Methodenartikel

Einzigartiger Ansatz zur Isolierung von Neutrophilen im Knochenmark von Ratten mit vergleichbarer Kapazität

3.2K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/65506

⸱

26. April 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan Provincial Pancreatitis Centre, West China Hospital, Sichuan University, 3West China-Liverpool Biomedical Research Centre, West China Hospital, Sichuan University, 4Cardiovascular Surgery Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Forschung skizziert zwei Techniken zur Isolierung reichlich neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) aus dem Knochenmark von Ratten. Eine Methode kombiniert ein kommerzielles Neutrophilen-Isolationskit mit einer Dichtegradientenzentrifugation, während die andere nur eine Dichtegradientenzentrifugation verwendet. Beide Ansätze liefern funktionelle NETs, die die von peripheren Blutneutrophilen übertreffen.

Zusammenfassung

Das Hauptziel dieser Forschung war es, einen zuverlässigen und effizienten Ansatz zur Isolierung von extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs) aus dem Knochenmark von Ratten zu entwickeln. Diese Bemühungen ergaben sich aus Einschränkungen im Zusammenhang mit der traditionellen Methode zur Extraktion von NETs aus peripherem Blut, hauptsächlich aufgrund des Mangels an verfügbaren Neutrophilen für die Isolierung. Die Studie ergab zwei unterschiedliche Methoden zur Gewinnung von Rattenneutrophilen aus dem Knochenmark: ein optimiertes einstufiges Verfahren, das zufriedenstellende Reinigungswerte ergab, und ein zeitintensiveres zweistufiges Verfahren, das eine verbesserte Reinigungseffizienz aufwies. Wichtig ist, dass beide Techniken eine beträchtliche Menge lebensfähiger Neutrophilen ergaben, die zwischen 50 und 100 Millionen pro Ratte lag. Diese Effizienz spiegelte die Ergebnisse wider, die bei der Isolierung von Neutrophilen sowohl aus menschlichen als auch aus murinen Quellen erzielt wurden. Bezeichnenderweise zeigten Neutrophile aus Rattenknochenmark vergleichbare Fähigkeiten zur Sekretion von NETs im Vergleich zu Neutrophilen, die aus peripherem Blut gewonnen wurden. Die knochenmarkbasierte Methode produzierte jedoch durchweg deutlich größere Mengen sowohl von Neutrophilen als auch von NETs. Dieser Ansatz zeigte das Potenzial, deutlich größere Mengen dieser zellulären Komponenten für weitere nachgelagerte Anwendungen zu gewinnen. Insbesondere diese isolierten NETs und Neutrophilen sind vielversprechend für eine Reihe von Anwendungen, die sich über Entzündungen, Infektionen und Autoimmunerkrankungen erstrecken.

Einleitung

Neutrophile stellen eine kritische Untergruppe von Leukozyten dar, die eine zentrale Rolle bei der angeborenen Immunantwort spielen. Sie zeichnen sich durch mehrlappige Kerne und Granula aus, die verschiedene Proteasen und antimikrobielle Peptide enthalten1. Neutrophile funktionieren hauptsächlich durch Degranulation, Phagozytose und die Bildung von NETs. Die Beobachtung von NETs wurde erstmals 1996 von Takei et al. während eines Experiments durchgeführt, bei dem Neutrophile mit Phorbolmyristatacetat (PMA) stimuliert wurden2. In der Folge wurde der Prozess der NET-Bildung 2004 von Brinkmann et al.3 als "NETosis" bezeichnet. Ihre Forschung beleuchtete die entscheidende Rolle von NETs bei neutrophilenvermittelten antimikrobiellen Reaktionen. NETs sind netzartige Strukturen, die aus Chromatin, Histonen und antimikrobiellen Proteinen bestehen, die als Reaktion auf infektiöse und entzündliche Reize von aktivierten Neutrophilen freigesetzt werden. NETs können eindringende Krankheitserreger immobilisieren und abtöten, indem sie sie einfangen und einer hohen Konzentration an antimikrobiellen Peptiden und Proteasen aussetzen 1,3. Darüber hinaus tragen NETs zur Beseitigung apoptotischer Zellen bei und sind an der Auflösung von Entzündungen beteiligt. Neuere Studien deuten auch darauf hin, dass eine übermäßige Bildung von NETs oder ein beeinträchtigter NET-Abbau zu Gewebeschäden, Autoimmunerkrankungen, Thrombogenese und beeinträchtigter Revaskularisierung führen kann 4,5,6,7,8,9,10.

