Identifizierung von Peptiden kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen aus dem Knochenmark

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen durch differentielle Ultrazentrifugation und Extraktion des Peptidoms zur Identifizierung mittels Massenspektrometrie.

Abstract

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) werden typischerweise durch die Exozytose von multivesikulären Körpern (MVBs) sezerniert. Diese Nanovesikel mit einem Durchmesser von <200 nm sind in verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhanden. Diese sEVs regulieren verschiedene biologische Prozesse wie Gentranskription und -translation, Zellproliferation und -überleben, Immunität und Entzündung durch ihre Ladungen wie Proteine, DNA, RNA und Metaboliten. Derzeit wurden verschiedene Techniken zur Isolierung von Elektrofahrzeugen entwickelt. Unter ihnen gilt die auf Ultrazentrifugation basierende Methode als Goldstandard und wird häufig für die Isolierung von Elektrofahrzeugen eingesetzt. Bei den Peptiden handelt es sich um natürliche Biomakromoleküle mit einer Länge von weniger als 50 Aminosäuren. Diese Peptide sind an einer Vielzahl biologischer Prozesse mit biologischer Aktivität beteiligt, wie z. B. Hormone, Neurotransmitter und Zellwachstumsfaktoren. Das Peptidom soll körpereigene Peptide in spezifischen biologischen Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) systematisch analysieren. Hier haben wir ein Protokoll zur Isolierung von sEVs durch differentielle Ultrazentrifugation und extrahiertes Peptidom zur Identifizierung mittels LC-MS/MS eingeführt. Diese Methode identifizierte Hunderte von sEVs-abgeleiteten Peptiden aus aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen.

Introduction

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm sind in fast allen Arten von Körperflüssigkeiten vorhanden und werden von allen Arten von Zellen sezerniert, einschließlich Urin, Schweiß, Tränen, Liquor cerebrospinalis und Fruchtwasser¹. Ursprünglich wurden sEVs als Behälter für die Entsorgung von zellulärem Abfall in Betracht gezogen, was im folgenden Jahrzehnt zu minimaler Forschung führte². In jüngster Zeit gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass sEVs spezifische Proteine, Lipide, Nukleinsäuren und andere Metaboliten enthalten. Diese Moleküle werden zu den Zielzellen^....

Protocol

1. Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel

HINWEIS: Alle Zentrifugationen in den Schritten 1.1-1.11 bei 4 °C durchführen.

1. Herstellung von sEVs-freiem fetalem Kälberserum (FBS): FBS über Nacht bei 110.000 × g bei 4 °C durch eine Ultrazentrifuge zentrifugieren (siehe Materialtabelle), um endogene sEVs zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand, filtern Sie ihn mit einer 0,2 μm Ultrafiltrationsmembran und lagern Sie ihn bei -20 °C.
2. Etwa 3 x 10⁷ immortalisierte Makrophagen aus dem Knochenmark (iBMDMs) auf eine 150-mm-Kulturschale geben und 20 ml DMEM-Nährmedium hinzufügen....

Results

Für die durch differentielle Ultrazentrifugation isolierten sEVs (Abbildung 1) haben wir ihre Morphologie, Partikelgrößenverteilung und Proteinmarker gemäß der International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)¹⁷ bewertet.

Zunächst wurde die Morphologie von sEVs mittels TEM beobachtet und zeigte eine typische becherartige Struktur (Abbildung 2A). NTA zeigte, dass isolierte sEVs meist bei 136 nm konzentrier.......

Discussion

Bei der Untersuchung der Funktion von sEVs ist es unerlässlich, hochreine sEVs aus komplexen biologischen Proben zu gewinnen, um mögliche Kontaminationen zu vermeiden. Es wurde eine Vielzahl von Methoden zur Isolierung von sEVs entwickelt¹³, und unter diesen Methoden haben auf differentieller Ultrazentrifugation basierende Methoden eine relativ hohe Reinheit von sEVs gezeigt. In dieser Studie wurden 200 ml Zellüberstand für 6 h gesammelt und etwa 200-300 μg sEVs wurden durch differentielle Ultraze.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Zentrifugalfilterrohr	Millipore	UFC5010BK
Zentrifugenflaschen Polypropylen	Beckman Coulter	357003	Hochgeschwindigkeitszentrifuge
Chemilumineszenzsubstrat	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM Kulturmedium	Zellwelt	N? A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Zentrifugenrotor (JA-25.50)
Immortalisierte Makrophagen aus Knochenmark (iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Zur Verfügung gestellt von Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodacetamid	Sigma	l1149	5 g
Mikrofugenröhrchen Polypropylen	Beckman Coulter	357448	1,5 mL, Tisch-Ultrazentrifuge
Nano-Hochleistungs-LC-System	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Analyse zur Verfolgung von Nanopartikeln	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X Massenspektrometer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Solarbio	P1020
Polyallomer-Zentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	326823	Ultrazentrifuge
Proteaseinhibitor	Bimake	B14002
SpeedVac Vakuumkonzentrator	Eppendorf	Concentrator plus
Tisch-Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Ultrazentrifuge Rotor (TLA 55)
Transmissionselektronenmikroskop	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Ultrazentrifugenrotor (SW32 Ti)
Ultraschall-Zelldisruptor	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot Imager	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-Aktin	Sigma	A3853