Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogele

Die synthetische Biologie integriert verschiedene Ingenieurdisziplinen, um biologisch basierte Teile, Geräte und Systeme zu entwerfen und zu konstruieren, die Funktionen ausführen können, die in der Natur nicht vorkommen. Die meisten Ansätze der synthetischen Biologie sind immer noch an lebende Zellen gebunden. Im Gegensatz dazu ermöglichen zellfreie Systeme der synthetischen Biologie ein noch nie dagewesenes Maß an Kontrolle und Freiheit beim Design, was eine erhöhte Flexibilität und eine verkürzte Zeit für die Entwicklung biologischer Systeme ermöglicht und gleichzeitig viele der Einschränkungen herkömmlicher zellbasierter Genexpressionsmethoden beseitigt ^1,2,3. CFPS wird in einer zunehmenden Anzahl von Anwendungen in zahlreichen Disziplinen eingesetzt, darunter die Konstruktion künstlicher Zellen, das Prototyping genetischer Schaltkreise, die Entwicklung von Biosensoren und die Herstellung von Metaboliten ^4,5,6. CFPS ist auch besonders nützlich für die Herstellung rekombinanter Proteine, die in lebenden Zellen nicht ohne weiteres exprimiert werden können, wie z. B. aggregationsanfällige Proteine, Transmembranproteine und toxische Proteine ^6,7,8.

CFPS wird in der Regel in flüssigen Reaktionen durchgeführt. Dies kann jedoch ihren Einsatz in einigen Situationen einschränken, da jede flüssigkeitszellfreie Vorrichtung in einem Reaktionsgefäß enthalten sein muss. Der Grundgedanke für die Entwicklung der hier vorgestellten Methoden bestand darin, robuste Protokolle für die Einbettung zellfreier Geräte der synthetischen Biologie in Hydrogele bereitzustellen, nicht als Proteinproduktionsplattform an sich, sondern um die Verwendung von Hydrogelen als physisches Chassis für den Einsatz zellfreier Geräte außerhalb des Labors zu ermöglichen. Die Verwendung von Hydrogelen als CFPS-Chassis hat mehrere Vorteile. Hydrogele sind polymere Materialien, die trotz eines hohen Wassergehalts (manchmal über 98%) feste Eigenschaften^besitzen 9,10,11. Sie werden als Pasten, Gleitmittel und Klebstoffe verwendet und sind in so unterschiedlichen Produkten wie Kontaktlinsen, Wundauflagen, Marineklebebändern, Bodenverbesserungsmitteln und Babywindeln enthalten 9,11,12,13,14. Hydrogele werden auch aktiv als Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten untersucht 9,15,16,17. Hydrogele können auch biokompatibel und biologisch abbaubar sein und einige eigene Reizreaktionen besitzen 9,18,19,20. Ziel ist es daher, eine Synergie zwischen molekularbiologischer Funktionalität und Materialwissenschaft zu schaffen. Zu diesem Zweck wurden Anstrengungen unternommen, die zellfreie synthetische Biologie mit einer Reihe von Materialien zu integrieren, darunter Kollagen, Laponit, Polyacrylamid, Fibrin, PEG-Peptid und Agarose 11,21,22 sowie Oberflächen aus Glas, Papier und Stoff zu beschichten ^11,23,24 mit CFPS-Geräten. Die hier vorgestellten Protokolle demonstrieren zwei Methoden zur Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogel-Matrizen im Makromaßstab (d. h. >1 mm), wobei Agarose als Beispielmaterial verwendet wird. Agarose wurde aufgrund ihrer hohen Wasseraufnahmefähigkeit, ihrer kontrollierten Selbstgelierungseigenschaften und ihrer einstellbaren mechanischen Eigenschaften ausgewählt 11,24,25,26. Agarose unterstützt auch funktionelle CFPS, ist billiger als viele andere Hydrogel-Alternativen und biologisch abbaubar, was sie zu einer attraktiven Wahl als experimentelles Modellsystem macht. Diese Methoden haben sich jedoch bereits als geeignet für die Einbettung von CFPS in eine Reihe alternativer Hydrogele erwiesen¹¹. Unter Berücksichtigung des breiten Anwendungsspektrums von Hydrogelen und der Funktionalität von CFPS können die hier vorgestellten Methoden eine Grundlage bieten, auf der Forscher biologisch verbesserte Hydrogelmaterialien entwickeln können, die für ihre Zwecke geeignet sind.

