gehören zielbeschränkte Experimente, direkte Beobachtung und kontinuierliche Analyse¹³.

Einzelzell-Monoschichten in zweidimensionalen (2D) Kulturen haben als leistungsfähige Modelle gedient. Diese können jedoch die physiologische Komplexität menschlicher Gewebe nicht exakt wiedergeben ^8,13,14. Infolgedessen werden 3D-Kultursysteme mit immer besseren Verbesserungen entwickelt, um die physiologische Komplexität sowohl von gesundem als auch von erkranktem Darmgewebe als Risikobewertungs-Toolboxen der nächsten Generation zu rekapitulieren ^13,14. Zu diesen Modellen gehören 3D-Transwell-Gerüste mit verschiedenen Zelllinien, Organoidkulturen und mikrofluidischen Geräten (Intestine-on-Chip), die sowohl Zelllinien als auch Organoide (sowohl aus gesundem als auch aus erkranktem Gewebe) verwenden8,13,14.

Das in der vorliegenden Studie vorgestellte 3D-Protokoll für "gesundes Gewebe" basierte auf der Suche nach einem Gleichgewicht zwischen physiologischer Komplexität und experimenteller Einfachheit¹³. Das Modell ist repräsentativ für ein 3D-Transwell-Gerüst, das aus drei Zelllinien besteht (Enterozyten [die Goldstandard-Caco-2-Linie des Kolon-Adenokarzinoms] mit einer unterstützenden Immunkomponente [U937-Monozyten und L929-Fibroblasten]), die ein standardisiertes und leicht wiederholbares System darstellen, das für das vorläufige Screening von Nahrungsmolekülen von Interesse auf die Integrität der Darmepithelbarriere und die Immunantwort anwendbar ist. Das Protokoll umfasst Paraffineinbettungen zur lichtmikroskopischen Beurteilung der Integrität der Epithelbarriere unter Verwendung von fixierten Darmäquivalenten. Der Vorteil des vorliegenden Ansatzes besteht darin, dass zahlreiche Abschnitte des eingebetteten Gewebes in einem einzigen Experiment für mehrere Parameter gefärbt werden können.

Protocol

1. Erstellung des grundlegenden 3D-rekonstruierten Darmschleimhautmodells

HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Alle Schritte des Verfahrens, bei denen der Zellinkubator verwendet wird, bedeuten, dass die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert werden (sofern im Protokoll nicht anders angegeben_).

