Methodenartikel

Fentanyl-Analog-Screening mit LC-TIMS-TOF MS/MS

DOI:

10.3791/65562

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8. November 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Miami-Dade County Medical Examiner Department, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine Methode zum Screening von Fentanyl-Analoga basierend auf ihrer Retentionszeit, Mobilität und massenspektrometrischen Fragmentierungsmuster.

Zusammenfassung

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Die Verwendung von Fentanyl und das Aufkommen von Fentanyl-Analoga in den letzten Jahrzehnten sind zu einem zunehmenden Problem für die Gemeinschaft insgesamt geworden. Fentanyl und seine Analoga sind die Hauptverursacher von tödlichen und nicht tödlichen Überdosierungen in den Vereinigten Staaten. Die jüngsten Fälle von Fentanyl-bedingter Überdosierung werden mit illegal hergestelltem Fentanyl und der damit verbundenen extremen Potenz in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein analytisches Hochdurchsatzprotokoll für das Screening von Fentanyl-Analoga. Der Einsatz von komplementärer Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Tandem-Massenspektrometrie ermöglicht die Trennung und Zuordnung von Hunderten von Fentanyl-Analoga aus einer einzigen Probe in einem einzigen Scan. Der beschriebene Ansatz nutzt die jüngste Entwicklung der datenabhängigen Erfassung und der datenunabhängigen Erfassung mittels paralleler Akkumulation in der Mobilitätsfalle, gefolgt von sequentieller Fragmentierung mittels kollisionsinduzierter Dissoziation. Die Fentanyl-Analoga werden auf der Grundlage ihrer Retentionszeit, ihrer Mobilität und ihres MS-Fragmentierungsmusters sicher zugeordnet.

Einleitung

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Fentanyl und seine Analoga sind die Hauptverursacher von tödlichen und nicht tödlichen Überdosierungen in den Vereinigten Staaten 1,2. Das Center for Disease Control and Prevention (CDC) berichtete, dass die Zahl der Todesfälle durch Überdosierung von synthetischen Opioiden von 2013 bis 2021 über 258.000 betrug. Allein im Jahr 2021 konnten über 68.000 Todesfälle durch Überdosierung auf synthetische Opioide zurückgeführt werden, was insgesamt 82 % aller Todesfälle im Zusammenhang mit Überdosierungen in den USA entspricht3. Seit 2013 wurden Hunderte von Fentanyl-Analoga mit unterschiedlicher Potenzidentifiziert 4. Mit dem Aufkommen illegal hergestellter Fentanyl-Analoga bleibt das synthetische Opioid der Liste II selbst das beliebteste synthetische Opioid, das in den Vereinigten Staaten erhältlich ist3. Nach Angaben des Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE) war Fluorofentanyl das am häufigsten gemeldete Fentanyl-Analogon im Jahr 2022, wobei nun in rasantem Tempo weitere synthetische Opioide, die nicht mit Fentanyl in Verbindung stehen, in den volatilen Arzneimittelmarkt eingeführt werden5.

Aufgrund der überwältigenden Menge an Fentanyl und Fentanyl-verwandten Analoga, die auf dem Drogenmarkt zirkulieren, hat die DEA ein Fentanyl-Signatur-Profiling-Programm mit dem Namen Operation Death Dragon eingeführt, um die Methodik zu verfolgen, die zur Synthese dieser Verbindungen verwendet wird, in der Hoffnung, Drogenbeschlagnahmungen mit ihrem Ursprung in Verbindung zu bringen6. Im Jahr 2018 wurden 94 % der Drogenbeschlagnahmungen als mit der Janssen-Methode synthetisiert identifiziert, während die restlichen 6 % mit der Siegfried-Methode synthetisiert wurden6. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Methoden besteht darin, dass das Fentanyl-Analogon Benzylfentanyl vorhanden ist, das bei der Janssen-Methode als Verunreinigung nachgewiesen wurde, während das Vorhandensein von Despropionylfentanyl (4-ANPP), einem Metaboliten/Vorläufer von Fentanyl, eine Verunreinigung ist, die bei der Synthese mit der Siegfried-Methodenachgewiesen wurde 7.

