Chirurgisches Schweinemodell der chronischen Myokardischämie, das mit einem mit Exosomen beladenen Kollagenpflaster und einem Bypass-Transplantat der Koronararterien behandelt wird

Summary

Diese Studie stellt ein chirurgisches Schweinemodell der chronischen Myokardischämie aufgrund einer progressiven Koronararterienstenose vor, die zu einer Beeinträchtigung der Herzfunktion ohne Infarkt führt. Nach einer Ischämie werden die Tiere einer Bypass-Transplantation außerhalb der Pumpe unterzogen, bei der ein mit Stammzellen gewonnenes Exosomen-beladenes Kollagenpflaster epikardial platziert wird. Diese Zusatztherapie verbessert die Myokardfunktion und die Genesung.

Abstract

Chronische Myokardischämie infolge einer progressiven Koronararterienstenose führt zu einem überwinternden Myokard (HIB), definiert als Myokard, das sich an eine verringerte Sauerstoffverfügbarkeit anpasst, indem es die Stoffwechselaktivität reduziert und so irreversible Kardiomyozytenverletzungen und Infarkte verhindert. Dies unterscheidet sich vom Myokardinfarkt, da HIB das Potenzial für eine Genesung mit Revaskularisation hat. Patienten mit signifikanter koronarer Herzkrankheit (KHK) leiden unter chronischer Ischämie, wodurch sie einem Risiko für Herzinsuffizienz und plötzlichen Tod ausgesetzt sind. Der chirurgische Standardeingriff bei schwerer KHK ist die Bypass-Operation der Koronararterien (CABG), aber es hat sich gezeigt, dass es sich um eine unvollkommene Therapie handelt, aber es gibt keine Zusatztherapien, um Myozyten wiederherzustellen, die an chronische Ischämie angepasst sind. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein chirurgisches Modell von HIB mit Schweinen verwendet, das für CABG geeignet ist und das klinische Szenario nachahmt. Das Modell umfasst zwei Operationen. Bei der ersten Operation wird ein 1,5 mm starrer Constrictor an der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) implantiert. Während das Tier wächst, verursacht der Constrictor allmählich eine signifikante Stenose, die zu einer verminderten regionalen systolischen Funktion führt. Sobald die Stenose 80% erreicht, werden der Myokardfluss und die Funktion beeinträchtigt, wodurch eine HIB entsteht. Anschließend wird eine Off-Pump-CABG mit der linken inneren Brustarterie (LIMA) durchgeführt, um die ischämische Region zu revaskularisieren. Das Tier erholt sich einen Monat lang, um eine optimale Verbesserung des Myokards vor der Tötung zu ermöglichen. Dies ermöglicht physiologische und Gewebestudien verschiedener Behandlungsgruppen. Dieses Tiermodell zeigt, dass die Herzfunktion trotz CABG beeinträchtigt bleibt, was auf die Notwendigkeit neuartiger ergänzender Interventionen hindeutet. In dieser Studie wurde ein Kollagenpflaster entwickelt, das mit mesenchymalen Stammzellen (MSC)-abgeleiteten Exosomen eingebettet ist und chirurgisch auf die epikardiale Oberfläche distal der LIMA-Anastomose aufgebracht werden kann. Das Material passt sich dem Epikard an, ist resorbierbar und bildet das Gerüst für die verzögerte Freisetzung von Signalfaktoren. Diese regenerative Therapie kann die Erholung des Myokards stimulieren, die nicht nur auf die Revaskularisierung reagiert. Dieses Modell lässt sich auf den klinischen Bereich übertragen, indem es physiologische und mechanistische Untersuchungen zur Genesung von HIB ermöglicht.

Introduction

Weltweit sind über hundert Millionen Patienten von schwerer KHK betroffen, und obwohl die Sterblichkeitsrate gesunken ist, bleibt sie eine der häufigsten Todesursachen ^1,2. CAD hat ein breites klinisches Spektrum von Myokardinfarkt (MI) bis hin zu Ischämie mit erhaltener Lebensfähigkeit. Die meisten präklinischen Forschungen konzentrieren sich auf MI, das durch das Vorhandensein von infarktiertem Gewebe gekennzeichnet ist, wie es in kleinen und großen Tiermodellen untersucht werden kann. Dieses Modell richtet sich jedoch nicht an Patienten mit erhaltener Lebensfähigkeit, die für eine Revaskularisierung zugänglich sind. Die meisten Patienten, die sich einer CABG unterziehen, haben eine verminderte Blutversorgung und eine eingeschränkte Funktion, während die Variabilität der kontraktilen Reserve und Lebensfähigkeit erhalten^{bleibt 3}. Ohne Behandlung können diese Patienten zu fortgeschrittener Herzinsuffizienz und plötzlichem Tod führen, insbesondere bei erhöhter Arbeitsbelastung⁴. Bei diesen Patienten ist die Koronararterien-Bypass-Transplantation (CABG) eine wirksame Therapie, führt jedoch möglicherweise nicht zu einer vollständigen funktionellen Wiederherstellung⁵. Wichtig ist, dass sich die diastolische Dysfunktion, die ein Marker für schlechtere klinische Ergebnisse ist, nach der Revaskularisierung nicht erholt, was auf die Notwendigkeit neuartiger adjuvanter Therapien während der CABG^{hindeutet 6,7}. Derzeit gibt es keine klinisch verfügbaren adjuvanten Interventionen, die mit CABG verwendet werden, um Kardiomyozyten wieder voll funktionsfähig zu machen. Dies ist eine große therapeutische Lücke, da viele Patienten trotz entsprechender Revaskularisierung zu fortgeschrittener Herzinsuffizienz fortschreiten⁸.