Die pathogene Rolle von NETs bei unkontrollierter Fibrose nach Myokardinfarkt und der Bildung ventrikulärer Aneurysmen wurde durch die Ausbreitung der perivaskulären Fibrose nachgewiesen 4,11. Das Myokardinfarktmodell und die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark bei Mäusen sind beide gut etabliert. Polymorphkernige (PMN) Leukozyten, eine Art weißer Blutkörperchen, die im menschlichen Blut reichlich vorhanden sind, dienen als hervorragende Quelle für die Isolierung menschlicher Neutrophile. Diese Methode macht die Entnahme von Knochenmark überflüssig und erhöht so die Sicherheit und Effizienz.

NETs spielen auch eine Rolle bei Vorhofflimmern im Zusammenhang mit dem kardialen Umbau. Große Tiere wie Hunde und Schweine wurden jedoch verwendet, um Vorhofflimmern zu modellieren, da Mäusen ein Vorhof fehlt, der groß genug ist, um einen Wiedereintrittszyklus oder das AF-Modell zu etablieren, es sei denn, bestimmte Ionenkanäle oder Signalwege werden ausgeschaltet oder ausgeschaltet12. Während es möglich ist, Vorhofflimmern bei Ratten zu induzieren und Neutrophile aus dem peripheren Blut von Ratten zu isolieren, stießen die Forscher auf eine Einschränkung, bei der nur 2 x 105-5 x 105 Neutrophile aus peripherem Blut isoliert werden konnten (10 ml pro Ratte). Die Extraktion ausreichender NETs zu jedem Zeitpunkt erforderte etwa 10-25 Ratten (insgesamt 5 x 106 Neutrophile), was zu einem zeitaufwändigen, teuren und oft ertragsarmen Prozess führte13. In diesem Zusammenhang stellen Li He und Kollegen eine knochenmarkorientierte Strategie vor, um adäquate NETs von Rattenzu erhalten 14. In ihrem Artikel beschreiben sie umfassend die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Ratten und vergleichen die NET-Sekretionsfähigkeiten von peripheren und Knochenmark-Neutrophilen von Ratten. Die beiden beschriebenen Methoden dienen unterschiedlichen experimentellen Zielen, die beide zu ausreichenden Mengen an Neutrophilen im Knochenmark von Ratten führen und gleichzeitig die Anzahl der erforderlichen Ratten reduzieren. Die zweistufige Isolierungsmethode zeigte eine überlegene Neutrophilenreinigung, während sich die einstufige Methode bei akzeptablen Reinigungswerten als zeiteffizient erwies. Darüber hinaus verglichen die Forscher NETose und NET-Bildung zwischen Rattenknochenmark-Neutrophilen und ihren peripheren Gegenstücken und fanden die gleiche Wirksamkeit wie PMN. Diese Ergebnisse tragen wesentlich zu neutrophilenbezogenen Studien zu Vorhofflimmern bei und unterstreichen die Bedeutung der flexiblen Auswahl verschiedener Quellen für die Neutrophilenisolierung bei verschiedenen Versuchstieren mit unterschiedlichen Neutrophilenverteilungen.

Protokoll

Die Studie wurde im Rahmen einer Projektlizenz (Nr. 20211404A) durchgeführt, die vom Tierethikkomitee des West China Hospital, Sichuan University, in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Ethics Committee des West China Hospital, Sichuan University, für die Pflege und Verwendung von Tieren erteilt wurde. In Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien wurden die in dieser Studie verwendeten Ratten in einer kontrollierten Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, einer Temperatur von 22-24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50%-60% gehalten. Die Ratten erhielten ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Bei den in dieser Studie verwendeten Tieren handelte es sich um 6-8 Wochen alte männliche Ratten von Sprague Dawley (SD), die etwa 250 g wogen und frei von spezifischen Krankheitserregern waren. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Isolierung von Ratten-Neutrophilen