Der Einsatz von Gas- und Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (GC-MS bzw. LC-MS) zum gezielten Screening und zur Quantifizierung von synthetischen Opioiden wird in toxikologischen Laboratorien regelmäßig umgesetzt. GC-MS gilt als Goldstandard für den Nachweis von Drogenmissbrauch in biologischen Proben. Der Zugang zu öffentlich zugänglichen Massenspektralbibliotheken8 und Instrumenten, die als Plug-and-Play-Systemevermarktet werden 9, sind einige Gründe, warum GC-MS ein integraler Bestandteil in Laboratorien geblieben ist, sowohl für ein umfassendes Screening als auch für eine gezielte Quantifizierung 9,10. Die derzeitigen GC-MS-Quantifizierungsmethoden in der Literatur haben jedoch tendenziell einen begrenzten Umfang an Analyten11 und sind schnell veraltet und auf die aktuelle Fallarbeit nicht anwendbar. Noch wichtiger ist, dass die Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen nicht mit LC-MS-Methoden vergleichbar sind (< 1 ng/ml)12, was das Potenzial für falsch-negative Ergebnisse erhöht. Ein solcher Vergleich zwischen GC-MS und LC-MS, bei dem postmortale Proben untersucht wurden, ergab, dass von 134 positiv identifizierten Fällen von Carfentanil, einem der bisher stärksten synthetischen Opioide, 104 Fälle mit GC-MS13 negativ auf Carfentanil untersucht wurden. In Arzneimittelanalyselaboren wird GC-MS aufgrund der hohen Konzentration der analysierten Proben häufiger eingesetzt und ist für synthetische Opioide geeignet. Dennoch wird GC-MS immer noch in Verbindung mit zusätzlichen Techniken wie der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) und der Rasterelektronenmikroskopie (REM) zur Bestätigung dieser Verbindungen eingesetzt14. Die Anwendung der GC-MS auf die Analyse biologischer Proben in der forensischen Toxikologie erfordert Probenvorbereitungsmethoden, die die Extraktion dieser Verbindungen entweder durch Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) oder Festphasenextraktion (SPE) umfassen15. LLE kann mit einer Vielzahl von Lösungsmitteln durchgeführt werden, aber in einem Hochproduktionslabor ist LLE möglicherweise nicht kosteneffizient oder zeitaufwändig. LLE verbraucht große Mengen an Lösungsmitteln sowie Probenvolumen, während die Alternative, SPE, automatisiert werden kann und ein Mindestprobenvolumenvon 16 erfordert. Eine kürzlich durchgeführte GC-MS-Studie berichtete über die Trennung von 20 verschiedenen isomeren Fentanyl-Analoga unter Verwendung von drei separaten GC-Wärmeprogrammen17. Während die Baseline-Trennung zwischen den Isomeren erfolgreich war, ist die Anwendbarkeit dieser Methode auf relevante forensische Fälle und Arbeitsabläufe begrenzt.

LC-MS hat in forensischen Tests an Popularität gewonnen, insbesondere aufgrund der Einschränkungen von GC-MS bei nichtflüchtigen und wärmeempfindlichen Verbindungen18,19. LC-MS-Screenings unter Verwendung von Triple-Quadrupolen (QQQ) und Ionenfalleninstrumenten haben sich als erfolgreich beim Nachweis synthetischer Opioide in niedrigen Konzentrationen (<1 ng/ml) erwiesen12,20,21,22,23,24. In der Regel werden diese LC-MS-Methoden als sekundäre Bestätigungsmethoden verwendet, um die Ergebnisse von Immunoassays und/oder GC-MS zu ergänzen. Im Jahr 2017 entwickelten Shoff et al. vom Toxikologielabor des Miami-Dade County Medical Examiner Department (MDME) eine umfassende Screening-Methode für 44 opioidverwandte Verbindungen unter Verwendung der Ultrahochdruckflüssigkeitschromatographie (UHPLC)-Ionenfalle-MSn 13. Ähnlich wie bei gezielten MRM-Methoden wurde bei dieser Ionenfallenmethode eine geplante Vorläuferliste (SPL) verwendet, die Retentionszeiten, Vorläuferzielionen sowie primäre Tochterionen für die spektrale Fragmentierung von MS3 enthält, sofern dies möglich ist. Was diese Screening-Methode von Methoden unterscheidet, die an Triple-Quadrupolen und linearen Quadrupol-Ionenfallen entwickelt wurden, sind die zusätzlichen Details, die in den Spektraldaten enthalten sind. Was diese Screening-Methode nicht bieten kann, ist die quantitative Analyse, die bei Ionenfallen-Instrumenten selten entwickelt wird, sowie die Identifizierung von Unbekannten13. LC-QQQ-Methoden für synthetische Opioide können gleichzeitig eine vordefinierte Zielliste screenen und quantifizieren. Die Verwendung von MRM-Übergängen (Multiple Reaction Monitoring) zur Identifizierung und Quantifizierung von Verbindungen ist eine vertrauenswürdige Datenerfassungstechnik und die in der Literatur am häufigsten verwendete Technik zum Nachweis synthetischer Opioide 12,20. Die berichteten linearen Bereiche für die Quantifizierung einer Reihe von synthetischen Opioiden reichen von 0,01 bis 100 ng/ml, wobei wirksamere synthetische Opioide wie Carfentanil im Sub-ng/ml-Bereich1 1,24,25,26,27 nachgewiesen wurden.