In früheren Studien wurden Mikrogelsysteme mit einem Größenbereich von 1 μm bis 400 μm verwendet, um CFPS in Hydrogelen durchzuführen, die in den Reaktionspuffer 23,27,28,29,30,31 getaucht sind. Die Anforderung, Hydrogele in CFPS-Reaktionspuffer einzutauchen, schränkt jedoch die Möglichkeiten für ihren Einsatz als eigenständige Materialien ein. Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen CFPS-Reaktionen innerhalb von Hydrogelen, ohne dass die Gele in Reaktionspuffer getaucht werden müssen. Zweitens ermöglicht die Verwendung von makroskaligen Gelen (zwischen 2 mm und 10 mm Größe) die Untersuchung der physikalischen Wechselwirkung zwischen Hydrogelen und zellfreier Genexpression. Zum Beispiel ist es mit dieser Technik möglich, zu untersuchen, wie die Hydrogelmatrix die CFPS-Reaktionen¹¹ beeinflusst und wie CFPS-Reaktionen die Hydrogelmatrix³¹ beeinflussen können. Größere Abmessungen von Hydrogelen ermöglichen auch die Entwicklung neuartiger, bioprogrammierbarer Materialien³². Schließlich besteht durch die Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogele auch eine potenzielle Reduzierung des Bedarfs an Kunststoff-Reaktionsgefäßen. Für den Einsatz von zellfreien Sensoren hat dies klare Vorteile gegenüber Geräten, die auf Kunststoffware angewiesen sind. Zusammenfassend bietet die Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogele mehrere Vorteile für den Einsatz zellfreier Geräte außerhalb des Labors.

Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, die Durchführung von CFPS-Reaktionen innerhalb von Hydrogel-Matrizen zu ermöglichen. Es werden zwei verschiedene Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinproduktionsreaktionen in makroskalige Hydrogelmaterialien demonstriert (Abbildung 1). Bei Methode A werden CFPS-Komponenten in lyophilisierte Agarose-Hydrogele eingebracht, um ein aktives System zu bilden. Bei Methode B wird geschmolzene Agarose mit CFPS-Reaktionskomponenten vermischt, um ein vollständiges CFPS-Hydrogelsystem zu bilden, das dann lyophilisiert und bis zur Verwendung gelagert wird. Diese Systeme können mit einem Volumen Wasser oder Puffer und Analyt rehydriert werden, um die Reaktion zu starten.

In dieser Studie werden Escherichia coli-Zelllysat-basierte Systeme verwendet. Dies sind einige der beliebtesten experimentellen CFPS-Systeme, da die Herstellung von E. coli-Zelllysaten einfach und kostengünstig ist und hohe Proteinausbeuten erzielt . Das Zelllysat wird mit den makromolekularen Komponenten ergänzt, die für die Transkription und Translation erforderlich sind, einschließlich Ribosomen, tRNAs, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sowie Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren. Insbesondere demonstriert diese Arbeit die Produktion von eGFP und mCherry in Agarose-Hydrogelen unter Verwendung von E. coli-Zelllysaten und überwacht das Auftreten von Fluoreszenz mit einem Plattenleser und konfokaler Mikroskopie . Repräsentative Ergebnisse für den Mikrotiterplattenleser sind in Whitfield et ^al.31 zu sehen, und die zugrunde liegenden Daten sind öffentlich zugänglich³³. Darüber hinaus wird die Expression fluoreszierender Proteine in den Gelen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie bestätigt. Die beiden Protokolle, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, ermöglichen den Zusammenbau und die Lagerung von CFPS-basierten genetischen Geräten in Materia mit dem Ziel, eine geeignete physikalische Umgebung für die Verteilung zellfreier Genschaltkreise in einer Weise zu schaffen, die den Feldeinsatz unterstützt.