  1. Knochenmarkentnahme
    1. Legen Sie die Ratte zur Anästhesie in einen geeigneten Behälter (siehe Materialtabelle). Verabreichen Sie der Ratte 3% Isofluran, bis das Tier bewusstlos ist. Überprüfen Sie, ob auf ein Zehen- oder Schwanzklemmen nicht reagiert wird, um die Tiefe der Anästhesie sicherzustellen.
    2. Sobald die Ratte tief betäubt ist, führen Sie eine Zervixluxation durch, indem Sie die Ratte auf den Rücken legen und ihren Schwanz mit einer Hand halten, während Sie mit der anderen Hand den Kopf greifen. Verrenken Sie den Hals schnell und fest, indem Sie eine plötzliche und starke Aufwärtskraft auf den Schwanz ausüben und den Kopf nach unten ziehen, bis die Halswirbelsäule durchtrennt ist. Warten Sie auf die Bestätigung des Todes, wie z. B. Atemstillstand und fehlender Herzschlag, bevor Sie mit der Gewebeentnahme oder -entsorgung fortfahren.
    3. Tauchen Sie die Ratte in 75% Ethanol und lassen Sie sie einige Minuten ruhen, um das Fell und die Haut zu sterilisieren. Legen Sie die Ratte auf den Rücken und trennen Sie die unteren Gliedmaßen an der Hüfte ab, um den Oberschenkelkopf zu schützen. Verwenden Sie eine Präparierschere, um das Band am Sprunggelenk zu durchtrennen, und klappen Sie das Kniegelenk nach hinten, um den Oberschenkelknochen und das Schienbein freizulegen.
    4. Entfernen Sie mit Pinzetten und Scheren vorsichtig alle Muskeln, Sehnen und anderes Gewebe, das mit den Knochen verbunden ist. Spülen Sie die Knochen mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ab, um verbleibende Gewebereste und Blut zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal, für insgesamt drei Wäschen. Legen Sie die gereinigten Knochen in einen sterilen Behälter.
    5. Verwenden Sie eine 5- oder 10-ml-Spritze mit einer Nadel, um das Knochenmark durch beide Enden des Knochens zu stechen, um die Markmatrix zu lösen. Spülen Sie das Knochenmark mit 10-15 ml Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mit einer anderen Spritze aus, bis kein sichtbares Knochenmark mehr ausgespült werden kann.
    6. Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen bei 300 x g für 10 min bei 20 °C. Fügen Sie 5-10 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu (siehe Materialtabelle), um die Zellen zu resuspendieren, und inkubieren Sie sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie der Mischung das 4-fache Volumen von HBSS hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 x g für 5 min bei Raumtemperatur, entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und verwenden Sie das resultierende Pellet zur weiteren Verwendung.
  2. Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark
    1. Führen Sie für die zweistufige Methode die folgenden zusätzlichen Schritte aus:
      1. Isolieren Sie Knochenmarkzellen mit dem kommerzialisierten Ratten-Neutrophilen-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
      2. Bereiten Sie einen Dichtegradienten vor, indem Sie 2 ml 55 % Percoll-Reagenz (siehe Materialtabelle), 2 ml 65 % des Reagenzes, 2 ml 70 % Reagenz und 2 ml 80 % Reagenz in ein neues 15 ml-Zentrifugenröhrchen schichten. Das Röhrchen wird bei 800 x g für 40 min bei 20 °C zentrifugiert, wobei die Beschleunigung auf 5 und die Verzögerung auf 0 oder 1 eingestellt ist.
      3. Entnehmen Sie die 70%ige Gradientenschicht, einschließlich der Zellschichten an der Grenze zwischen 65%- und 70%igem Gradientenreagenz, mit einer sterilen Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 15 ml HBSS in das Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
    2. Führen Sie für die einstufige Methode die folgenden zusätzlichen Schritte aus:
      1. Setzen Sie Knochenmarkzellen den Gradienten aus, ohne das Ratten-Neutrophilen-Isolationskit zu verwenden.
      2. Sammeln Sie die 70%ige Gradientenschicht, einschließlich der Zellschichten an der Grenze zwischen 65% und 70% Gradient, mit einer sterilen Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Zellen mit HBSS. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
      3. Zählen Sie die isolierten Neutrophilen mit einem Hämozytometer und beurteilen Sie die Lebensfähigkeit mit Trypanblau-Färbung.
        HINWEIS: Das Protokoll kann je nach Anzahl der Ratten und der gewünschten Anzahl isolierter Neutrophiler geändert werden. Eine akzeptable Menge an Knochen wird von drei Ratten erhalten, wenn diese Methode zum ersten Mal in einer neuen Versuchsumgebung angewendet wird. Alle Eingriffe sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark sollte so schnell wie möglich erfolgen, um Zellschäden und den Verlust der Lebensfähigkeit zu minimieren.