Die Trennung von isomeren synthetischen Opioiden wurde in LC-MS-Methoden untersucht. Ein solches Verfahren trennte 174 isomere Fentanylanaloga innerhalb einer Laufzeit von 16 Minuten unter Verwendung einer Biphenylsäule28. Darüber hinaus führen Schwankungen bei LC-abhängigen Parametern wie Säuleneffizienz, pH-Wert der mobilen Phase und Druckänderungen zu Retentionszeitverschiebungen, die in gezielten Assays mit konsistenter Überwachung und größeren Sammelfenstern (>0,4 min) berücksichtigt werden müssen, was zu einer möglichen Überlappung dieser nach aufgelösten Isomere führen kann. Zusätzliche chromatographische Techniken zur Trennung von Isomeren wurden untersucht, einschließlich der Verwendung der 2-dimensionalen Flüssigkeitschromatographie (2D-LC)29; Und obwohl diese Technik in der Lage ist, eine orthogonale Trennung von Verbindungen zu ermöglichen, überwiegen die Nachteile die Vorteile, einschließlich übermäßiger Laufzeiten, Kosten, Schwierigkeiten bei der Methodenentwicklung und Nützlichkeit im Vergleich zu alternativen Trennungen30.

Die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) wird bei der Identifizierung von synthetischen Opioiden immer zuverlässiger. Mehrere Instrumentierungsunternehmen haben zielgerichtete Methoden vermarktet, die zum Zwecke der Identifizierung eines breiten Spektrums synthetischer Opioide in komplexen biologischen Matrices entwickelt wurden 19,28,31. Diese Methoden können, im Gegensatz zu den zuvor diskutierten Methoden, analytische Daten für eine rückwirkende Analyse speichern. So können Proben, die zuvor mit unbestimmten Ergebnissen analysiert wurden, später erneut besucht werden, um neu identifizierte Verbindungen zu entdecken. Was HRMS von QQQ unterscheidet, ist die genaue Massenidentifizierung. Während beide MS-Techniken bei niedrigen Konzentrationen genau quantifizieren können, hat sich HRMS als wirksamer für das erste Screening und die Entdeckung unbekannter Verbindungen erwiesen 32,33,34. HRMS, insbesondere mit Time-of-Flight-MS-Analysatoren (TOF), war führend bei der NPS-Entdeckung und ermöglichte es forensischen Testlabors, zeitkritische Daten über neue Verbindungen sowohl an die Strafverfolgungsbehörden als auch an die wissenschaftliche Gemeinschaft zu liefern, um die Verbreitung einiger dieser Verbindungen zu skalieren und gleichzeitig das Bewusstsein und die Aufklärung zu erhöhen33. Die Verwendung von TOF zum Nachweis von Drogenmissbrauch ist äußerst umfassend geworden, mit Methoden, die mehr als 600 Verbindungen enthalten, die innerhalb eines 10-minütigen chromatographischen Programms getrennt werden. In früheren Studien wurde über die Vorteile der Mobilitätsspektroskopie gefangener Ionen (TIMS) in Verbindung mit TOF zum Nachweis und zur Trennung von isomeren Opioiden berichtet35.

Unter Ausnutzung der Orthogonalität zwischen Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Massenspektrometrie bietet die vorgestellte Methode eine umfassende Charakterisierung von Fentanylanaloga auf der Grundlage der Retentionszeit, des Isotopenmusters, der Mobilität und des Fragmentierungsmusters.

Protokoll

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1. Vorbereitung der Probe

  1. Lagern Sie das analoge Fentanyl-Screening-Kit bei -20 °C, sobald es erhalten wurde. Jede Probe wird durch Zugabe von 500 μl reinem Methanol in LC/MS-Qualität auf eine Endkonzentration von 400 μg/ml resuspendiert.
  2. Mit einem Tellermischer oder Vortexer bei 400 U/min für 1 h oder 15 min bei mittlerer Geschwindigkeit vortexen. Nach der Resuspension sind die Fläschchen bei -20 °C zu lagern.
  3. Verdünnen Sie jeden Standard auf eine Endkonzentration von 1 ng/ml mit reinem Methanol in LC/MS-Qualität.
  4. Gruppieren Sie die Standards in Gruppen, so dass jede Gruppe keine isomeren Standards enthält. In der ergänzenden Tabelle 1 ist die Aufschlüsselung der 14 Gruppen von Fentanyl-Standards zu finden.

2. Vorbereitung der mobilen HPLC-Phasen

  1. Bereiten Sie die mobile Phase A (MPA) unter Verwendung von 5 mM/L Ammoniumformiat (NH4HCO2) in H2O mit 0,05 % Ameisensäure (85 %) vor.
    1. 0,078 g NH4HCO2 abwiegen, in einen 250 mL Messkolben füllen und zu etwa 2/3% mit Wasser auffüllen. Schwenken, um es gut zu vermischen.
    2. Sobald es vollständig aufgelöst ist, fügen Sie 0,125 ml Ameisensäure (85%) hinzu. Bis zur Fülllinie (250 mL) mit Wasser auffüllen und mischen.
  2. Bereiten Sie die mobile Phase B (MPB) mit 0,05 % Ameisensäure in einem 1:1-Methanol-Acetonitril-Gemisch vor.
    1. 125 ml Acetonitril werden in einen Messkolben gegeben und Methanol bis zur Fülllinie zugegeben.
    2. Schwenken, um es gut zu vermischen. 0,125 ml 0,05%ige Ameisensäure in den Kolben geben und zum Homogenisieren mischen.

