Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.
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Methodenartikel
Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Drosophila-neurale Stammzellen (Neuroblasten, im Folgenden NBs) durchlaufen asymmetrische Teilungen, die den sich selbst erneuernden Neuroblasten regenerieren und gleichzeitig eine differenzierende Ganglienmutterzelle (GMC) bilden, die eine zusätzliche Teilung durchläuft, um zwei Neuronen oder Gliazellen entstehen zu lassen. Studien an NBs haben die molekularen Mechanismen aufgedeckt, die der Zellpolarität, der Spindelorientierung, der Selbsterneuerung neuraler Stammzellen und der Differenzierung zugrunde liegen. Diese asymmetrischen Zellteilungen sind durch Lebendzell-Bildgebung leicht zu beobachten, wodurch sich Larven-NBs ideal für die Untersuchung der räumlich-zeitlichen Dynamik der asymmetrischen Zellteilung in lebendem Gewebe eignen. Bei richtiger Präparation und Abbildung in nährstoffangereichertem Medium teilen sich NBs im Explantatgehirn 12-20 Stunden lang robust. Die zuvor beschriebenen Methoden sind technisch schwierig und können für Neulinge auf diesem Gebiet eine Herausforderung darstellen. Hier wird ein Protokoll für die Präparation, Präparation, Montage und Bildgebung von lebenden Larvenexplantaten des dritten Stadiums unter Verwendung von Fettkörperpräparaten beschrieben. Es werden auch mögliche Probleme diskutiert und Beispiele für den Einsatz dieser Technik gegeben.
Einleitung
Asymmetrische Zellteilung (ACD) ist der Prozess, bei dem subzelluläre Komponenten wie RNA, Proteine und Organellen ungleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden 1,2. Dieser Prozess ist häufig bei Stammzellen zu beobachten, die ACD durchlaufen, um Tochterzellen mit unterschiedlichen Entwicklungsschicksalen hervorzubringen. Drosophila NBs teilen sich asymmetrisch und erzeugen eine NB, die ihre Stammform beibehält, und eine Ganglienmutterzelle (GMC). Das GMC durchläuft weitere Teilungen, um differenzierende Neuronen oder Gliazellenzu erzeugen 3. Asymmetrisch teilende NBs sin....
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Protokoll
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Materialien, die für die Durchführung dieser Studie erforderlich sind.
1. Überlegungen und Vorbereitungen für das Experiment
- Verhindern Sie, dass sich die Larven überfüllen.
HINWEIS: Die Qualität der Larvengehirne steht in direktem Zusammenhang mit der Gesundheit und Qualität der Larven vor der Sektion. Larven, die durch Überfüllung unterernährt sind, bringen im Allgemeinen Gehirne von geringerer Qualitäthervor 30.- Stellen Sie sicher, dass nicht mehr als 20-30 Larven pro Mahlzeit vorhanden sind, um eine Mangelernährung z....
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Ergebnisse
Dissektion und Bildgebung von zentralen Hirnlappen-NBs, die Pins::EGFP und Cherry::Jupiter exprimieren
Um dieses Protokoll zu demonstrieren, wurden Larven, die UAS-getriebenes Cherry::Jupiter13 exprimieren und endogen mit Pins::EGFP16 markiert sind (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Die Pins::EGFP/TM6B, Tb) wurden 4 h lang mit dem beschriebenen Protokoll unter Verwendung von Multi-Well-Imaging-Objektträgern abgebildet (
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz für die Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven . Das hier beschriebene Protokoll erlaubt es, Explantatgehirne für 12-20 Stunden unter den richtigen experimentellen Bedingungen zu beobachten. Besonderes Augenmerk muss auf die Vorbereitung der Proben und das Design der gewünschten Experimente gelegt werden. Wie bereits erwähnt, ist einer der kritischsten Faktoren, der die Qualität des präparierten Gewebes bestimmt, die Gesundheit der La.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine finanziellen Angaben zu machen.
Danksagungen
Diese Forschung wird durch R35GM148160 (C. C.) und einen National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S) unterstützt
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,22 &Mikro; m Polyethersulfon (PES)-Membran | Genesee | 25-231 | Vakuumfilter |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulierter |
| Agar Analysecomputer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU mit zwei 3,80-GHz-Prozessoren unter Windows 10 auf einem 64-Bit-Betriebssystem |
| Rinderwachstumsserum | HyClone | SH30541,02 | |
| Kammer-Bildgebungsträger | Ibidi | 80826 | |
| Konfokales Mikroskop | Nikon | NA | |
| Kundenspezifischer Metallobjektträger | NA | NA | Spezifikationen siehe Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) |
| Sezierschalen | Fisher Scientific | 5024343 | 3-Well-Porzellan-Mikropunktplatte |
| Präparierzange | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Seziermikroskop | Leica | NA | |
| Sezierschere | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Käfig für die Embryonenentnahme | Genesee | 59-100 | |
| Flypad mit Zugang zu CO2 zur Betäubung erwachsener Fliegen | Genesee | 59-172 | |
| Gasdurchlässige Membran | YSI | 98095 | Gasdurchlässige Membran |
| Glasabdeckung Objektträger | Elektronenmikroskopie Sciences | 72204-03 | # 1,5; 22 mm x 40 mm Glasdeckgläser |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternativen: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Hefe | Saf-Instant | NA | |
| Melasse | Genesee | 62-117 | |
| Petrischale | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petrischale |
| Vaseline | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat flüssig | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook Erfassungssoftware | 3i | NA | |
| Vakuum-Driven Filtration Unit mit einem 0,22 & Mikro; &Mikro; m PES-Membranfilter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
Referenzen
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division.
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Nachdrucke und Genehmigungen