1. Zelllysatpuffer und Medienvorbereitung

1. Herstellung von 2x YT+P Agar und Medium
   1. Bereiten Sie 2x YT+P-Agar vor, indem Sie 16 g/L Trypton, 10 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K 2 HPO 4, 22mL/L 1 M KH₂PO₄ und 15 g/L Agar abmessen. Für die 2x YT+P Brühe die vorherige Zusammensetzung befolgen, aber den Agar weglassen.
   2. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren der 2x YT+P.
2. Vorbereitung des S30A-Puffers
   1. Bereiten Sie den S30A-Puffer mit 5,88 g/L Mg-Glutamat, 12,195 g/L K-Glutamat und 25 ml/L 2 M Tris vor, eingestellt auf pH 7,7 mit Essigsäure.
   2. Lagern Sie den S30A-Puffer bis zu 1 Woche bei 4 °C.
3. Vorbereitung des S30B-Puffers
   1. Bereiten Sie den S30B-Puffer mit 5,88 g/L Mg-Glutamat und 12,195 g/L K-Glutamat vor, eingestellt auf pH 8,2 mit 2 M Tris.
   2. Lagern Sie den S30B-Puffer bis zu 1 Woche bei 4 °C.

2. Vorbereitung des Zelllysats (4-Tage-Protokoll)

1. Tag 1
   1. Gießen Sie die 2x YT+P in Agarplatten, die mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt sind.
   2. E. coli aus −80 °C Glycerin-Stamm streifen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
2. Tag 2
   1. Eine einzelne Kolonie von der 2x YT+P-Platte in 400 ml 2x YT+P-Bouillon (ergänzt mit Ampicillin) in einem 1-Liter-Kolben mit Schallblech inokuliert.
   2. 24 h bei 37 °C bei 220 U/min schütteln.
3. Tag 3
   1. Messung und Aufzeichnung der OD₆₀₀ der 24-h-Kulturen; Das Wachstum ist bei einem OD₆₀₀ von 3-4 ausreichend.
      HINWEIS: Nehmen Sie ein 1 ml Aliquot Bakterienkultur und führen Sie eine serielle Verdünnung mit Medium (2x YT+P Brühe) durch, bevor Sie den OD₆₀₀ nm messen. Berücksichtigen Sie den Verdünnungseffekt bei der Berechnung des OD₆₀₀.
   2. Die Kultur gleichmäßig zwischen vorgekühlten 500-ml-Zentrifugenflaschen umfüllen.
   3. Bei 4.500 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.
   4. Während des Zentrifugierens wird die S30A-Puffervorbereitung abgeschlossen, indem 2 ml/l 1 M DTT zum zuvor vorbereiteten S30A-Puffer hinzugefügt werden, gemischt und der Puffer auf Eis aufbewahrt wird.
   5. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 ml S30A-Puffer.
   6. Ziehen Sie die Flaschen kräftig vor, bis das gesamte Pellet vollständig aufgelöst ist, und halten Sie die Zellen so weit wie möglich auf Eis.
   7. Bei 4.500 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5 bis einschließlich 2.3.7.
   9. Geben Sie 40 ml S30A-Puffer in jede Zentrifugenflasche, resuspendieren Sie die Pellets und füllen Sie sie in vorgewogene 50-ml-Zentrifugenröhrchen um.
   10. Bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand durch Dekantieren und entfernen Sie den verbleibenden Überstand durch Pipette, wobei Sie ihn so weit wie möglich auf Eis lassen.
   11. Wiegen Sie die Zentrifugenröhrchen erneut, zeichnen Sie die neue Masse auf und berechnen Sie die Masse der Pellets.
   12. Pellets werden in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei −80 °C gelagert.
4. Tag 4
   1. Die Pellets auf Eis auftauen.
   2. Pro 1 g Pellet Folgendes hinzufügen: 1,2 ml S30A-Puffer (DTT vor Gebrauch hinzugefügt), 275 μl Proteaseinhibitor (8 mM Stamm) und 25 μl Lysozym (10 mg/ml Stamm).
   3. Wirbeln Sie kräftig vor, bis die Pellets vollständig aufgelöst sind und keine Klumpen mehr verbleiben, und halten Sie sie so weit wie möglich auf Eis.