2. Erwerb von Ratten-NETs

  1. Resuspendieren Sie 0,5 x 108-1 x 108 isolierte Neutrophile in 4 ml RPMI-Medien (ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin) in einer sterilen 10-cm-Petrischale.
  2. Fügen Sie der neutrophilen Suspension 500 nM PMA (siehe Materialtabelle) hinzu, um NETose zu induzieren. 3 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
  3. Für die Negativkontrolle wird DNase I (10 U/ml) in die neutrophile Suspension gegeben, um die sezernierten NETs abzubauen.
  4. Um die NETs zu ernten, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die an der Petrischale befestigten NETs vorsichtig mit HBSS. Verwenden Sie dann eine intensive Spülung mit 4 ml frischem Medium für jede Platte, um die NETs von der Platte zu lösen.
  5. Sammeln Sie das Waschmedium und pipettieren Sie häufig, um die NETs vollständig zu resuspendieren.
  6. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 20 °C zentrifugiert, um alle schwimmenden Zellen zu entfernen.
  7. Die Suspension mit den NETs wird in ein steriles Röhrchen überführt und zur weiteren Verwendung innerhalb von 2 Wochen bei −20 °C gelagert.
    HINWEIS: NETs reagieren empfindlich auf Abbau, daher wird empfohlen, frisch geerntetes Material zu verwenden, um beste Ergebnisse zu erzielen.

3. Überprüfung des Vorhandenseins von NETs

  1. Die Zellen (aus Schritt 2.4) 15 min lang mit 4% Paraformaldehyd und 30 min bis 1 h mit Netzen (ab Schritt 2.7) auf Deckgläsern fixieren.
  2. Drehen Sie das Deckglas auf einem mit Paraffinfolie bedeckten Reagenzglasständer auf ein PBS/PBST-Tröpfchen und wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal für jeweils 5 Minuten.
  3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5% Triton-X-100 für 10 min bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dreimal in PBS/PBST für jeweils 1 min. Verschließen Sie die Zellen mit dem 10% normalen Eselserum (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
  4. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Anti-Ratten-Antikörper gegen neutrophile Elastase und dem Anti-Ratten-Myeloperoxidase-Antikörper (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie dann das Deckglas dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS/PBST.
  5. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Sekundärantikörper A488-konjugiertes Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H + L), A594-konjugiertes Esel-Anti-Maus-IgG (H + L) und A594-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG1 (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 1 h im Dunkeln. Waschen Sie dann das Deckglas dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS/PBST.
  6. Färben Sie Zellkerne und NET-Skelette mit 10 mg/ml DAPI. Waschen Sie dann das Deckglas dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS/PBST.
  7. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums auf einen Objektträger und drehen Sie das Deckglas mit den Zellen darauf um. Für die mikroskopische Analyse mit Tauchlinsen 1 Stunde trocknen lassen; Andernfalls ist es zur Inspektion bereit.
    HINWEIS: Bei der Manipulation von Netzen ist auch nach der Fixierung große Vorsicht geboten, da sie extrem zerbrechlich sind und bei der Vorbereitung leicht verloren gehen können.

4. Quantifizierung von NETs

  1. Bereiten Sie Tris-EDTA (TE)-Puffer und PicoGreen (dsDNA-Assay-Reagenz) Arbeitslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor (siehe Materialtabelle).
  2. Bereiten Sie Standards vor, indem Sie Stamm-DNA auf Konzentrationen von 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml und 1 μg/ml verdünnen.
    HINWEIS: Zur Quantifizierung der Konzentration von NETs wurde das dsDNA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Richtlinien des Herstellers verwendet. Tris-EDTA (TE)-Puffer und dsDNA-Assay-Reagenzien wurden mit einem 19-fachen Volumen doppelt destilliertem Wasser bzw. einem 199-fachen Volumen TE-Puffer hergestellt. Anschließend wurden Standardlösungen (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml und 1 μg/ml) hergestellt, und jede 50 μl der Probe wurde mit 450 μl TE-Puffer kombiniert.
  3. 50 μl jeder Probe in 450 μl TE-Puffer geben.
  4. Geben Sie 100 μl Standards oder Proben zusammen mit einem gleichen Volumen der Assay-Reagenz-Arbeitslösung in jede Vertiefung in einer 96-Well-Platte, einschließlich Standards und Proben.
  5. Inkubieren Sie die Platte 2-5 Minuten lang bei Raumtemperatur und vermeiden Sie direktes Licht.
  6. Lesen Sie die Proben mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader mit einem Emissionsspektrum von etwa 530 nm und einem Absorptionsspektrum von etwa 480 nm.
  7. Berechnen Sie die Konzentration von NETs in jeder Probe anhand der von den Standards generierten Standardkurve.