Es wurde ein innovatives Schweinemodell der chronischen Myokardischämie entwickelt, das für CABG geeignet ist, um die klinische CAD-Erfahrung nachzuahmen⁹. Schweine sind ein gutes Modell für Herzerkrankungen gegenüber anderen Großtieren, da sie keine epikardialen Brückenkollateralen haben, so dass eine Stenose der LAD allein zu einer regionalen Ischämie führt¹⁰. In dieser Studie wurden 16 Wochen alte weibliche Yorkshire-Landrasse-Schweine verwendet. In diesem Modell wurde die LAD mit Off-Pump-CABG unter Verwendung des linken inneren Brustarterientransplantats (LIMA) revaskularisiert (Ergänzende Tabelle 1). Eine perkutane Koronarintervention (PCI) ist nicht möglich, um die Stenose zu öffnen, da der Konstriktor ein starres Gerät ist. Die kardiale Magnetresonanztomographie (MRT) wird verwendet, um die globale und regionale Funktion, die koronare Anatomie und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu beurteilen. Die kardiale MRT-Analyse zeigte, dass die diastolische Funktion, die durch die maximale Füllrate (PFR) gekennzeichnet ist, trotz CABG⁶ beeinträchtigt bleibt. Der Mechanismus der diastolischen Dysfunktion hängt wahrscheinlich mit einer gestörten mitochondrialen Bioenergetik und Kollagenbildung in HIB zusammen, die nach CABG¹¹ bestehen bleiben.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) liefern therapeutische Signale über Exosomen, um die Erholung des Myokards zu verbessern, wenn sie während der CABG angewendet werden. In diesem Schweinemodell und parallelen In-vitro-Studien wurde gezeigt, dass die Platzierung eines epikardialen MSC-Vicryl-Pflasters während der CABG die kontraktile Funktion mit einem Anstieg der wichtigsten mitochondrialen Proteine, nämlich PGC-1α¹², einem wichtigen Regulator des mitochondrialen Energiestoffwechsels, wiederherstellt¹³. Das In-vitro-Modell ermöglichte es uns, den Signalmechanismus von MSCs auf eine beeinträchtigte mitochondriale Funktion zu untersuchen. Exosomen sind sezernierte stabile Mikrovesikel (50-150 nm), die Proteine oder Nukleinsäuren enthalten, einschließlich microRNA (miRNA)¹⁴. Jüngste In-vitro-Daten deuten darauf hin, dass MSC-abgeleitete Exosomen ein wichtiger Signalmechanismus sind, der für die Wiederherstellung der mitochondrialen Atmung notwendig ist.

Aus Stammzellen gewonnene Exosomen sind vielversprechende Zusatztherapeutika, da sie leicht zugänglich sind, kommerziell hergestellt werden können und keine ethischen Konflikte aufweisen. Unter Berücksichtigung der klinischen Translation wurde ein Kollagenpflaster erstellt, das in MSC-abgeleitete Exosomen eingebettet ist und chirurgisch an die Überwinterungsregion des Myokards genäht werden kann. Es wurde gezeigt, dass dieses Pflaster eine anhaltende Abgabe von Exosomen bewirkt und eine zellfreie regenerative Therapie mit parakrinen Signalmechanismen bietet, die auf die mitochondriale Erholung abzielt und die mitochondriale Biogenese verbessert¹⁵. Dieses Verfahren bietet das präklinische Modell, um die Auswirkungen von MSC-abgeleiteten Therapien zur Verbesserung der Herzfunktion durch Verbesserung der Mitochondrienfunktion und Verringerung der Entzündung zum Zeitpunkt der Revaskularisierung zu untersuchen und die Myozytenanpassungen an chronische Ischämie umzukehren.

In dieser Studie wird eine chirurgische Methode der Off-Pump-CABG unter Verwendung der LIMA-zu-LAD-Anastomose gezeigt, um den Bereich der proximalen LAD-Stenose zu umgehen, die die Standardbehandlung für Patienten mit KHK nachahmt. Als Zusatztherapie mit CABG wurde die chirurgische Anwendung eines MSC-abgeleiteten Exosomen-eingebetteten Kollagenpflasters auf der ischämischen Region des Myokards demonstriert. Dieses chirurgische Modell kann verwendet werden, um die physiologischen Reaktionen auf den parakrinen Effekt zu untersuchen, der bei der Verwendung eines Exosomenpflasters beobachtet wird, sowie die molekularen Mechanismen der Genesung.