1. Vorherige Präparation der im Darmmodellsystem verwendeten Zelllinien
   1. L929-Maus-Fibroblastenzellen in einer Konzentration von 5 x 10⁵ in 5 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das 2 mM L-Glutamin, 10 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken) enthält, in einem F25-Kolben aussäen und 4 Tage vor dem Aufbau der Darmmodelle in einem Inkubator kultivieren. Nach 48 h wird das Medium mit einer Pipette entfernt. Dann fügen Sie frisches Medium (5 ml) hinzu und inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang.
      HINWEIS: Die Zellen müssen vor der Verwendung zu 80 % konfluierend sein.
   2. Caco-2-Zellen (Konzentration von 2 x 10⁶) in 10 mL DMEM-Medium (mit 10 % FBS und 1 % Pen-Streptokokken) in einen F75-Zellkolben geben und 4 Tage vor dem Aufbau des Darmschleimhautmodells in einem Inkubator kultivieren. Nach 48 h wird das Medium wie in Schritt 1.1.1 beschrieben gewechselt und 48 h lang bis zu einer Konfluenz von 80 % inkubiert.
      HINWEIS: Die Zellen müssen sich in einer aktiven proliferierenden Phase befinden: nicht zu spärlich oder zu konfluierend. Empfohlen wird eine 50-60%ige Konfluenz. Die Zellen dürfen nicht am Tag vor der Herstellung des Modells ausgesät werden, da dies die Proliferationsfähigkeit der Zellen verlangsamen könnte, die sich dann im rekonstruierten 3D-Modell nicht perfekt verankern würden.
   3. U937-Zellen, die in Suspension (Konzentration von 1 x 10⁶) wachsen, zu 10 ml Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (enthält 2 mM L-Glutamin, 1 % Natriumpyruvat, 10 % FBS und 1 % Pen-Streptokokken) in einem F75-Zellkolben 2 Tage vor dem Modellaufbau hinzufügen und 48 Stunden lang in einen Inkubator geben.
2. Vorbereitung der Transwell Co-Kulturplatteneinsätze
   1. Wählen Sie eine 24-Well-Platte mit Einsätzen mit 0,4-μm-Filtern.
      HINWEIS: Der 0,4-μm-Filter ist eine Standardwahl für Arzneimitteltransportstudien. Die Filtergrößen von 3 μm und 8 μm werden nicht empfohlen, um mögliche Verluste der kollageneingebetteten Zellen zu verhindern.
   2. Befeuchten Sie die Transwell-Filter (im Folgenden als Membraneinsätze bezeichnet) mit einer Pipette mit 500 μl Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) unterhalb und oberhalb des Filtereinsatzes.
   3. Schließen Sie die Multi-Well-Platte und legen Sie sie für mindestens 2 h in einen Inkubator.
      HINWEIS: Die Membraneinsätze können bis zu 24 h im HBSS verbleiben. Dieser Vorgang kann am Tag vor der Erstellung des Modells durchgeführt werden. Es ist wichtig, dass die Membraneinsätze vollständig hydratisiert sind und der Filter nicht austrocknet, da dies die richtige Haftung der Probe erschweren könnte.
   4. Nehmen Sie die Platten nach 2 h (oder 24 h) aus dem Inkubator. Saugen Sie das HBSS vorsichtig von oberhalb und unterhalb der Membraneinsätze mit einer Pipette an und lassen Sie es 10 Minuten trocknen.
3. Präparation der zellfreien Kollagen Lamina propria des grundlegenden 3D-Darmmodellsystems (TAG 1)
   1. Bereiten Sie eine zellfreie Kollagenlösung in einem sterilen 50-ml-Röhrchen auf Eis vor, die die folgenden Komponenten in DMEM enthält: 10 % fötales Kälberserum (FBS), 200 mM L-Glutamin, 1 % Natriumbicarbonat und 1,35 mg/ml Typ-1-Rattenschwanzkollagen.
      HINWEIS: Alle diese Komponenten müssen auf Eis aufbewahrt und mit gekühlten Pipettenspitzen in das DMEM gegeben werden. Das Typ-1-Rattenschwanzkollagen muss zuletzt hinzugefügt werden, da dieses mit steigender Temperatur und steigendem pH-Wert polymerisiert. Die Menge der hergestellten zellfreien Kollagenlösung hängt von der Anzahl der erforderlichen Darmäquivalente ab.
   2. Geben Sie 250 μl der Lösung in jeden Platteneinsatz (über dem Membranfilter) für die Anzahl der ausgewählten Darmäquivalente und legen Sie den Deckel auf die Multi-Well-Platte. Lassen Sie die Kollagenlösung bei Raumtemperatur (RT) unter der Laminar-Flow-Haube polymerisieren.
      HINWEIS: Neben dem Übergang in eine festere Phase zeigt sich die Polymerisation auch in einem Farbwechsel von Gelb zu Rosa. Die Polymerisation ist in der Regel innerhalb von 10-15 Minuten abgeschlossen.