5. Analyse der NETs-Sekretion durch Zellzytometrie

  1. Fügen Sie den in der 96-Well-Platte inkubierten Zellen eine Kernfärbung (siehe Materialtabelle) hinzu, um eine Endkonzentration von 10 ng/ml zu erreichen, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang.
  2. Geben Sie den Zellen eine zellfreie DNA-Färbung (cfDNA, siehe Materialtabelle), um eine Endkonzentration von 300 nM zu erreichen, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang.
  3. Mischen Sie die Fluoreszenzfarbstoffe durch vorsichtiges Pipettieren. Entsorgen Sie den Überstand nicht und waschen Sie das Pellet nicht.
  4. Legen Sie die Probenplatte in das Zytometergerät ein.
  5. Stellen Sie die Parameter für Fokus und Belichtungszeit für die verschiedenen Kanäle ein: blau (z. B. 377/50 nm, em: 470/22 nm), normalerweise mit einer Belichtung von 30.000 ms, grün (z. B. 483/32 nm, eM: 536/40 nm) normalerweise mit einer Belichtung von 5.000 ms.
  6. Nehmen Sie sehr gleichmäßige Bilder der gesamten Platte auf verschiedenen Kanälen auf.
  7. Analysieren Sie die Anzahl der Kernfärbungen für verschiedene Gruppen. Wenn sie ähnlich sind, kann die NETs-Sekretion durch die cfDNA-Färbezahl bestimmt werden.

Ergebnisse

Das hierin beschriebene Protokoll beschreibt zwei verschiedene Methoden, die jeweils durch eine verbesserte Reinigung oder optimierte Schritte gekennzeichnet sind. Beide Methoden ergaben ungefähr 0,5 x 108-1 x 108 Neutrophile pro Ratte. Die Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung des Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Detektionskits zeigte eine Zellviabilität von über 90 %, vergleichbar mit Maus- und menschlichen Gegenstücken (Abbildung 1). Während eine Lymphozytenkontamination während der Neutrophilenisolierung aus dem Knochenmark unvermeidlich schien, zeigte die zweistufige Methode einen verbesserten Reinheitsgrad von 90 % im Vergleich zu den 50 %, die mit der einstufigen Methode erreicht wurden (Abbildung 2).

Vergleichbare Reaktionen in der NET-Sekretion waren unabhängig von der PMA-Stimulation zwischen peripheren und Knochenmark-Neutrophilen erkennbar (Abbildung 3). Darüber hinaus zeigten Ratten-NETs begrenzte Vernetzungsfähigkeiten untereinander (Abbildung 4). In dem Bemühen, tiefer in den Prozess der Ratten-NETose einzutauchen, wurde PMA als Induktor eingesetzt. NETs wurden durch cfDNA-Färbung nachgewiesen und umfassende Bilder mit einem Cell Imaging Analyzer aufgenommen. Bemerkenswert ist, dass Rattenneutrophile im Gegensatz zu Maus- und menschlichen Neutrophilen auch ohne externe Stimulation eine höhere Neigung zur spontanen NETose zeigten. Die Inkubation mit PMA führte nach 4 Stunden zu einem Anstieg des cfDNA-Gehalts um 10 % (Abbildung 5). Bei Exposition gegenüber 500 nM PMA ergab das Knochenmark jeder Ratte eine Endkonzentration von 8-12 μg/ml NET-DNA. Es ist bemerkenswert, dass intrazelluläre Inhalte während der NETose unvollständig in Rattenneutrophilen extrudiert wurden, was zur Beobachtung zahlreicher intrazellulärer Komponenten führte. Darüber hinaus zeigten Rattennetze aufgrund erhöhter Adhäsionstendenzen eine Neigung, einen gazeartigen Film zu bilden, der ein deutliches wolkenartiges Aussehen zeigte.