Protocol

Die Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) des Minneapolis VA Medical Center und der University of Minnesota haben alle Tierversuche genehmigt. Die aktuellen Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) für die Verwendung und Pflege von Labortieren wurden befolgt.

1. Isolierung mesenchymaler Stammzellen und Präparation und Charakterisierung von Exosomen

1. Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus dem Knochenmark
   1. Entnehmen Sie 30-50 ml steriles Knochenmark aus dem Brustbein oder Schienbein eines 20 Wochen alten weiblichen Yorkshire-Landrassenschweins. Führen Sie dazu eine interossäre 25-mm-15G-Nadel in das Brustbein oder die Tibia ein und ziehen Sie die Probe in eine 60-ml-Spritze mit 10 ml Heparin.
      HINWEIS: Weitere Einzelheiten zur Knochenmarkentnahme finden Sie bei Pittenger et al. und Hocum-Stone et ^al.12,16.
   2. Kurz gesagt, führen Sie die Knochenmarkprobe 30 Minuten lang bei 1800 x g durch ein Vacutainer-CPT-Röhrchen mit Heparin.
   3. Entfernen Sie den Buffy Coat mit den mononukleären Zellen und waschen Sie ihn mit Hanks ausgewogener Salzlösung. Mononukleäre Zellen durch Zentrifugation pelletieren und in Wachstumsmedium (10% fötales Rinderserum [FBS]) resuspendieren.
   4. Die mononukleären Zellen werden für das adhärente Wachstum in Zellkulturflaschen überführt. Isolieren Sie die MSCs von der mononukleären Fraktion durch ihre adhärente Natur.
   5. Waschen Sie alle Nicht-MSCs innerhalb von 24 Stunden, wobei eine Monoschicht MSCs im Gewebekulturkolben verbleibt. Bestätigen Sie den MSC-Phänotyp durch Durchflusszytometrie, um die Negativität für CD45, einen hämatopoetischen Marker, und die Positivität für CD90 und CD105, die Marker von MSCs, sicherzustellen.
2. Präparation und Charakterisierung von Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen von Schweinen
   1. 1 x 10⁴ H9C2-Ratten-Kardiomyozyten und Kultur in 1x DMEM+ 10% FBS und 1x Pen/Streptokokken auslegen. Saatgut 2 x 10⁴ Schweine-MSCs in fortgeschrittenem DMEM + 5% FBS und 1x Pen/Streptokokken.
   2. Sobald beide Zelllinien zu mindestens 80 % konfluierend sind, wechseln Sie das Medium zu exosomenabgereichertem H9C2- und MSC-Medien.
   3. H9C2-Kardiomyozyten einer leichten Hypoxie aussetzen (1% O₂ für 24 h). Entfernen Sie die Kolben nach 24 Stunden aus der Hypoxie und pipettieren Sie das H9C2-Medium.
   4. Entfernen und entsorgen Sie das MSC-Medium aus dem MSC-Kolben. Gereinigtes H9C2-Medium in den MSC-Kolben geben. Der Kolben wird 6 Stunden lang unter normoxischen Bedingungen (5 % CO₂, 20 % O₂ und 37 °C) inkubiert.
   5. Extrahieren Sie die Exosomen aus dem co-kultivierten konditionierten Medium unter Verwendung des Reagenzes für die Gesamtexosomenisolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   6. Überprüfung der Identifizierung von Exosomen durch Western-Blot-Nachweis gängiger exosomaler Proteine mit Antikörpern gegen CD-63 (1:1000)¹⁷.
   7. Führen Sie eine Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) durch, um die Exosomen zu quantifizieren und die Nanopartikelgröße und ihre Verteilung zu bewerten. Lösen Sie dazu das Gesamtprotein (50 μg) der Exosomen in 500 μl PBS auf, um die Konzentration und Größenverteilung der Exosomen mit Hilfe eines Nanopartikel-Tracking-Analysators zu bestimmen.
   8. Analysieren Sie die Daten mit einer Nanopartikel-Tracking-Software.