4. Präparation, Zellzählung und Zugabe von Fibroblasten- (L929) und Monozytenzellen (U937) zum Modellsystem (DAY 1)
   1. Entnehmen Sie die L929-Zellkultur (Schritt 1.1.1) aus dem Inkubator. Saugen Sie das Medium mit einer Vakuumpumpe an, ersetzen Sie es durch 5 ml sterile Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS; ohne Ca und Mg) und spülen Sie die Zellen.
   2. Saugen Sie das PBS mit einer Vakuumpumpe an. Fügen Sie 2 ml einer vorgefertigten Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA in PBS) hinzu und legen Sie sie für 3-5 Minuten in einen Inkubator.
   3. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop (z. B. Eclipse Ts2, Nikon), um festzustellen, ob sich die Zellen von der Adhäsionsfläche lösen. Wenn dies der Fall ist, fügen Sie sofort 2 ml DMEM (mit 10 % FBS) hinzu, um die Trypsinreaktion zu blockieren, und spülen Sie die Zellen.
   4. Die Zelllösung wird in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 645 x g zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe an.
      HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass das Pellet nicht gestört wird. Die Wirkung von DMEM wurde an den L929- und U937-Zellen getestet und es wurde nicht gezeigt, dass sie nachteilige Auswirkungen auf das Wachstum hat.
   5. Geben Sie 1 ml DMEM in das Pellet und suspendieren Sie die Zellen.
      HINWEIS: Die Zellen müssen homogen in der Lösung suspendiert sein.
   6. Entfernen Sie 20 μl der Zellen in DMEM und fügen Sie 20 μl Trypanblaulösung hinzu. Entnehmen Sie 20 μl der Mischung und bewerten Sie die Zelldichte mikroskopisch mit einer Zellzählkammer.
   7. Entfernen Sie die U937-Zellkultur (Schritt 1.1.3) aus dem Inkubator. Die Zelllösung wird bei 645 x g 5 min zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe an, um eine Störung des Pellets zu vermeiden.
   8. Suspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI. Achten Sie wie bei den L929-Zellen darauf, dass die Zellen homogen in der Lösung suspendiert sind.
   9. In ähnlicher Weise ist die Zelldichte wie in Schritt 1.4.6 beschrieben zu bestimmen.
   10. Bereiten Sie eine Kollagenlösung wie in Schritt 1.3.1 beschrieben vor.
       HINWEIS: Die Menge der herzustellenden Lösung muss 450 μl für jeden Einsatz (oder jedes Modell) berücksichtigen.
   11. Bereiten Sie eine DMEM-Lösung vor, die eine Anzahl von 50.000 L929-Zellen bzw. 15.000 U937-Zellen in einem Volumen von 50 μl für jedes zu konstruierende Darmäquivalentmodell enthält.
       HINWEIS: Die Anzahl der Zellen ist ein kritischer Faktor. Zu viele von beiden Zelltypen würden zu einer Lamina propria führen, die übermäßig mit Zellen gefüllt ist, die nicht ausreichend organisiert wären. Eine geringere Anzahl von Fibroblasten (die Kollagen produzieren) würde zu einer weniger kompakten Lamina propria führen, während zu wenige Monozyten die Immunantwort auf Reize behindern würden. Unter der Voraussetzung, dass die richtige Anzahl von Zellen in jedem 50-μl-Aliquot vorhanden ist, kann ein Gesamtvolumen von 600 μl für die 12 Filtereinsätze in jeder 24-Well-Platte hergestellt werden.
   12. In Schritt 1.4.10 werden jeweils 50 μl Aliquot mit den Zellen zu 450 μl Kollagenlösung gegeben. Gründlich mischen.
   13. Übertragen Sie die vorbeschichtete zellfreie Kollagenlamina propria für jedes Modell mit 500 μl der kollagenhaltigen Zelllösung.
       HINWEIS: Es ist wichtig, die Volumina schnell zu jedem Einsatz hinzuzufügen, und daher ist es ratsam, die Anzahl der rekonstruierten Darmschleimhautmodelle auf 12 oder weniger gleichzeitig zu begrenzen.
   14. Schließen Sie die Platte und legen Sie sie für 2 Stunden in einen Inkubator, damit die Lösung aushärten kann.
5. Präparation, Zellzählung und Zugabe von epithelialen Caco-2-Zellen zum Darmmodell (TAG 1)
   1. Entnehmen Sie die Caco-2-Zellkultur (Schritt 1.1.2) aus dem Inkubator. Wiederholen Sie die Verfahren aus Schritt 1.4.1 mit 10 ml PBS zum Vorspülen. Dann 5 ml einer vorgefertigten Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA in Ca- und Mg-freiem PBS) zugeben und für 5-8 Minuten in einen Inkubator geben.