   4. Beschallen Sie die Zellsuspensionen in 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 120 W, 20 kHz, 30 % Amplitude und 20 s/40 s Ein-/Aus-Impulsen für 5 Minuten Beschallung.
   5. Bei 4.000 x g für 1 h bei 4 °C zentrifugieren, um die Zelltrümmer zu pelletieren.
   6. Den Überstand in frische 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
   7. Röhrchen bei 37 °C bei 220 U/min 80 min inkubieren.
   8. Bereiten Sie Dialysematerialien vor, indem Sie 1 ml/l 1 M DTT in den S30B-Puffer geben. Mischen Sie und geben Sie 900 ml in ein steriles 1-Liter-Becherglas. Fügen Sie einen Magnetrührer hinzu und halten Sie ihn bei 4 °C.
   9. Nach der Abflussreaktion wird der Zellextrakt aus Schritt 2.4.7 in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
   10. Verfestigen Sie den pelletfreien Überstand auf Eis in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
   11. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen des produzierten Zellextrakts und hydratisieren Sie die erforderliche Anzahl von 10K MWCO-Dialysekassetten, indem Sie sie 2 Minuten lang in S30B eintauchen.
   12. Befüllen Sie die Kassetten über eine Spritze mit bis zu 3 ml Extrakt. Dialysieren Sie bis zu drei Kassetten pro 1-Liter-Becherglas unter Rühren bei 4 °C für 3 h.
   13. Nach Abschluss der Dialyse, die den Extrakt klärt, wird der Extrakt in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Bei 20.000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
   14. Verfestigen Sie den geklärten Extrakt in einem frischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und wirbeln Sie kurz vor, um ihn zu mischen.
   15. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Extrakts mit einem Fluorometer.
   16. Verdünnen Sie den Extrakt auf eine Konzentration von 44,5 mg/ml mit vorgekühltem_ddH2O.
   17. Aliquot in 200 μl Aliquots auftragen, in flüssigem Stickstoff schockfrosten und bei −80 °C lagern.

3. Herstellung lyophilisierter Hydrogele (Methode A)

1. Wiegen Sie 0,75 g Agarose, fügen Sie ddH2Ozu einem Volumen von 100 ml hinzu und erhitzen Sie sie in 30 s Stößen bei hohen Temperaturen, um geschmolzene Agarosebrühe zu erzeugen.
2. Mit einer Pipette 50 μl geschmolzene Agarose in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben und das Gel 20-30 Minuten lang polymerisieren lassen (die Polymerisation erfolgt schneller, wenn die Gele in einen Kühlschrank umgefüllt werden).
3. Die Mikrozentrifugenröhrchen, die die polymerisierten Gele enthalten, werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
4. Entfernen Sie den Deckel der Zentrifugenröhrchen, decken Sie die Öffnungen der Zentrifugenröhrchen mit Wachsfolie ab und stechen Sie die Folie mehrmals mit einer Nadel oder Pipettenspitze ein.
5. Die Mikrozentrifugenröhrchen mit den polymerisierten Gelen für 1-2 h in eine Lagerung bei −80 °C überführen.
6. Die Zentrifugenröhrchen aus der Lagerung bei −80 °C zurückgewinnen und in einen Gefriertrockner geben, um sicherzustellen, dass die Röhrchen vollständig trocken sind.
7. Schalten Sie den Gefriertrockner mit folgenden Einstellungen ein: Temperatur: −20 °C, Druck: 0,1 mbar.
8. Lassen Sie das Gel über Nacht gefriertrocknen.
9. Holen Sie die Gele aus dem Gefriertrockner und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei −80 °C.
   HINWEIS: Gele können gefriergetrocknet bis zu 1 Jahr gelagert werden.