2. Bypass-Operation der Koronararterien aus der Pumpe

1. Tierische Vorbereitung
   1. Wiegen Sie das Tier (16 Wochen alte weibliche Yorkshire-Landrasse-Schweine) 3 Tage vor der geplanten Operation. Fasten Sie das Tier vor der Operation 12 Stunden lang, während Sie während des Fastens Zugang zu Wasser haben.
   2. Geben Sie Buprenorphin 0,18 mg/kg intramuskulär 2-4 h vor der Operation.
2. Induktion des Tieres
   1. Sedieren Sie das Tier durch intramuskuläre Injektion von 6,6 mg/kg Tiletamin-Zolazepam/Xylazin.
   2. Warten Sie 15 Minuten, um eine ausreichende Sedierung zu gewährleisten, indem Sie den Kiefertonus beurteilen und anschließend einen 22-G-Katheter in die zentrale Ohrvene legen.
      HINWEIS: Eine andere periphere Vene kann in Betracht gezogen werden (z. B. Kopfvene), wenn die Ohrvene unzureichend ist.
   3. Verabreichen Sie die Augensalbe topisch auf jedes Auge. Verabreichen Sie 1-2 mg/kg Propofol intravenös, um eine Vollnarkose einzuleiten. Der Kiefertonus spiegelt die Tiefe der Anästhesie am zuverlässigsten wider und sollte während des gesamten Eingriffs beurteilt werden.
   4. Intubieren Sie das Tier mit einem Endotrachealtubus geeigneter Größe.
3. Chirurgie
   1. Rasieren Sie das Brustbein und die Leiste des Tieres, um sich auf den chirurgischen Eingriff vorzubereiten.
   2. Stellen Sie die mechanische Beatmung je nach Bedarf auf 10-15 Atemzüge pro Minute, Sauerstoff 1-4 l/min und Isofluran 1,0-3,0% ein, um eine tiefe Anästhesie für die Operation aufrechtzuerhalten. Überprüfen Sie, ob keine Augen- oder Kieferreflexe vorhanden sind, um eine tiefe Anästhesie zu bestätigen.
   3. Positionsüberwachungsgeräte (Elektrokardiogramm, CO₂ am Ende der Tidale, Herzfrequenz, Sauerstoffsättigung, Blutdruck und Temperatur) am Tier.
   4. Schließen Sie den IV-Katheter an einen Beutel mit normaler Kochsalzlösung oder Laktatringerlösung an, um kontinuierlich Erhaltungsflüssigkeiten zu verabreichen.
   5. Bereiten Sie die Haut mit aseptischer Technik mit Povidon-Jod-Peeling und -Lösung 3x vor, um eine ausreichende Sterilität zu gewährleisten und das Risiko einer Infektion an der Operationsstelle zu minimieren.
   6. Lidocain intravaskulär verabreichen (Aufsättigungsdosis von 2 mg/kg oder kontinuierliche Infusion in einer Dosis von 50 μg/kg/min), um Arrhythmien vorzubeugen.
   7. Positionieren Sie das Tier dorsal und drapieren Sie es mit sterilen Handtüchern.
   8. Führen Sie entweder die linke oder die rechte Oberschenkelarterie durch, um die arterielle Leitung durch die Seldinger-Technik zu platzieren, gefolgt von einem Anschluss des Katheters an den Schallkopf zur kontinuierlichen Blutdrucküberwachung zum Zeitpunkt der Operation.
   9. Verwenden Sie einen monopolaren Elektrokauter, um einen 20 cm langen Schnitt zu machen, der sich von der sternalen Kerbe proximal bis zum Xyphoidfortsatz distal erstreckt, und um Schichten von Muskeln, Unterhautfett und Bindegewebe bis zum Brustbein einzuschneiden.
   10. Führen Sie eine mediane Sternotomie mit einer oszillierenden Säge durch.
       HINWEIS: Die Standardsäge wird für eine wiederholte Sternotomie vermieden, da sie ein höheres Risiko für Myokardverletzungen durch frühere Perikardadhäsionen aus der linken Thorakotomie birgt, die zur Platzierung des LAD-Konstriktors durchgeführt wurde.
   11. Teilen Sie die hintere Sternumplatte mit einer Schere. Verwenden Sie einen speziellen Brustretraktor für eine angemessene Visualisierung des Mediastinums.
   12. Präparieren Sie Adhäsionen entweder mit monopolarem Elektrokauter oder der Metzenbaumschere. Präparieren Sie vorsichtig den peristernalen Muskel und das Fett, um die linke innere Brustarterie (LIMA) freizulegen.
   13. Sobald LIMA seitlich am Brustbeinrand freigelegt ist, trennen Sie es vorsichtig von der Brustwand, indem Sie es stumpf mit der Elektrokauterspitze dissektionieren. Verwenden Sie das LIMA als skelettiertes Transplantat.
   14. Beginnen Sie mit der Dissektion auf Höhe des 3^. Interkostalraums. Heben Sie den linken Sternumrand sanft an, um eine optimale Visualisierung zu erzielen.
   15. Verwenden Sie eine sanfte Traktion auf der Adventitia, um die arteriellen und venösen Äste von LIMA freizulegen. Schneiden Sie die LIMA-Seite der Äste mit Hämoclips ab und kauterisieren Sie die Brustwandseite der Äste.
       HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass der Clip am LIMA nicht verätzt wird, da dies zu einer Verengung der Leitung führen kann.
   16. Sobald ein erstes LIMA-Segment mobilisiert wurde, setzen Sie die Dissektion proximal in Richtung der Vena subclavia und distal bis zur LIMA-Bifurkation fort.
   17. Sobald die Dissektion abgeschlossen ist, verabreichen Sie Heparin intravenös in einer Dosis von 100-300 E/kg. Warten Sie 3 Minuten nach der Verabreichung des Heparins.
   18. Nach 3 Minuten das distale Ende der LIMA kurz vor der Höhe der LIMA-Gabelung abschneiden und den Kanal teilen. Nähen Sie das distale Ende mit einem kostenlosen 2-0-Seidennahtband.
   19. Bereiten Sie das proximale Ende für die Transplantation vor. Überprüfen Sie die Fließqualität visuell, indem Sie das Transplantat einige Sekunden lang bluten lassen.
   20. Klemmen Sie das distale Ende des LIMA-Schlauchs vorsichtig mit einer atraumatischen Bulldoggenklemme fest, um Blutungen zu vermeiden. Öffnen Sie das Perikard mit einem umgekehrten T und machen Sie einen etwa 5-6 cm langen Schnitt. Legen Sie Nähte der Größe 3-0 auf das Perikard, um auf beiden Seiten des Schlitzes zu ziehen.