   2. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.3 (aber mit 5 ml DMEM, um die Trypsinreaktion zu blockieren) bis 1.4.6, um die Zellen mit der Zellzählkammer zu zählen.
   3. Bereiten Sie eine DMEM-Lösung vor, die eine Anzahl von 150.000 Caco-2-Zellen in 50 μl enthält.
      HINWEIS: Die Anzahl der verwendeten Zellen ist ein kritischer Punkt. Bei mehr als 150.000 Zellen kann es zu einer kompakten, desorganisierten Epithelschicht kommen, während bei zu wenig (weniger als 100.000) die Zellen Schwierigkeiten haben zu wachsen und die Basalmembran nicht ausreichend bedecken, wodurch eine diskontinuierliche Darmepithelschicht entsteht. Stellen Sie sicher, dass die Zellen effektiv aufgehängt sind. Die Spitze einer 200-μl-Pipette kann verwendet werden, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Da 12 Modelle gleichzeitig konstruiert werden können, kann eine 600-μl-Zelllösung hergestellt werden.
   4. Nach Ablauf der in Schritt 1.4.14 geforderten 2 Stunden werden 50 μl in DMEM suspendierte Caco-2-Zellen in die Mitte jeder Basalmembran gegeben. Schließen Sie den Deckel der Multiwell-Platte.
   5. Unter der sterilen Laminar-Flow-Haube 10 Minuten inkubieren. Dann für 30 Minuten in den Inkubator geben.
   6. Bereiten Sie eine DMEM-Lösung vor, die 10 % FBS und 1 % Pen/Streptokokken enthält.
      HINWEIS: Bereiten Sie eine ausreichende Lösung vor, um ein Volumen von 1 ml pro Modell zu verwenden.
   7. Fügen Sie 500 μl des Mediums über dem rekonstruierten Modell und 500 μl unter dem Filter hinzu.
      HINWEIS: Beim Hinzufügen des Mediums über dem Filter ist Vorsicht geboten, um ein Ablösen oder Belasten der Zellen zu vermeiden.
   8. Schließen Sie das Multi-Well-Plattensystem und legen Sie es in den Inkubator.
6. Modellvorbereitung/-bildung und -nutzung (TAG 2 bis TAG 6)
   1. TAG 2: Entfernen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette sowohl oberhalb des rekonstruierten Modells als auch unterhalb des Filters. Ersetzen Sie sie durch frische 500 μl frisches DMEM (10 % FBS und 1 % Pen/Streptokokken) über bzw. unter dem Filter.
   2. TAG 3: Wiederholen Sie den Vorgang wie oben in Schritt 1.6.1.
   3. TAG 4: Wiederholen Sie den Vorgang wie oben in Schritt 1.6.1.
      HINWEIS: Bei diesem Darmmodell handelt es sich um ein statisches Zellmodell. Um die Freisetzung von Molekülen und das Wachstum und die Stimulation von Zellen zu begünstigen, ist es daher sehr wichtig, dass das Medium jeden Tag gewechselt wird.
   4. TAG 5: Zu diesem Zeitpunkt ist das Modell vollständig ausgebildet/entwickelt. Verwenden Sie diese Modelle für weitere Studien.
      HINWEIS: Die beste Zeit für die Verwendung des Modells liegt bei 5 Tagen. Obwohl die Zellen über einen längeren Zeitraum in einem Inkubator gehalten werden können, ist die Wahrscheinlichkeit umso größer, dass die Epithelzellen unkontrolliert wachsen, je mehr Zeit vergeht, was zu einer unorganisierten und kompakten Schicht führt, die schwer zu verwenden ist.
   5. Nach 5 Tagen inkubieren Sie die Modelle entweder mit toxischen (Gluten oder Lipopolysaccharid [LPS]) oder nützlichen Komponenten (Polyphenole), die von Interesse sind. Fügen Sie diese dem oberen Teil des rekonstruierten Modells hinzu, das im DMEM-Medium aufgehängt ist.
      ANMERKUNG: Die geeignete Konzentration jeder interessierenden Komponente muss berechnet und in einem DMEM-Medium suspendiert werden. Unbehandelte Kontrollen, die nur DMEM-Medium enthalten, müssen für den Vergleich mit den experimentellen Modellen eingerichtet werden.
   6. Inkubieren Sie die Kontroll- und Versuchsmodelle für 24 Stunden in einem Inkubator.
   7. TAG 6: Entfernen Sie das Medium oberhalb und unterhalb des Filters mit einer Pipette.
      HINWEIS: Das Medium kann für nachfolgende ELISA-Tests (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) aufbewahrt werden, um die Freisetzung von entzündlichen Zytokinen zu messen. Dazu muss das Medium in sterile Fläschchen gegeben und zur weiteren Analyse bei -20°C gelagert werden.