figure-results-1
Abbildung 1: Bewertung der Lebensfähigkeit von Neutrophilen aus der Knochenmarkisolierung. Die optimale Quelle für die Isolierung von Neutrophilen bei Ratten ist Knochenmark, was den anschließenden Erwerb von extrazellulären Neutrophilenfallen erleichtert. Diese Abbildung wurde von He et al.14 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Neutrophilenreinigung aus peripherem Blut und Knochenmark mittels Wright-Giemsa-Färbung. (A) Herkunft des peripheren Blutes. (B) Knochenmarkherkunft über die einstufige Methode. (C) Knochenmarkherkunft über die zweistufige Methode. Die Knochenmarkextraktion dient als bevorzugter Ansatz für die Neutrophilenisolierung von Ratten und den anschließenden Erwerb von extrazellulären Neutrophilenfallen. Maßstabsleiste = 20 μm. Vergrößerung = 400x. Diese Abbildung wurde von He et al.14 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: NET-Sekretion bei Inkubation mit PMA oder PMA + DNase I. Die Knochenmarkextraktion stellt den bevorzugten Weg für die Isolierung von Neutrophilen bei Ratten und die anschließende Entnahme von extrazellulären Neutrophilenfallen dar. Diese Abbildung wurde von He et al.14 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Immunfluoreszenz-Analyse. Immunfluoreszenzfärbung des Zellkerns (blau, A), MPO (grün, B) und Verschmelzungsbild (C). NET: Neutrophile extrazelluläre Falle; MPO: Myeloperoxidase. Die Knochenmarkextraktion ist die bevorzugte Methode für die Isolierung von Neutrophilen bei Ratten und die anschließende Sammlung von extrazellulären Fallen für Neutrophile. Maßstabsbalken = 50 μm. Vergrößerung = 200x. Diese Abbildung wurde von He et al.14 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: Umfassende Analyse der cfDNA mittels Cell Imaging Analyzer unter verschiedenen Bedingungen. Fluoreszenzfärbung von cfDNA (grün) und Zellkern (blau). Die Knochenmarkextraktion ist der primäre Ansatz für die Isolierung von Neutrophilen bei Ratten und die anschließende Sammlung von extrazellulären Neutrophilenfallen. Maßstabsleiste = 500 μm. Diese Abbildung wurde von He et al.14 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Isolierung von Neutrophilen stellt einen entscheidenden Schritt bei der Untersuchung der NETose dar, bei dem die Auswahl einer geeigneten Isolationsmethode von größter Bedeutung ist, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Ein wichtiger Faktor, den es abzuwägen gilt, ist das Auftreten einer Lymphozytenkontamination während der Isolierung. Die Bewältigung dieser Herausforderung ist besonders wichtig, wenn Rattenneutrophile aus dem Knochenmark isoliert werden. Trotz des ausgeprägten Dichtebereichs von Neutrophilen (1,0814-1,0919, mit einem Peak bei 1,0919) im Vergleich zu Lymphozyten (1,0337-1,0765, mit einem Peak bei 1,0526) bleibt eine Kontamination mit Lymphozyten unausweichlich. Dies kann zum Teil auf die Häufigkeit von Lymphozyten im Knochenmark und die erhöhte Dichte unreifer Lymphozyten zurückgeführt werden15. Techniken wie die Dichtegradiententrennung, wie z. B. die Verwendung von Percoll und Ficoll, können dazu beitragen, die Lymphozytenkontamination einzudämmen, obwohl das Erreichen einer vollständigen Lymphozyteneliminierung eine Herausforderung darstellen kann. Eine spezielle Percoll-Lösung, die auf einen bestimmten Dichtegradienten kalibriert ist, kann verwendet werden, um die Kontamination zu minimieren, indem die Dichtevarianz zwischen Rattenneutrophilen und anderen Knochenmarkzellen ausgenutzt wird. Daher sollten Forscher die potenziellen Auswirkungen einer Lymphozytenkontamination auf ihre experimentellen Ergebnisse mit Bedacht bewerten und Maßnahmen ergreifen, um ihren Einfluss zu mindern.