   21. Stabilisieren Sie den LAD mit Silikon-Retraktionsbändern und Gewebestabilisator, der am Brustbein-Retraktor befestigt ist. Führen Sie eine Arteriotomie in der LAD-Arterie distal der Stenose (verursacht durch ein Constrictorband) mit einer 11-Klinge durch und verlängern Sie sie mit einer Irisschere.
   22. Platzieren Sie einen Koronarshunt in geeigneter Größe im LAD. Führen Sie die LIMA-zu-LAD-Anastomose mit 7-0 laufendem, nicht resorbierbarem Nahtmaterial unter Verwendung einer Off-Pump-Bypass-Technik durch. Lassen Sie den Bulldoggen-Okkluder auf dem LIMA los und bestätigen Sie die Hämostase.
4. Herstellung eines aus mesenchymalen Stammzellen (MSC) gewonnenen Exosomenpflasters
   1. Nach erfolgreicher Isolierung von Exosomen aus MSCs werden etwa 3 x 10⁸ Exosomen in 3 ml normaler Kochsalzlösung suspendiert und dem Kollagenschwamm hinzugefügt.
   2. 3 ml Exosomensuspension für 10 min bei Raumtemperatur bei ca. 22 °C erhitzen. 2 resorbierbare Collage-Schwämme (je 1,27 cm x 2,54 cm) in eine mittelgroße Petrischale geben.
   3. Verwenden Sie eine 5-ml-Spritze mit einer 18G-Nadel, um die Exosomensuspension vorsichtig zu mischen. Pipettieren Sie langsam 1,5 ml Suspension auf jeden Kollagenschwamm und warten Sie 5 Minuten auf die vollständige Absorption.
5. Platzierung des Exosomenpflasters
   1. Legen Sie den mit Exosomen beladenen Schwamm kopfüber auf die überwinternde Region des Herzens, die das Epikard der vorderen Septumregion in der Verteilung des LAD ist.
   2. Legen Sie vorsichtig zwei Schwämme auf die Winterschlafregion des Herzens. Verwenden Sie ein 3,5 cm x 1,0 cm großes Polyglactin-Netz, um jeden Kollagenschwamm abzudecken.
   3. Nähen Sie das Netz mit feinen 7-0 unterbrochenen Nähten auf das Epikard.
6. Platzierung der Thoraxdrainage
   1. Legen Sie eine Thoraxdrainage durch einen separaten Stichschnitt in der Nähe des unteren Aspekts des Sternotomieschnitts. Legen Sie die Thoraxdrainage vorsichtig über die vordere Seite des Herzens.
   2. Sobald der Schlauch an Ort und Stelle ist, legen Sie eine Taschenschnurnaht mit 3-0-Naht mit einem horizontalen Matratzenstich an, um den Verschluss der Wunde beim Entfernen des Schlauchs zu ermöglichen.
   3. Die Thoraxdrainage wird bis zum vollständigen Verschluss des Brustkorbs aufrechterhalten.
7. Brustverschluss
   1. Nähern Sie sich dem Brustbein mit nicht resorbierbaren Nähten mit einem Achtermuster an. Verabreichen Sie 1 mg/kg Bupivacain intramuskulär über die gesamte Länge des Einschnitts.
      HINWEIS: Es wird anstelle von Drähten Nahtmaterial verwendet, um Interferenzen mit der MRT-Bildgebung zu vermeiden.
   2. Schließen Sie Muskel- und Hautschichten auf die übliche Weise mit resorbierbarem 2-0- bzw. 3-0-Nahtmaterial.
   3. Führen Sie ein Atemanhalten und Saugen durch, um die gesamte Luft aus der Brusthöhle zu evakuieren. Überwachen Sie den Atemwegsdruck am Beatmungsgerät vorsichtig und halten Sie den Druck zwischen 15 und 22 mmHg und lassen Sie ihn frei, wenn er fertig ist.
   4. Sobald die gesamte Luft evakuiert ist, entfernen Sie die Thoraxdrainage und schließen Sie die Wunde mit der Handtaschennaht. Tragen Sie den Klebekleber topisch auf, um den Sternumschnitt abzudecken.
8. Nachsorge nach der Operation
   1. Entwöhnen Sie das Tier allmählich vom Beatmungsgerät, während der Hautschnitt geschlossen wird. Stellen Sie sicher, dass das Tier in der Lage ist, spontan zu atmen und die Reflexe zu schützen, bevor Sie das Tier von der Anästhesieausrüstung trennen.
   2. Entfernen Sie den Endotrachealtubus, nachdem Sie bestätigt haben, dass das Tier seine Atemwege schützen kann. Decken Sie den Hautschnitt mit einem sterilen und nicht haftenden Verband ab, der mit einer antibiotischen Salbe eingebettet ist, um eine Infektion an der Operationsstelle zu minimieren.
   3. Überwachen Sie weiterhin alle 15 Minuten die Vitalfunktionen wie Herzfrequenz, Atemfrequenz und Körpertemperatur, bis das Tier seine Position ohne Hilfe halten kann.
   4. Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht unbeaufsichtigt gelassen wird, bis es seinen Kopf heben und hochhalten kann und ohne Hilfe stehen kann. Meloxicam ist in einer Dosis von 0,2 mg/kg subkutan zu verabreichen, bevor das Tier in die Aufwachstation transportiert wird.
   5. Transportieren Sie das Tier zur Aufwacheinheit, wenn das Tier stabil ist. Lassen Sie den Verband an der Operationsstelle bis zum postoperativen Tag 3 auf dem Schnitt. Ersetzen Sie den Verband, wenn er verschmutzt ist.
   6. Überwachen Sie weiterhin das Ausmaß der Schmerzen, den Hautschnitt und das allgemeine Wohlbefinden des Tieres in den ersten 5 Tagen nach der Operation. Verabreichen Sie bei Durchbruchschmerzen einmal täglich eine halbe Dosis Meloxicam (0,1 mg / kg) nach Bedarf.
   7. Bringen Sie das Tier in den ersten 5 Tagen nach der Operation in Einzelhaltung, während die Schnitte(n) heilen, um das Risiko einer Infektion der Operationsstelle durch ein anderes Tier zu verringern. Bringen Sie das Tier nach 5 Tagen in die Gruppenhaltung zurück.
   8. Melden Sie alle Komplikationen oder Veränderungen des Zustands des Tieres (Fieber, Aszites, Gewichtsverlust, Appetitlosigkeit usw.) dem Tierarzt oder dem zuständigen Personal.