2. Paraffineinbettung der rekonstruierten Darmschleimhautmodelle

HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss unter einem chemischen Abzug durchgeführt werden. Jeder Schritt und die jeweilige Zeiteinteilung müssen strikt eingehalten werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, alle Reagenzien im Voraus vorzubereiten.

1. Stellen Sie die Paraffinmaschine auf 58 °C ein, damit sie einsatzbereit ist.
2. Übertragen Sie die Membraneinsätze mit einer Zange in eine sterile 24-Well-Platte in saubere Wells.
3. 500 μl 37% gepuffertes Formalin in PBS über dem Filter und 1 ml unter dem Filter zugeben. Schließen Sie den Deckel und lassen Sie ihn 2 h bei RT unter dem chemischen Abzug.
   HINWEIS: Alternativ kann 4% gepuffertes Formalin bei RT für 1 h verwendet werden.
4. Entfernen Sie das Formalin und fügen Sie die HBSS-Lösung sowohl über als auch unter dem Filter hinzu. Entfernen Sie dann das HBSS.
5. Lösen Sie die Lamina propria vom Membraneinsatz.
   HINWEIS: Die Zellen der Darmschleimhaut lösen sich in der Regel sehr leicht vom Membraneinsatz, da sie nicht an diesem befestigt sind. Darüber hinaus bleiben die beiden Probenkompartimente (apikal und basal) befestigt, wodurch die 3D-Struktur erhalten bleibt. Wenn sie sich aus irgendeinem Grund nicht leicht ablösen lassen, ist es wichtig, eine sterile Einweg-Skalpellklinge zu verwenden, um die Darmschleimhaut aus dem Membraneinsatz zu entfernen. Die Membraneinlage kann geschnitten werden, wodurch sie sich vom Kunststoff löst. Achten Sie darauf, die Probe niemals mit dem Skalpell zu berühren. Das Motiv für die Entfernung des Membraneinsatzes aus den kollageneingebetteten Zellen ist, dass sich dieser Filter in den nachfolgenden Fixierungs- oder Paraffineinbettungsphasen ablösen kann, was Vergleiche zwischen Darmschleimhautmodellen unverhältnismäßig macht. Darüber hinaus haben die Membraneinsätze innerhalb des eingebetteten Abschnitts eine unterschiedliche Konsistenz, die das Schneiden beeinträchtigen kann.
6. Stellen Sie die 100-ml-Bechergläser unter den chemischen Abzug, wobei jeder Becher korrekt beschriftet ist, um ein rekonstruiertes Darmschleimhaut-Modellsystem zu enthalten, das untersucht wird. Geben Sie 25 ml 35% ETOH in jedes Becherglas und fügen Sie dann die rekonstruierte Darmschleimhaut hinzu. 10 Min. inkubieren.
7. Ersetzen Sie das 35%ige Ethanol durch 25 ml 50%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
8. Ersetzen Sie das 50%ige Ethanol durch 25 ml 70%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
9. Ersetzen Sie das 70%ige Ethanol durch 25 ml 80%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
10. Ersetzen Sie das 80%ige Ethanol durch 25 ml 95%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
11. Ersetzen Sie das 95%ige Ethanol durch 25 ml 100%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
12. Ersetzen Sie das 100%ige Ethanol durch einen weiteren 25-ml-Wechsel von 100%igem Ethanol und inkubieren Sie es für 10 Minuten.
13. Stellen Sie 100-ml-Bechergläser unter den Abzug, die jeweils korrekt beschriftet sind, um ein zu untersuchendes Modell zu enthalten. Fügen Sie 50 ml Xylol oder ein histologisches Reinigungsmittel für 10-20 Minuten hinzu.