3. Entwicklung von HPLC-Methoden

  1. Öffnen Sie die LC-Software auf dem Startbildschirm. Erstellen Sie in der Beispieltabelle in der Mitte des Fensters ein neues Protokoll.
    1. Beschriften Sie die Fläschchensäule mit der Probenposition. Versehen Sie die Spalte mit der Beispiel-ID im Format YYYYMMDD_NAME (repräsentativer Deskriptor). Versehen Sie die Volumenspalte mit dem gewünschten Injektionsvolumen (15 μL).
  2. Versehen Sie die Spalte mit dem Datenpfad mit dem Speicherort, an dem die Daten gespeichert werden.
  3. Eingabe der HPLC-Methode
    1. Wählen Sie Neu aus der Leiste in der Beispieltabelle in der Mitte des Bildschirms aus. Wählen Sie unter der Trennmethode den Dropdown-Pfeil aus und klicken Sie im Popup-Fenster auf Neue Methode .
    2. Es öffnet sich ein neues Fenster mit der Bezeichnung Trennmethode, bearbeiten Sie hier die Erfassungszeit oder die Systemmethode des Instrument Control Framework (ICF).
    3. Doppelklicken Sie auf die Schaltfläche Edit Method für das ICF-System, um das Popup zu öffnen und den binären Gradienten zu bearbeiten, wie in Abbildung 1 zu sehen ist.
    4. Auf der Registerkarte "Binärer Gradient" befindet sich auf der linken Seite eine visuelle Darstellung des Gradienten und auf der rechten Seite die Aufschlüsselung des Gradienten. Legen Sie die Zeitstempel, die Durchflussrate und die MPA- und MPB-Konzentrationen fest.
    5. Stellen Sie sicher, dass die Stoppzeit auf 18 min, die Durchflussrate auf 0,400 mL/min und die Druckgrenze min und max auf 0 psi und 6000 psi eingestellt ist.
    6. Legen Sie die Zeitstempelkonzentrationen wie folgt fest:
      Bei 0.00 min die B-Konzentration auf 20.00 einstellen.
      Bei 1.50 min die B-Konzentration auf 25.0 einstellen.
      Bei 3.00 min die B-Konzentration auf 27,0 einstellen.
      Bei 6.00 min die B-Konzentration auf 27,0 einstellen.
      Bei 6.50 min die B-Konzentration auf 30,0 einstellen.
      Bei 7.00 min die B-Konzentration auf 95,0 einstellen.
      Bei 16.00 min die B-Konzentration auf 95,0 einstellen.
      Bei 16.50 min die B-Konzentration auf 20,0 einstellen.

4. Initialisierung der HPLC

  1. Setzen Sie im Bereich HPLC-Säule die LC-Säule (monolithische C18-HPLC-Säule 100 mm x 4,6 mm) und die Säulenschutzgitter (Vorsäule 5 mm x 4,6 mm) ein. Achten Sie auf den minimalen und maximalen Säulendruck.
  2. Führen Sie eine Stichprobe (dieselbe Pufferlösung) aus, um auf Lecks zu testen und eine Baseline zu erstellen. Suchen Sie nach Lecks. Leckagen konnten durch Druckschwankungen in der Säule beobachtet werden. Wenn es Lecks gibt, ermitteln Sie, woher sie kommen könnten, und ziehen Sie die Verbindungen fest.
  3. Führen Sie einen Beispiel-Rohling (gleiche Pufferlösung) mit dem gewünschten LC-Programm aus, um die Spalte vorzukonditionieren.