3. Koronarangiographie mit Femurzugang

1. Befestigen Sie das Tier auf dem OP-Tisch in der dorsalen Liege. Beginnen Sie die mechanische Beatmung mit 10-15 Atemzügen pro Minute. Stellen Sie Sauerstoff auf 2-4 l/min, Isofluran auf 1% und 4% ein, je nach Bedarf, um eine tiefe Anästhesieebene aufrechtzuerhalten.
2. Legen Sie EKG-Ableitungen an die Gliedmaße des Tieres, um den Herzrhythmus zu überwachen. Bewerten Sie das Tier auf die Tiefe der Anästhesie. Betrachten Sie das Tier als tief betäubt, wenn der Augen- oder Kieferreflex fehlt.
3. Reinigen Sie den Brust- und Halsbereich mit Povidon-Jod-Peeling und drapieren Sie das Tier anschließend mit Handtüchern.
4. Zugang zur Oberschenkelarterie über einen chirurgischen Schnitt und Freilegung der Oberschenkelarterie und -vene. Machen Sie einen 1-2 mm langen Längsschnitt mit einer Klinge Nr. 11 in der Oberschenkelarterie und kanülieren Sie die Arterie mit einer 11 Fr-Einführschleuse im Gefäßlumen.
5. Nach Erhalt des Zugangs wird der Katheter vorgeschoben, um eine Koronarangiographie durchzuführen, um die Anatomiedurchgängigkeit des LIMA-LAD-Transplantats zu beurteilen.

Results

Nach der Revaskularisation wird eine Koronarangiographie durchgeführt, um die LAD-Stenose (mehr als 80%) und die Durchgängigkeit des LIMA-LAD-Transplantats zu beurteilen (Abbildung 1). Vier Wochen nach der Revaskularisierungsoperation und dem Einsetzen des exosomenbeladenen Kollagenpflasters wird eine kardiale MRT durchgeführt, um die systolische und diastolische Funktion des Herzens in Ruhe und unter Stress mit einer niedrig dosierten Dobutamininfusion mit 5 μg/kg/min zu beurteilen. Die sys...