Diese Studie unterstreicht die Bedeutung der Anpassung von Isolationsmethoden an spezifische experimentelle Anforderungen. In der zuvor beschriebenen Methode14 zeigte die einstufige Methode, dass sie in Bezug auf Zeit und Aufwand weniger anspruchsvoll ist. Als solches wurde es für die NET-Akquisition empfohlen, da kontaminierende Lymphozyten einen unbedeutenden Einfluss auf die NET-Sekretion haben. Diese Lymphozyten konnten anschließend in der letzten Zentrifugationsphase eliminiert werden. Umgekehrt wurde für Bemühungen, die die Isolierung von Neutrophilen und die anschließende Bewertung der NETose und der NET-Sekretion beinhalten, die zweistufige Methode empfohlen14. Dieser Ansatz ermöglichte eine präzise Quantifizierung der von Neutrophilen produzierten NETs bei gleichzeitiger Minimierung des Einflusses potenzieller Störfaktoren, die von anderen Zellkontaminationen herrühren.

Änderungen am Isolationsprotokoll können vorgenommen werden, um sowohl die Ausbeute als auch die Reinheit zu verbessern. Zum Beispiel kann die Verwendung eines optimierten Dichtegradienten-Reagenziensets mehr Neutrophile liefern. Schonende Pipettier- und Waschmethoden können ebenfalls den Zellverlust mildern und die Reinheit verbessern. Fehlerbehebungsmaßnahmen wie die Überwachung des pH-Werts und der Temperatur des Puffers sowie die Anpassung der Zentrifugationsparameter können Herausforderungen während des Isolierungsprozesses effektiv angehen. Eine damit verbundene Einschränkung der Knochenmarkisolierung liegt in der Wahrscheinlichkeit einer unreifen Kontamination von Neutrophilen und anderen Knochenmarkzellen, wodurch sowohl die Reinheit als auch die Ausbeute beeinträchtigt werden. Die Entwicklung eines optimierten Ansatzes zur Ausscheidung von Lymphozyten könnte die Gesamtisolationseffizienz verbessern. Eine weitere Einschränkung betrifft die Notwendigkeit von Tieropfern für die Knochenmarkisolierung, die für Längsschnittuntersuchungen an Rattenneutrophilen in vivo ungeeignet sein könnten.

Die Isolierung von Neutrophilen für den Menschen beruht überwiegend auf peripherem Blut. Konventionelle Methoden umfassen die Ficoll-Paque-, Percoll- und immunomagnetische Bead-Trennung 16,17,18. Der Ficoll-Ansatz trennt Leukozytenpopulationen basierend auf dem Auftrieb und stützt sich auf ein Kontrastmittel, um Neutrophile zu unterscheiden. Es bietet Einfachheit und Kosteneffizienz, geht aber Kompromisse bei Reinheit und Ausbeute ein und stellt eine Herausforderung bei der Beseitigung roter Blutkörperchen dar. Auf der anderen Seite nutzt Percoll Dichtegradienten, was zu einer höheren Reinheit und Ausbeute von Neutrophilen auf Kosten von Spezialgeräten und erhöhtem Aufwand und Zeitaufwandführt 19. Die immunomagnetische Bead-Trennung ist eine neuere, spezifischere Technik, bei der Antikörper-konjugierte Magnetbeads verwendet werden, die spezifisch an Neutrophile binden und nur minimale Kontamination durch andere Leukozyten aufweisen. Obwohl es für die Automatisierung zugänglich ist, erfordert es spezielle Geräte und verursacht höhere Kosten aufgrund von Perlenkosten. Bei der Auswahl einer Methode zur Isolierung von Neutrophilen müssen Forscher Ausbeute, Reinheit, Kosten und Komplexität abwägen. Die derzeit bequemste Methode zur Isolierung menschlicher Neutrophilen ist die Verwendung von PolymorphPrep20. Dieser Ansatz liefert hochreine Neutrophile in signifikanten Mengen innerhalb kurzer Zeitspanne. Das Prinzip von PolymorphPrep beruht auf der Zelltrennung nach Dichte.

Bei Mäusen ist die Isolierung von Neutrophilen aus peripherem Blut aufgrund des geringen Blutvolumens und der Herausforderung, eine ausreichende Menge und Reinheit für nachgelagerte Experimente sicherzustellen, nicht ratsam. Obwohl Ratten ausreichende Blutmengen liefern (10 ml pro Ratte), unterscheiden sich ihre peripheren Bluteigenschaften von denen von Menschen und Mäusen. Ratten weisen von Natur aus Mängel bei der Extraktion von Neutrophilen auf, wobei Monozyten die am häufigsten vorkommenden kernhaltigen Zellen sind13,14. Daher liefert die periphere Blutisolierung nur 2 x 105-5 x 105 Neutrophile von einer einzigen Ratte. Knochenmark dient als praktikablere Neutrophilenquelle und bietet unabhängig vom Infektionsstatus des Tieres eine leicht verfügbare und reichliche Versorgung. Alternativ ist es unzuverlässig und kompliziert, eine entzündliche Umgebung in der Bauchhöhle oder im Thorax zu induzieren, um die Neutrophileninfiltration zur Isolierung zu verbessern. Daher erweist sich die Knochenmarkentnahme als praktischer, zuverlässiger Weg für die Isolierung von Neutrophilen bei Ratten21.