5. Entwicklung der timsTOF MS/MS-Methode

  1. Öffnen Sie die timsControl-Anwendung. Auf der linken Seite des Fensters befinden sich die MS- und TIMS-Einstellungen.
    1. Stellen Sie in den MS-Einstellungen den Scanbeginn und das Ende auf 50 m/z bzw. 1800 m/z ein. Wählen Sie den positiven Modus für die Ionenpolarität und wählen Sie parallele Akkumulation-serielle Fragmentierung für den Scan-Modus.
    2. Stellen Sie unter TIMS-Einstellungen den Modus auf benutzerdefiniert, 1/K0 Start auf 0,40 Vs/cm2, 1/K0 Ende auf 1,85 Vs/cm2, Rampenzeit auf 150,0 ms und MS-Mittelwertbildung auf 1 ein.
  2. Nehmen Sie in der unteren Auswahl der Registerkarten unter Quelle die folgenden Änderungen in den beiden Einstellungsfeldern vor.
    1. Stellen Sie in der Quelle den Versatz der Endplatte auf 500 V, die Kapillare auf 4500 V, den Zerstäuber auf 3,0 bar, das Trockengas auf 10,0 l/min und die Trockentemperatur auf 200 °C ein.
    2. Stellen Sie in den Einstellungen der Spritzenpumpe sicher, dass die Spritze Hamilton 1 ml hat, aktiv aktiviert ist und die Durchflussrate auf 80,0 μl/h eingestellt ist.
  3. Nehmen Sie auf der Registerkarte "Tune" die folgenden Änderungen in den Einstellungsregisterkarten für "Allgemein", "Verarbeitung" und "TIMS" vor.
    1. Richten Sie auf der Registerkarte "Allgemeine Einstellungen" die folgenden Abschnitte ein: "Übertragung", "Kollisionszelle", "Quadrupol", "Fokus vor TOF" und "Erkennung".
      1. Stellen Sie in den Übertragungseinstellungen die Auslenkung 1 Delta auf 70,0 V, den Trichter 1 RF auf 341,0 Vpp, die CID-Energie auf 0,0 eV, den Trichter 2 RF auf 300,0 Vpp, die Multipol-HF auf 300,0 Vpp ein.
      2. Stellen Sie sicher, dass in den Einstellungen der Kollisionszelle die Kollisionsenergie auf 6,0 eV und die Kollisions-RF auf 1200,0 Vpp eingestellt ist.
      3. Bei den Quadrupol-Einstellungen ist sicherzustellen, dass die Ionenenergie auf 6,0 eV und die geringe Masse auf 250,00 m/z eingestellt ist.
      4. Stellen Sie bei den Einstellungen für die Fokus-Vor-TOF die Übertragungszeit auf 75,0 μs und die Speicherung vor dem Impuls auf 5,0 μs ein.
    2. Richten Sie auf der Registerkarte "Verarbeitungseinstellungen" die folgenden Abschnitte ein: Massenspektren-Peak-Erkennung und Mobilitäts-Peak-Erkennung.
      1. Deaktivieren Sie in den Einstellungen für Massenspektren-Peaks die Auswahl der Summe der Intensitäten (Bereich) und setzen Sie den absoluten Schwellenwert auf 667.
    3. Richten Sie auf der Registerkarte TIMS die folgenden Abschnitte ein: Offsets, Ionenänderungssteuerung und erweiterte Parameter.
      1. Stellen Sie bei der Offset-Einstellung Δt1 auf -20,0 V, Δt2 auf -100,0 V, Δt3 auf 40,0 V, Δt4 auf 80,0 V, Δt5 auf 0,0 V, Δt6 auf 120,0 und die Kollisionszelle auf 250,0 V ein.
      2. Klicken Sie unter den Einstellungen für die Ionenladungskontrolle auf das Kästchen, um die Zielintensität zu aktivieren und auf 5,00 M einzustellen.
      3. Aktivieren Sie unter den erweiterten Parametern die Akkumulation der Sperre auf den Mobilitätsbereich.
  4. Stellen Sie auf der Registerkarte MS/MS den Scan-Modus auf parallele Akkumulation-Serielle Fragmentierung ein und richten Sie die folgenden Abschnitte ein: Vorläuferionen, Zeitplanung, aktiver Ausschluss, Einstellungen für Kollisionsenergie, Einstellungen für die Isolationsbreite und TIMS-Stepping.
    1. Legen Sie unter Vorläuferionen die Anzahl der parallelen Akkumulations-Reihen-Fragmentierungsrampen auf 8, die minimale Ladung auf 1 und die maximale Ladung auf 5 fest.
    2. Aktivieren Sie in den Planungseinstellungen die Vorläuferwiederholungen. Aktivieren Sie unter Aktiver Ausschluss das Kontrollkästchen, um die Freigabe zu aktivieren und auf 0,40 Minuten danach festzulegen.
    3. Passen Sie die Einstellungen für die Kollisionsenergie und die Isolationsbreite nicht an. Klicken Sie auf das TIMS-Schrittfeld , um es zu aktivieren.

6. Mobilität und Massenkalibrierung

  1. Führen Sie eine Kalibrierung sowohl für den M/Z- als auch für den Mobilitätsbereich durch. Wählen Sie unter den m/z-Kalibrierungseinstellungen eines der vorinstallierten Tuning-Mix-Profile in der Referenzliste aus, die im Dropdown-Menü angezeigt wird.
  2. Zur Kalibrierung die Spritze für den TOF mit einer Tuning-Mix-Lösung befüllen. Verwenden Sie auf der rechten Seite des Fensters die Einstellungen mit dem Titel Kalibrierungsmodus für die verschiedenen Kalibrierungstypen, die so eingestellt werden sollen, dass die höchste Punktzahl erreicht wird.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Punktzahl so nah wie möglich an 100 % liegt. Wechseln Sie zwischen linear, quadratisch und erweitert, um die beste Punktzahl zu erzielen.
  4. Kalibrieren Sie die Mobilität gemäß den Schritten 6.1-6.3, die für die Kalibrierung von m/z verwendet werden.
  5. Speichern Sie nach der Kalibrierung die MS-Methode, indem Sie in der oberen Leiste die Registerkarte Methode auswählen. Wählen Sie im Dropdown-Menü Speichern unter aus, um eine neue MS-Methodendatei zu generieren.