4. Vorbereitung des 14-fachen Energielösungsvorrats

1. Kombinieren Sie alle Reaktionskomponenten (Tabelle 1) in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis, um eine 14-fache Energielösung herzustellen.
2. Aliquotieren Sie die 14x-Energielösung in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bei −80 °C (es können Aliquots mit kleineren Volumina verwendet werden).
   HINWEIS: Die 14x-Energielösung kann mehrere Monate bei −80 °C gelagert werden, wenn ein wiederholtes Einfrieren der Röhrchen vermieden wird.

5. Vorbereitung der 4x Aminosäurebrühe

1. Tauen Sie alle 20 Aminosäurekomponenten eines RTS-Aminosäure-Sampler-Kits auf Eis auf. Wirbeln Sie die Aminosäuren vor, um sicherzustellen, dass sie vollständig aufgelöst sind.
2. In einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen werden alle 20 Aminosäuren vermischt und 12 ml steriler ddH2O-Vortex hinzugefügt, bis die Lösung klar wird und nur einen leichten Hauch von weißer Färbung aufweist.
3. Aliquotieren Sie die 4x Aminosäuren in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (500 μL Aliquots).
4. Die Aliquots der 4-fachen Aminosäurelösung in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei −80 °C lagern.

6. Zellfreie Pufferkalibrierung

HINWEIS: Der CFPS-Puffer, der für die Hydrogelreaktionen verwendet wurde, wurde für optimale DTT-, Mg-Glutamat- und K-Glutamat-Konzentrationen gemäß dem Protokoll von Banks et al.34 kalibriert, das von Sun et ^al.35 modifiziert wurde. Die Zusammensetzungen der Kalibrierreaktionen wurden mit der Methode der Versuchsplanung (DOE) ausgewählt, wobei sieben Faktorstufen für K-Glutamat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-Glutamat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) und DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) JMP Pro 15 wurde verwendet, um ein benutzerdefiniertes DOE-Design zu generieren (Tabelle 2) und die Analyse durchzuführen, um die optimalen Faktorkonzentrationen zu bestimmen.