Discussion

Diese Studie stellt das erste Schweinemodell des chronisch ischämischen Myokards vor, in dem gezeigt wurde, dass die Behandlung mit einem MSC-abgeleiteten Exosom-beladenen Kollagenpflaster während der chirurgischen Revaskularisierung die diastolische und systolische Funktion nach inotroper Stimulation wiederherstellt, möglicherweise durch gezielte mitochondriale Erholung. Zuvor wurde gezeigt, dass in einem Großtiermodell der HIB die diastolische und systolische Funktion, gemessen durch Herz-MRT, beeinträchtigt bleibt und...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Ethibond	Ethicon	MG46G	Naht#
40 Scherklinge	Oster	078919-016-701	Entfernen Sie Haare von Operationsstellen
0 Vicryl	Ethicon	J208H	Naht
1 mL Spritze	Medtronic/Covidien	1188100777	Verabreichen Sie injizierbare Wirkstoffe
1" medizinisches Klebeband	Medline	MMM15271Z	Wunde sichern Verband und IV-Katheter
1000 ml 0,9 % Natriumchlorid	Baxter	2B1324X	IV-Ersatzflüssigkeit
12 mL Spritze	Medtronic/Covidien	8881512878	Verabreichen von injizierbaren Mitteln
18 ga-Nadeln	BD	305185	Verabreichung von injizierbaren Mitteln
20 ga-Nadeln	BD	305175	Verabreichung von injizierbaren Mitteln
20 mL Spritze	Medtronic/Covidien	8881520657	Verabreichen von injizierbaren Mitteln
2-0 Vicryl	Ethicon	J317H	Nahtmaterial
250 mL 0,9 % Kochsalzlösung	Baxter	UE1322D	Ersatz IV Flüssigkeit
3 mL Syinge	Medtronic/Covidien	1180300555	Verabreichen von Injektionsmitteln
3-0 Vicryl	Ethicon	VCP824G	Naht
36" Schlauch zur Drucküberwachung	Smith' s Medical	MX563	Connect Art.-Nr. Linie  zum Schallkopf
4,0 mm ID Endotrachealtubus	Medline	DYND43040	Etablieren Sie die Atemwege für den Winterschlaf
4-0 Tevdek II Stränge	Deknatel	7-922	Naht zur Sicherung des Constrictors um LAD
48" Schlauch zur Drucküberwachung	Smith' s Medical	MX564	Connect Art.-Nr. Linie  zum Schallkopf
500 ml 0,9 % Natriumchlorid	Baxter	2B1323Q	Arzneimittelabgabe, Nebel für das Gebläse bereitstellen Mister
6  mL Spritze	Medtronic/Covidien	1180600777	Verabreichung von injizierbaren Mitteln
6,0 mm ID Endotrachealtubus	Mallinckrodt	86049	Einrichtung der Atemwege für Revasc, MRT und Terminierung
6,5 mm ID Endotrachealtubus	Medline	DYND43065	Einrichtung eines Atemwegs für Revasc, MRT und Terminierung
6" Druckschlauchleitung	Smith' s Medical	MX560	Entnahme von Knochenmark
60 mL Spritze	Medtronic/Covidien	8881560125	Verabreichung von Injektionsmitteln
7,0 mm ID Endotrachealtubus	Medline	DYND43070	Einrichtung von Atemwegen für Revasc, MRT und Terminierung
7-0 Prolene	Ethicon	M8702	Naht
Advanced DMEM (1X)	ThermoFisher Scientific	12491023
Alkoholvorbereitungspads	MedSource	MS-17402	Hautdesinfektionsmittel
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit	Millipore Sigma	UFC910024
Anästhesiegerät	Dräger	Fabious Trio	hält Vollnarkose
aufrecht Anästhesiegerät + Beatmungsgerät	DRE Dräger - Fabius Tiro	DRE0603FT	Abgabe von Sauerstoff und Inhalationsmittel an den Patienten
Anästhesiemonitor	Phillips  Intellivue	MP70	Multiparameter für die Patientensicherheit
Arterial Line Kit	Arrow	ASK-04510-HF	Femurkatheter zur Blutdrucküberwachung
Künstliche Tränen	Rugby	0536-1086-91	Schmieren Sie die Augen, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern
Bair Hugger	3M	Modell 505	Patientenerwärmungssystem
Basispaket	Medline	DYNJP1000	Sterile Abdecktücher und Tischabdeckung
Blutentnahmeröhrchen - grüne Oberseite	Fisher Scientific	02-689-7	Sammeln von Mikrosphären-Blutproben
Gebläse Mister Kit	Medtronic/Covidien	22120	Räumt das Operationsfeld für Gefäßanastomose
BODIPY TR Ceramide	ThermoFisher Scientific	D7540
Knochenmarknadel - 25mm 15 ga IO-Nadel	Vidacare	9001- VC-005	Knochenmark sammeln
Knochenwachs	Medline	ETHW31G	Hämostase des geschnittenen Knochens
Bovie Cautery Handstück	Covidien	E2516	Blutstillung
Bupivicain	Pfizer	00409-1161-01	Lokalanästhetikum
Buprenorphin 0,3 mg/ml	Sigma Aldrich	B9275	Präoperatives Analgetikum für überlebende
Eingriffe Zelle Schaber	Corning	353085
Cephazolin 1 gr	Pfizer	00409-0805-01	Antibiotikum
Thoraxsonde	Covidien	8888561043	Evakuiert Luft aus der Brusthöhle
Cloroprep	Becton Dickenson	260815	Chirurgische Hautvorbereitung
CPT-Sonde	BD	362753	MSC-Isolierung aus dem Knochenmark
Delrin Constrictor	U of MN	Custom	made Erstellt eine Stenose von LAD