7. Erstellung einer datenunabhängigen Erfassung (dia) Methode der parallelen Akkumulation und seriellen Fragmentierung

  1. Sobald ein Datensatz im Rahmen der datenabhängigen Erfassung (dda) parallele Akkumulation und serielle Fragmentierung gesammelt wurde, führen Sie die Experimente in dia durch. Öffnen Sie die Softwareanwendung ion mobility und laden Sie die in Schritt 6.5 gespeicherte dda-Methode.
  2. Lassen Sie alle Einstellungen gleich, außer für die MS-Einstellung, ändern Sie diese von paralleler Akkumulation-serieller Fragmentierung zu diaparalleler Akkumulation-serieller Fragmentierung.
  3. Wählen Sie am unteren Rand des Fensters die Registerkarte MSMS aus, und klicken Sie dann auf Fenstereditor , um das in Abbildung 2 gezeigte Fenster-Popup zu öffnen.
  4. Laden Sie den zuvor gespeicherten dda-Datensatz (.m-Datei) über die Schaltfläche "Analyse öffnen", die sich oben im Popup-Fenster befindet.
  5. Unten links wird eine Heatmap angezeigt, in der Fenster mit einem Polygon von Fenstern angezeigt werden, die diagonal über das Diagramm verlaufen. Klicken und ziehen Sie, um die Größe des Polygons so zu ändern, dass es in die Daten in der Heatmap passt (Ecken können durch Doppelklick auf die Seitenlinien ausgewählt werden, es erscheint ein Punkt, der gezogen und in der Größe geändert werden kann).
  6. Rechts neben den Fenstern befinden sich die Fenstereinstellungen. Stellen Sie die Massenbreite (50 ist Gehe zu) und die horizontale Überlappung ein, beides in Da.
  7. Legen Sie die Anzahl der Mobilitätsfenster pro Masse, Breite und vertikale Überlappung fest.
  8. Klicken Sie unten rechts im Popup-Fenster auf Fenster berechnen , um die Fenster mit den neuen Einstellungen anzuzeigen. Sobald dies geeignet ist, klicken Sie auf Dia-PASEF Windows auf Methode anwenden. Dadurch wird das Popup geschlossen und es wird wieder auf dem Startbildschirm angezeigt.

8. HPLC-Ionenmobilität TOF-Datenverarbeitung

  1. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware. Klicken Sie in der oberen linken Ecke auf die Registerkarte Datei und wählen Sie Öffnen aus der Dropdown-Liste. Wählen Sie im Fenster "Neue Dateien" die gewünschten Dateien aus und klicken Sie auf "Öffnen".
  2. Überprüfen Sie die Kalibrierung. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dateinamen unter dem Analysefeld und wählen Sie Eigenschaften. Ein Fenster mit der Bezeichnung Datei name_analysis Eigenschaften wird angezeigt. Wählen Sie Kalibrierungsstatus aus.
  3. Wählen Sie im Dropdown-Feld die Option Instrumentenkalibrierung für das Massenspektrometer aus. Vergewissern Sie sich, dass der Fehler nicht größer als 1 μg/ml ist. Wählen Sie Initial Mobility Calibration (Initiale Mobilitätskalibrierung) und bestätigen Sie, dass der Fehler nicht größer als 1 μg/ml ist.
  4. Bereiten Sie ein Chromatogramm in der Datenanalysesoftware vor, wie unten beschrieben.
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Chromatogramm unter dem Dateinamen und wählen Sie Chromatogramm bearbeiten. Klicken Sie unter Typ auf das Dropdown-Feld und wählen Sie Extrahiertes Ionenchromatogramm aus.
    2. Wählen Sie unter Filter die Option Alle MS und im Scanmodus Alle aus. Dies dient dazu, die Peaks für das interessierende Molekül und nicht nur seine Fragmente zu betrachten.
    3. Darunter suchen Sie nach den beiden Filteroptionen für die Molekülauswahl: Massen oder Formel, die blau hervorgehoben sind.
    4. Wenn Sie Massen verwenden, um ein Ion zu extrahieren, fügen Sie die theoretische m/z des interessierenden Moleküls ein. Für diesen Fall wählen Sie (Masse für repräsentatives Ergebnis) m/z.
    5. Wenn Sie eine Formel zur Extraktion eines Ions verwenden, geben Sie die Formel für das Molekül sowie die für das Chromatogramm interessierenden Ionenformen ein. Wählen Sie in diesem Fall das protonierte Ion [M+H]+ aus.
    6. Stellen Sie die Polarität auf den positiven Modus.
  5. Massenspektrum
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Grundlinie des Peaks des Compounds und ziehen Sie ihn an den anderen Rand des Peaks. Dadurch entsteht innerhalb dieser Retentionszeit ein Massenspektrum von Fragmenten.
  6. Generierung des Mobilogramms
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die linke Registerkarte mit dem Titel Mobilogramm und wählen Sie Mobilogramm bearbeiten. Ein Fenster mit dem Titel "Mobilogramm-Traces bearbeiten" wird angezeigt. Führen Sie die Schritte 8.4.2-8.4.7 aus, um das Chromatogramm zu bearbeiten.
    2. Fügen Sie in der Eingabe für die Retentionszeit den Retentionszeitbereich des Peaks of Interest hinzu.
    3. Sobald die Parameter ausgewählt sind, klicken Sie auf Hinzufügen und dann auf OK oben rechts im Fenster zum Bearbeiten von Mobilogramm-Traces.
    4. Nach kurzer Zeit verarbeitet die Software die gewünschte Auswahl und gibt ein Chromatogramm aus. Die Schritte 8.6.1 bis 8.6.3 werden für alle Ionen in der Mischung wiederholt.
    5. Erzeugung der Verbindungsspektren
      1. Wählen Sie unten im Fenster der Spektrumansicht die Option "Profil MS und Fragment MS" aus. Dies wird es ermöglichen, Ionen aus dem Vollscan und PASEF einzubeziehen.
      2. Klicken Sie in der Spektrumansicht mit der rechten Maustaste und wählen Sie Zusammengesetzte Spektren kopieren. In den Spektraldaten, die auf der rechten Seite angezeigt werden, finden Sie weitere Informationen über die Verbindung, z. B. Auflösungsvermögen, Intensität und Signal-Rausch-Verhältnis (S/N).
    6. Datenverarbeitung
      1. Um die Daten zu verarbeiten, müssen Sie das Chromatogramm und die Mobilitätsspitzen manuell integrieren, um wichtige Informationen über das interessierende Molekül zu erhalten.
      2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Suchen und wählen Sie Nur Chromatogramm oder Mobilogramm integrieren . Klicken Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie, um den gewünschten Gipfel zu markieren. Es werden die Informationen angezeigt, die die Verweildauer, die Fläche, die S/N und die Mobilität umfassen.