1. Gewinnen Sie den zellfreien Extrakt aus der Lagerung bei −80 °C und tauen Sie ihn auf Eis auf.
2. Tauen Sie die 4x Aminosäuren, 14x Energielösung, 40% PEG-8000, Plasmid-DNA, 3 M K-Glutamat, 100 mM Mg-Glutamat und 100 mM DTT-Vorräte auf Eis auf.
3. Erstellen Sie einen Kalibrierungs-Mastermix, indem Sie 12,5 μl der 4-fachen Aminosäuren, 3,57 μl der 14-fachen Energielösung, 2,5 μl 40 % PEG-8000, 3 μg Plasmid-DNA und 10 μl zellfreien Extrakt (44,5 mg/ml) kombinieren und bis zu 35 μl pro Reaktion mit ddH2_{O herstellen}.
4. Verteilen Sie die 35 μl Mastermix in die Vertiefungen einer schwarzen 384-Well-Mikrotiterplatte.
5. Fügen Sie gemäß dem DOE-Design das entsprechende Volumen an Mg-Glutamat, K-Glutamat und DTT zu jeder Reaktion hinzu, zusammen mit_ddH2O, um jede Reaktion auf bis zu 50 μl zu erhöhen.
6. Übertragen Sie die Mikrotiterplatte zur Fluoreszenzdetektion und -analyse auf einen Plattenleser mit den beschriebenen Plattenleseeinstellungen (für mCherry): Anregung: 587 nm, Emission: 610 nm, Wellenlängenbandbreite: 12 nm, Optik: oben, Temperatur: 37 °C, wobei die Fluoreszenzmesswerte alle 5 Minuten für 4 h Gesamtlesezeit erfasst werden. Inkubieren Sie die Platten durch Schütteln auf einer gepulsten Einstellung bei 60 U/min.
7. Laden Sie die Ergebnisse in das JMP-DOE-Design hoch und generieren Sie ein Vorhersageprofil, um die optimalen Konzentrationsniveaus für K-Glutamat, Mg-Glutamat und DTT basierend auf den gewünschten Antwortvariablen zu bestimmen. In diesem Fall waren die maximale Fluoreszenz und die Reaktionsgeschwindigkeit die Antwortvariablen.
8. Kombinieren Sie die Reagenzien wie in Tabelle 3 gezeigt, um den 2X CFPS-Puffer zu erstellen
9. Aliquotieren und bei −80 °C lagern

7. CFPS in rehydrierten lyophilisierten Hydrogelen (Methode A)

ANMERKUNG: Die in den CFPS-Reaktionen verwendeten Plasmide wurden unter Verwendung von Komponenten aus dem modularen EcoFlex-Toolkit für E. coli³⁶ hergestellt und in Whitfield et al. ^{beschrieben.11} Die mCherry und eGFP standen unter der Kontrolle des konstitutiven JM23100 Promotors. Diese Komponenten sind bei Addgene erhältlich.

1. Den zellfreien Extrakt aus der Lagerung bei −80 °C zurückgewinnen und ca. 20 Minuten auf Eis auftauen lassen.
2. Sammeln Sie den 2-fachen CFPS-Puffer und die Plasmid-DNA und tauen Sie sie auf Eis auf.
3. Sammeln Sie die gefriergetrockneten Hydrogele und lassen Sie sie 15 Minuten lang Raumtemperatur erreichen, indem Sie die Gele auf der Bank stehen lassen.
4. Übertragen Sie die Gele in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und schneiden Sie die Gele bei Bedarf mit einem Skalpell zu, damit sie in die Vertiefungen passen.
5. In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 10 μl zellfreien Extrakt mit 25 μl 2x CFPS-Puffer und 4 μg Plasmid-DNA mischen; bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl mit_ddH2Oherstellen, um die CFPS-Lösung herzustellen.
6. Pipettieren Sie die CFPS-Lösung auf die gefriergetrockneten Hydrogele.
7. Lassen Sie die Gele 5-10 Minuten bei Raumtemperatur im CFPS-System einweichen.
8. Übertragen Sie die Gele mit einem Spatel auf eine schwarze 384-Well-Mikrotiterplatte.
9. Übertragen Sie die Mikrotiterplatte zur Fluoreszenzdetektion und -analyse auf einen Plattenleser mit den in Schritt 6.6 beschriebenen Einstellungen des Plattenlesers. Repräsentative Ergebnisse liegen in früheren Studien^{vor 31,33}.