Dermabond	Ethicon	DNX12	Hautkleber
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430062
Dobutamin 12,5 mg/ml	Pfizer	00409-2344-01	Erhöht den Blutdruck und die Herzfrequenz während der zweiten Mikrosphären-Blutentnahme
EKG-Pads	DRE	1496	Überwachung des Herzrhythmus
Exosomen-depleted FBS	ThermoFisher Scientific	A2720801
Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol, steril, 10 ml	Fisher Scientific	13-675-20
Femur- und Karotis-Einführhilfe	Cordis- J& J	504606P	Femur- und Carotiskanülen
Fetales Rinderserum, hitzeinaktiviert, Gibco FBS	ThermoFisher Scientific	16140089
Flo-thru 1.0	Baxter	FT-12100	zur Anastomos LIMA to L
Flo-thru 1.25	Baxter	FT-12125	FT-12125
Flo-thru 1.5	Baxter	FT-12150	FT-12150
Flo-thru 2.0	Baxter	FT-12200	FT-12200
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Haarschneider	Oster	078566-011-002	Haare von Operationsstellen
entfernen Helistat Kollagenschwamm	McKesson	570973 1690ZZ	Schwamm zum Einbetten von Exosomen
Heparin	Pfizer	0409-2720-03	Antikoaggulans
Histologie-Tiegel	Fisher Scientific	316-154	Formalin für Gewebeproben
HyClone Charakterisiertes fötales Rinderserum (FBS)	Cytiva	SH30071.03
Hypafix	BSN Medical	4210	Sicherer Wundverband und IV-Katheter
Isofluran	Sigma Aldrich	CDS019936	Allgemeinanästhetikum - Inhalationsmittel
IV-Schlauch für Gebläse Mister	Carefusion	42493E	passt sich an IV-Flüssigkeiten für Gebläse/Mister
Jelco 18 ga IV-Katheter	an Smiths Medical	4054	IV-Zugang in Revasc, MRT und Termin
Lidocain 2%	Pfizer	00409-4277-01	Lokalanästhetikum / Antiarthym
Ligaclips	Ethicon	MSC20	Chirurgische Klammern für LIMA Takedown
Lange Klinge für Laryngoskop	DRE	12521	Ermöglicht die Visualisierung der Luftröhre für die Intubation
Meloxicam 5 mg/mL	Boehringer Ingelheim	141-219	Postoperative Analgetische
Mikrosphärenpumpe			Entnahme von Blutproben von der Femureinführung
Monopolar Cautery	Covidien	Valleylab™ FT10	Hämostase
Nanosight NS 300	Malvern Panalytical	MAN0541-03-DE
NTA 3.1.54 Software	Malvern Panalytical	MAN0520-01-DE-00
OPVAC Synergy II	Terumo Cardiovascular System	401-230	Herzpositionierer und Stabilisator
Sauerstofftank E-Zylinder	diverse	diverse	Wird für das Gebläse Mister verwendet, wenn das Anästhesiegerät keinen zusätzlichen Durchflussmesser
hat PBS, pH 7,2	ThermoFisher Scientific	20012050
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotika-Mischung	ThermoFisher Scientific	15640055
Pigtail 145 Katheter 6 Französisch	Boston Scientific	08641-41	Messung von LV-Drücken
Druckwandler	verschiedene	Muss sich an den Anästhesiemonitor anpassen Monitor	Überwachen Sie den direkten arteriellen Druck
Propofol	Diprivan	269-29	Induktionsmittel
Roncuronium	Mylan	67457-228-05	Neuromuskulärer Blocker
SR Buprenorphin 10 mg/ml	Abbott Labs	NADA 141-434	Postoperatives Analgetikum
Sterile Kochsalzlösung 20 mL	Fisher Scientific	20T700220	Spülung für IV-Katheter
Sternalsäge / Autopsiesäge	Thermo Fisher	812822	Wird verwendet, um die Brusthöhle
zu öffnen Stoppen Sie Schwänze	Smith Medical	MX5311L	2 zum Anschluss an den Schweineschwanz
Succinylcholin 20 mg/mL	Pfizer	00409-6629-02	Neuromuskuläres Blockierungsmittel
Absaugung   Schlauch	Medline	DYND50223
Saugbehälter	Medline
Operationspaket mit Brustretraktor	verschiedene	Siehe Packungsliste	Femurschnitt und mediane Sternotomie
Chirurgische Instrumente	verschiedene	Siehe Packungsliste	Femur- und Karotis-Cutdowns und Sternotomie
Chirurgischer Federclip	Applied Medical	A1801	Klemmende von LIMA nach dem Abnehmen
Spritzenpumpe	Harvard		Liefert IV Dobutamin-Infusion
SYTO RNASelect Grün fluoreszierender Zellfleck - 5 mM Lösung in DMSO	Millipore	Sigma S32703
Telazol 100 mg/mL	Fort Dodge	01L60030	Präoperatives Beruhigungsmittel
Telpha Pad	Covidien	2132	Steriler Wundverband
Timer			Zeit Entnahme von Blutproben
Total Exosome Isolation Reagenz ( aus Zellkulturmedien)	ThermoFisher	Scientific 4478359
TPP Gewebekulturflasche, T75, Filterkappe mit 0,22 μM PTFE	ThermoFisher Scientific	TP90076
Dreifache antibiotische Salbe	Johnson & Johnson	23734	Topisches
Vicryl-Netz	Wunde Ethicon	VKML	Pflaster für die Anwendung von Epikardzellen
Vortex			Mix Mikrosphären
Xylazin 100 mg/mL	Vedco	468RX	Präoperatives Beruhigungsmittel / Analgetikum