    HINWEIS: Histo-Clear (histologisches Clearingmittel) wird empfohlen, da das Mittel die Klarheit und Lebendigkeit acidophiler Färbungen verbessert. Die Clearingzeit kann von einer rekonstruierten Darmschleimhautprobe zur anderen variieren und muss alle 2-3 min auf Transparenz im Erscheinungsbild überprüft werden.
14. Sobald die Proben durchsichtig sind, legen Sie sie in einen Gewebekassettenhalter aus Metall, der dann in der beheizten Maschine für 45 Minuten in flüssiges Paraffin getaucht wird.
15. Wechseln Sie das Paraffin und lassen Sie die Proben weitere 45 Minuten in der beheizten Maschine.
16. Entfernen Sie den Taschentuchkassettenhalter und legen Sie ihn zum Abkühlen auf Eis. Wenn sich die gekühlten Probenblöcke vom Metallhalter lösen, können diese bei Raumtemperatur weiter gekühlt werden.
17. Bewahren Sie die Blöcke bei RT auf.
    HINWEIS: Wenn das Ziel darin besteht, Abschnitte sofort vorzubereiten, können die Blöcke bei 4 ° C platziert werden, damit sie bei der Verwendung gut gekühlt sind.
18. Schneiden Sie 4-μm-Schnitte mit einem Mikrotom.
19. Legen Sie die geschnittenen Abschnitte auf Objektträger und trocknen Sie sie 24 h lang in einem Ofen bei 37 ° C.
20. Die Folien sind gebrauchsfertig. Lagern Sie sie bei RT, bis Sie entweder eine H&E-histologische Färbung oder eine immunhistochemische Reaktionsfärbung (Antigen-Antikörper-Typ) durchführen.
    1. Für die immunhistochemische Färbung wählen Sie die interessierenden Antikörper aus (entweder für die Untersuchung von TJ-Proteinen wie Occludin oder für die Aktivierung, Migration und Differenzierung von Monozyten) und weisen Sie die Expression (durch Färbung) mit kommerziellen Kits nach.
    2. In ähnlicher Weise ist der Schleim mit dem Alcianblau und dem Periodsäure-Schiff (PAS) Färbekit zu messen.
    3. Quantifizieren Sie die gefärbten TJ-Proteine von Interesse, wie z. B. Occludin, indem Sie den Prozentsatz der positiven Pixel auf mikroskopischen Aufnahmen berechnen, die mit dem Mikroskop aufgenommen wurden.
    4. Analysieren Sie Bilder der Zellen mit einer Bildanalysesoftware (z. B. ImageJ2-Software [Wayne Rasband, Version 2.9.0/1.53t]).
       1. Um die Analyse der Pixel durchzuführen, verarbeiten Sie die digitalen Bilder auf 300 Pixel/Zoll und konvertieren Sie sie in 8 Bit. Verarbeiten Sie dann die binären Bilder mit dem Color Deconvolution-Plugin , um die Färbung des interessierenden Proteins zu analysieren, in diesem Fall die permanente rote Färbung von Occludin.
       2. Speichern Sie das ausgewählte Bild als TIFF-Datei und unterziehen Sie es einer "Bereinigung", um Artefakte mit einem Grafikeditor (z. B. Adobe PhotoshopCC [Version 20.0.4]) zu entfernen.
       3. Messen Sie anschließend alle relevanten Felder mit der Anwendung Particle of ImageJ2 analysieren und geben Sie die Daten als Anzahl der Pixel an.
          HINWEIS: Jedes Experiment sollte in dreifacher Ausführung durchgeführt werden, wobei für jedes Replikat drei interne Replikatfelder analysiert werden. Zur Quantifizierung des Schleims kann das gleiche Prinzip der Messung der Pixel auf die Bilder angewendet werden, die von den violett-magenta-gefärbten neutralen Mucinen bzw. hellblau gefärbten sauren Schleimen aufgenommen wurden.