Ergebnisse

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Das Fentanyl-Analog-Screening-Kit mit 250 Analoga-Standards wurde in 14 Gruppen unterteilt: 12 Gruppen mit 17 Analoga und 2 Gruppen mit 16 Analoga, um m/z-Interferenzen zu vermeiden. Jedes Analogon zeichnet sich außerdem durch sein m/z-, Retentionszeit- (RT), Mobilitäts- (K) und MS/MS-Fragmentierungsmuster aus.

Beispiele für isomere Trennungen sind in Abbildung 3 und Abbildung 4 für die chemische Formel C22H28N2O2 bzw. C21H28N2OS dargestellt.

Das Fentanyl-Analog-Screening-Kit enthält vier Isomere mit der chemischen Formel C22H28N2O2 (siehe Abbildung 3). Die Inspektion von Abbildung 4 zeigt das [M+H]+ extrahierte Ionenchromatogramm, die Mobilogramme, das Isotopenmuster und das MS/MS-Fragmentierungsmuster. Das Methoxyacetyl-Fentanyl und das Fentanylcarbamat trennen sich in den LC- und Mobility-Domänen gut von den para-Methoxyacetyl-Fentanyl und B-Hydroxyl-Fentanyl. Eine klare Trennung zwischen dem para-Methoxyacetyl Fentanyl und dem B-Hydroxyl Fentanyl wird jedoch durch deren Fragmentierungsmuster erreicht.

Das Fentanyl-Analog-Screening-Kit enthält drei Isomere mit der chemischen Formel C21H28N2OS. Die Inspektion von Abbildung 4 zeigt das [M+H]+ extrahierte Ionenchromatogramm, die Mobilogramme, das Isotopenmuster und das MS/MS-Fragmentierungsmuster. Das a-Methylthiofentanyl und das (±)-trans-3-methylthiofentanyl trennen sich in der LC-Domäne, aber nicht in der Mobilitätsdomäne. Darüber hinaus trennen sich (±)-trans-3-methylthiofentanyl und (±)-cis-3-methylthiofentanyl in der Mobilitätsdomäne und nicht in der LC-Domäne. Dies zeigt die Komplementarität der Trennung von LC und Mobilität, die die Identifizierung der isomeren Spezies durch die Orthogonalität der Domänen verbessert. Abbildung 4D fasst dieses Ergebnis zusammen, das LC und Mobilität liefern.