NETose umfasst verschiedene zelluläre Prozesse, die DNA-Dekondensation, Autophagie und intrazelluläre Matrixaustreibungumfassen 1. Beim Menschen ist die NET-Extrusion umfassend und hinterlässt Reste der Zellmembran. Interessanterweise zeigen Studien an Rattenneutrophilen abweichende Muster, die nach der Stimulation mehr intrazelluläre Inhalte aufzeigen. Trotz PMA-Stimulation weisen Rattenneutrophile eine unvollständige NET-Extrusion auf, die mit ihrer spontanen NETose übereinstimmt. Seltsamerweise zeigen Ratten-NETs eher eine Neigung zu aggregierten Formen (aggNETs) als zu einer ausgedehnten Netzwerkstruktur, möglicherweise aufgrund einer verringerten Vernetzungsfähigkeit. Dieses Phänomen könnte die Aggregation von Neutrophilen erheblich beeinflussen und die breitere Immunantwort bei Ratten beeinflussen. Zukünftige Anwendungen der Knochenmarkisolierung könnten die Untersuchung verschiedener Signalwege und Immunzellen bei NETose beinhalten. Darüber hinaus kann diese Methode die NETosis-Untersuchung in verschiedenen Krankheitsmodellen erleichtern und die Rolle von Neutrophilen in verschiedenen Pathologien entschlüsseln. Letztendlich sind neuartige Techniken zur Isolierung und Charakterisierung von NETs vielversprechend, um die Mechanismen zu entschlüsseln, die NETose antreiben, und ihre funktionellen Auswirkungen auf verschiedene Tiermodelle.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Finanzierung: Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82004154, 81900311, 82100336 und 81970345) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A488-konjugiertes Esel-Anti-Kaninchen-IgG(H + L)Invitrogen, USAA32790
A594-konjugiertes Esel-Anti-Maus-IgG(H + L)Invitrogen, USAA32744
A594-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG1 Invitrogen, USAA21125
Anti-Ratten-MyeloperoxidaseAbcam, Englandab134132
Anti-Ratten-Neutrophilen-ElastaseAbcam, Englandab21595
Celigo Image CytometerNexelom, USA200-BFFL-5C
DNase ISigma, USA10104159001
fötales Rinderserum (FBS)Gibco, USA10099141C
Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco, USAC14175500BT
HoechstThermofisher, USA33342
IsofluranRWD, ChinaR510-22-10
MowiolSigma, USA81381
Normales EselsserumSolarbio, ChinaSL050
Paraformaldehydbiosharp, ChinaBL539A
Penicillin-Streptomycin-Hyklone, USASV30010
PercollGE, USAP8370-1L
Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)Sigma, USA  P1585
Picogreen dsDNA-Assay-KitInvitrogen, USAP11496
Neutrophilen-Isolationskit für RattenSolarbio, ChinaP9200
Puffer zur Lyse roter BlutkörperchenSolarbio, ChinaR1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) MedienHyclone, USASH30809.01B
RWD Universal-TieranästhesiegerätRWD, ChinaR500
Sprague Dawley (SD) RattenDashuo, China
SytoxGreenThermofisher, USAS7020
Tris-EDTA (TE) PufferSolarbio, ChinaT1120
Triton-X-100Biofroxx, Deutsch1139ML100

Referenzen

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
  5. Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  6. Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
  7. Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
  8. Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11(2018).
  9. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
  10. Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
  11. Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488(2020).
  12. Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  13. Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687(2015).
  14. He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
  15. Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
  16. Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
  17. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
  18. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
  19. Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
  20. Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994(2022).
  21. Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Neutrophilen IsolierungNeutrophilen extrazellul re FallenNET BildungDichtegradientNeutrophile aus peripherem BlutZellviabilit tPMA Stimulationzellfreie DNAfluoreszierender Mikroplattenleser

Verwandte Artikel