8. Zellfreie Proteinsynthese in einsetzbaren Hydrogelen (Methode B)

1. Zellfreier Extrakt aus der Lagerung bei −80 °C gewinnen und ca. 20 Minuten auf Eis auftauen.
2. Sammle die Plasmid-DNA und taue sie auf Eis auf.
3. In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis werden 10 μl zellfreier Extrakt mit 3 μg Plasmid-DNA und 25 μl 2x CFPS-Puffer kombiniert, was ein Gesamtvolumen von 37,5 μl ergibt.
4. 3 g Agarose abmessen und zu 100 ml ddH2O-Puffer hinzufügen, um3%ige Agarose zu erhalten.
5. Die 3%ige Agarose wird in 30 s Stößen bei hoher Leistung in der Mikrowelle erhitzt.
6. Pipettieren Sie 12,5 μl geschmolzene Agarose in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die eine CFPS-Mischung enthalten, bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl.
7. Lassen Sie die geschmolzene Agarose abkühlen, aber nicht polymerisieren, und lassen Sie die Agarose in einem auf 50 °C eingestellten Heizblock.
8. Kombinieren Sie die geschmolzene Agarose mit der CFPS-Lösung; Durch Pipettieren und Rühren mit der Spitze mischen und darauf achten, dass Sie sich schnell bewegen, um eine Gelpolymerisation zu vermeiden, bevor die CFPS-Lösung eingemischt werden kann.
9. Lassen Sie die Gele bei Raumtemperatur abkühlen und polymerisieren Sie ca. 2 min.
10. Die polymerisierte Agarose mit einem Spatel in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und in flüssigem Stickstoff schockgefrieren.
11. Die schockgefrorenen Hydrogele für 1 h bei −80 °C lagern.
12. Holen Sie die Gele aus der Lagerung zurück; Entfernen Sie die Deckel der Mikrozentrifugenröhrchen, bedecken Sie die Röhrchen mit Wachsfolie und stechen Sie die Folie durch, damit die Feuchtigkeit abtrocknen kann.
13. Schalten Sie den Gefriertrockner mit folgenden Einstellungen ein: Temperatur: −20 °C, Druck: 0,1 mbar, Gefriertrocknung für 18 h (über Nacht).
14. Lagern Sie die gefriergetrockneten CFPS-Geräte bis zur Verwendung bei −80 °C.
15. Die gefriergetrockneten CFPS-Geräte mit einem ungefähren Feuchtvolumen von 50 μL können mit 50 μL_ddH2Oohne überschüssige Flüssigkeit rehydriert werden. Die Rehydrierung dauert ca. 30 Minuten.
16. Übertragen Sie die Gele mit einem Spatel auf eine schwarze 384-Well-Mikrotiterplatte.
17. Übertragen Sie die Mikrotiterplatte zur Fluoreszenzdetektion und -analyse auf einen Plattenleser mit den in Schritt 6.6 beschriebenen Einstellungen des Plattenlesers. Repräsentative Ergebnisse sind in früheren Publikationen^{verfügbar 31,33}.

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogel-Matrizen, wobei Abbildung 1 eine schematische Übersicht der beiden Ansätze zeigt. Beide Methoden eignen sich für die Gefriertrocknung und Langzeitlagerung. Methode A ist aus zwei Gründen die am häufigsten verwendete Methodik. Erstens hat sich gezeigt, dass es das am besten anwendbare Verfahren für die Arbeit mit einer Reihe von Hydrogelmaterialien11 ist. Zweitens ermöglicht Methode A das parallele Testen genetischer Konstrukte. Methode B eignet sich besser für die Herstellung eines optimierten Systems und den Einsatz vor Ort. Beide Protokolle ermöglichen es, viele Proben auf einmal vorzubereiten, um die experimentelle Reproduzierbarkeit zu unterstützen. Diese Eigenschaft ist auch für die langfristige Entwicklung der Technologie nützlich, da gefriergetrocknete Geräte in trockenem Zustand versendet und bei Bedarf vor Ort rekonstituiert werden können.