Results

Der erste wichtige Aspekt besteht darin, die Akzeptanz der basischen 3D-Darmäquivalent-Schleimhaut für experimentelle Zwecke zu bestimmen. Dies wird mit der am weitesten verbreiteten Färbung in Histologie- und Histopathologielabors durchgeführt, nämlich Hämatoxylin (färbt Kernmaterial tiefblau-violett) und Eosin (färbt zytoplasmatisches Material in verschiedenen Rosatönen). Die H&E-Färbung wird zunächst an einer unbehandelten Kontrolle durchgeführt, die unter den gleichen Bedingungen und im gleichen Zeitrahmen wie die ex...

Discussion

Das hier vorgestellte grundlegende rekonstruierte Modellsystem der Darmschleimhaut (Abbildung 6) kombiniert physiologische Komplexität (physiologisch relevantere 3D-Zellkulturen, die eine Caco-2-Monoschicht mit einem EZM-reichen Lamina-propria-Träger mit Fibroblasten und Monozyten enthalten) mit experimenteller Einfachheit (Verwendung kommerzieller humaner Zelllinien zur Herstellung eines standardisierten und leicht wiederholbaren Systems)¹³. Daher wird dieses Modells...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue/PAS-Trikot	ScyTek Laboratories, Inc.	APS-1, APS-2	Kit für immunhistochemische Färbungen
Blaue Trypan-Lösung	Thermo Fisher	15250061	Zellzählanalysen
Caco-2-kolorektale Adenokarzinomzellen	ATCC	ATCC HTB-37	Zelllinie
Citro-Histo-Clear Limonen-basiert	Histoline-Labore	R0050CITRO	Reagenz für Paraffin-Einbettung
Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium (DMEM)	GIBCO	11965092	Zellkolturreagenz
Einbettungszentrum	Histoline-Labore	TEC2900	Instrument zur Paraffineinbettung
Fetales Rinderserum (FBS)	GIBCO	A5256701	Zellkolturreagenz
Hanks' Ausgewogene Salzlösung (HBSS)	GIBCO	12350039	Zellkolturreagenz
Menschliches Midkin-ELISA-Set	Kohäsionsbiowissenschaften	CEK1270	Kit ELISA
Invertiertes Mikroskop	Eclipse Ts2, Nikon	MFA34100	Mikroskop
L929-Mausfibroblasten	ATCC	ATCC ®-CCL1	Zelllinie
LC3-II	Novus Biologicals	NB910-40752SuperNovusPack	Antikörper
L-Glutamin	GIBCO	A2916801	Zellkolturreagenz
Occludin	Novus Biologicals	NBP1-87402	Antikörper
Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 ° C– 58 ° C	Histoline-Labore	R0040 PLUS	Instrument zur Paraffineinbettung
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070063	Zellkolturreagenz
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070063	Zellkolturreagenz
Rattenschwanz-Kollagen Typ I	GIBCO	A1048301	Zellkolturreagenz
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)	GIBCO	21870076	Zellkolturreagenz
Natriumpyruvat	GIBCO	11360070	Zellkolturreagenz
Thermo Fisher Countess II FL Automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher	TF-CACC2FL	Zellzählinstrument
Transwell	Co-Star Corning	3413	Plastik für Zellkolturen
Trypsin	GIBCO	15090046	Zellkolturreagenz
U937, eine promonozytische, humane myeloide Leukämie-Zelllinie,	ATCC	ATCC CRL-1593.2	Zelllinie
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent rot) Fleckenset	ScyTek Laboratories, Inc.	AMH080	Kit für immunhistochemische Färbungen