Der im Protokoll und in Abbildung 1 beschriebene Ansatz kann für die Expression einzelner Genkonstrukte oder für die Co-Expression mehrerer Gene verwendet werden. Die in Abbildung 2 dargestellten Daten zeigen die Expression von eGFP und mCherry in einem 0,75%igen Agarose-Gel. Konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die Proteinexpression im gesamten Hydrogel, einschließlich der inneren Ebenen, homogen war. Insbesondere war die Proteinsynthese nicht auf die äußeren Ränder des Hydrogels beschränkt, und die interne Fluoreszenz war nicht das Ergebnis der Proteindiffusion. Um dies zu bestätigen, war es möglich, die Proteindiffusion von einem Hydrogel zum anderen zu beobachten, indem ein eGFP-exprimierendes Hydrogel in physischen Kontakt mit einem mCherry-exprimierenden Hydrogel gebracht wurde. Die Diffusionsrate zwischen den beiden war nicht ausreichend, um die ausgedehnte Lokalisierung von roter oder grüner Fluoreszenz im Inneren des Materials zu erklären. Dieses Experiment veranschaulicht auch einen entscheidenden Vorteil des Einsatzes zellfreier Bauelemente in Hydrogelen - die Bauelementfunktionalität kann räumlich in einer Weise organisiert werden, die bei flüssigzellfreien Reaktionen nicht möglich ist. Darüber hinaus ist für die Bildung von Gennetzwerken die gleichzeitige Synthese von mehr als einem Genprodukt erforderlich. Die in Abbildung 2 (untere Reihe) gezeigten Ergebnisse bestätigten die Co-Expression von mCherry und eGFP in Agarose. In dieser Arbeit wurden beide Proteine exprimiert, und es gab keine räumliche Konkurrenz zwischen den Proteinen. Auch hier zeigt eine Überlagerung des roten und grünen Wellenlängenbereichs die gleichmäßige räumliche Verteilung beider Proteine innerhalb des Hydrogels.

Tabelle 1: Die 14x Energielösungsaktien. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Design eines experimentellen Arrays zur Optimierung von DTT, Mg-Glutamat und K-Glutamat innerhalb der zellfreien Proteinsynthesereaktionen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Die 2x CFPS-Pufferkomponenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der beiden Protokolle. Bei der ersten Methode (Methode A, die in dieser Arbeit demonstriert wird) werden Hydrogelmaterialien zuerst hergestellt und dann ohne zellfreie Komponenten gefriergetrocknet (Schritt 1). Diese getrockneten Hydrogele können gelagert und bei Bedarf rekonstituiert werden (Schritt 2) mit dem richtigen Volumen der zellfreien Reaktion vor der Inkubation für die Proteinproduktion (Schritt 3). Die Variante des Verfahrens, Methode B, umfasst alle oder einige der zellfreien Reaktionskomponenten in der anfänglichen Hydrogelherstellung. Nach der Gefriertrocknung (Schritt 1) können die Hydrogele dann in Wasser allein oder in einem Puffer, der einen interessierenden Analyten enthält, rekonstituiert werden (Schritt 2). Die Proteinproduktion (Schritt 3) läuft wie bisher weiter. Ein drittes Verfahren, bei dem gefriergetrocknete zellfreie Komponenten mit Hydrogelpolymeren rekonstituiert werden, ist in Whitfield et al.11 beschrieben, hat aber bisher nur mit einer begrenzten Anzahl von Hydrogelen Anwendung gefunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Zellfreie Proteinsynthese von eGFP und mCherry in einem Hydrogel unter Verwendung von E. coli-Zelllysaten. Agarose-Gele (0,75 %) wurden ohne DNA-Template (oben) mit 4 μg eGFP- oder mCherry-Template (Mitte) oder mit 4 μg eGFP- und mCherry-Template (unten) hergestellt. Die Hydrogele wurden vor der konfokalen Mikroskopie in den roten und grünen Kanälen für 4 h inkubiert. Eine Überlagerung der beiden Kanäle wird ebenfalls angezeigt, und die Überlagerung enthält das DIC-Bild (Differential Interference Contrast). Hydrogele, die entweder eGFP- oder mCherry-Template enthielten, wurden separat hergestellt, aber in physischem Kontakt miteinander inkubiert. Der Durchmesser des Gels beträgt 6 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nichts.