figure-results-1
Abbildung 1: Gradientenrampe in der Software. Der Methodendialog des ICF-Systems gradient die Zeitpunkte, die während der Trennung angewendet werden, abhängig vom prozentualen Anteil der B-Konzentration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: dia-PASEF-Fenstereinstellungen. Bei dia-PASEF MS-Methoden sind die MS/MS-Einstellungen eindeutig. Das Diagramm auf der linken Seite zeigt die Fensterpolygone, die aus den in der Methode dda-PASEF aufgezeichneten Daten angepasst wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Typisches extrahiertes Ionenchromatogramm, extrahiertes Mobilogramm und amplifizierte MS-Projektion für isomere Opioide. (A) Strukturen von Methoxyacetylfentanyl, para-Methoxyacetylfentanyl, β-Hydroxyfentanyl, Fentanylcarbamat und die jeweilige (B) typische Retentionszeit, (C) typische Mobilität, (D) isomeres Signal, (E) Hauptfragmente und (F) Darstellung der Fragmentierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Typische extrahierte Ionenchromatogramme und extrahierte Mobilogramme für isomere Opioide. (A) Strukturen von α-Methylthiofentanyl, (±)-trans-3-methylthiofentanyl und (±)-cis-3-methylthiofentanyl. Für die jeweiligen Isomere (B) typische Retentionszeit, (C) typische Mobilität, (D) Orthogonalität zwischen Retentionszeit und Mobilität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Gemischgruppen. In dieser Tabelle ist aufgeführt, welche Opioide in jeder der 14 Mischungen enthalten sind, die für dieses Verfahren hergestellt wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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Die analytische Trennung von biologischen Proben mit hohem isomerem Gehalt kann analytisch eine Herausforderung darstellen. In dieser Arbeit zielt die beschriebene Methode darauf ab, 29 Isomerensätze zu charakterisieren, für insgesamt 185 Analoga aus einem 250 Opioid-Standardkit. Bei der Vorbereitung der Testgruppe ist darauf zu achten, dass es keine zwei Analoga mit m/z gibt, die experimentell nicht unterschieden werden können. Die hier beschriebenen Daten verwenden Standards, die nicht aus einer humanbasierten Matrix stammen, wenn diese Methode in einem Feldexperiment verwendet werden soll; Zusätzliche Versuche mit der interessierenden Matrix sind notwendig, um die Anwendbarkeit der Methode sicherzustellen. Die Matrix könnte dazu führen, dass die Analyten anders ionisieren als in einem matrixfreien Experiment, so dass es zwingend erforderlich ist, zu bestimmen, welche vorherrschenden Ionenformen beobachtet werden. Bei der Analyse basiert die Identifizierung auf den Isotopenmustern der am häufigsten vorkommenden Formen (z. B. [M+H]+1 und [M+Na]+1).

Die Wahl des LC-Programms ist entscheidend in Fällen, in denen die Isomere im Mobilitätsbereich nicht getrennt sind. Durch Verringern der Steigung des Gradienten kann die Spezifität der Methode erhöht werden, indem die Differenz zwischen den chromatographischen Peaks vergrößert wird.

Bei der Datenanalyse ist es wichtig, dass nicht-relevante Signale bei der Bestimmung der Retentionszeit und Mobilität ignoriert werden. Die Vorteile von HRMS ermöglichen schmale m/z-Fenster (typische Massenauflösung von ~50.000) mit zusätzlicher Mobilitätsfilterung, wodurch das chemische Rauschen reduziert wird.

Die hier beschriebene Methode stellt eine Referenzbibliothek für das Screening auf Fentanyl-Analoga aus einer unbekannten Probe dar. Die berichteten RT-, K-, Isotopen- und MS-Fragmentierungsmuster werden als Qualifikatoren während der Datenverarbeitung und der unbekannten Zuordnung verwendet. Im Vergleich zur herkömmlichen MRM LC-QQQ-Analyse sind zwar ähnliche LOD erreichbar 13,19,27, der einzigartige Vorteil besteht jedoch darin, nach alternativen Opioiden zu suchen, die nicht in der mit dem FID-Kit generierten Datenbank enthalten sind. Jedes neue Opioid erfordert die Analyse mit einem synthetischen Standard für seine endgültige Validierung.

Offenlegungen

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Matthew Willetts und Melvin A. Park sind Mitarbeiter von Bruker Daltonics Inc., dem Hersteller des kommerziellen Instruments timsTOF Pro2. Alle anderen Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

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Der Autor bedankt sich für die anfängliche Unterstützung von Dr. Cesar Ramirez bei der Entwicklung der ersten Methoden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ammoniumformiat für HPLCFluka17843-50G
Eppendorf  Snap-Cap Mikrozentrifuge Safe-Lock RöhrchenFisher05-402-25
ESI-L Tuning-Mix mit niedriger KonzentrationAgilentG1969-85000
Fentanyl Analog Screening (FAS) Kit Cayman Chemical9003237, 9003286, 9003380, 9003381Kit mit 250 snthetischen Opioiden, 210 Fentanyl-Analoga, aufgeteilt in ein Kit und emergent panel Versionen 1-4
Ameisensäure Optima LC/MSFisherA117-50
Onyx Vorsäule (5 x 4,6 mm)PhenomenexCHO-7649Vorsäule für C18-Säulen
Monolithische Onyx C18 HPLC-Säule (100 x 4,6 mm)PhenomenexCHO-7643Umkehrphase C18 LC-Säule
Acetonitril in Optima-QualitätFisherA996-4
Methanol in Optima-QualitätFisherA454-4
Wasser in Optima-QualitätFisherW7-4
PipetteFisher05-719-510Set mit 1-10 & Mikro; L, 10-100 & Mikro; L und 100-1000 & Mikro; L Pipette
Pipettenspitzen 10µ LFisher94060100
Pipettenspitzen 1000µ LFisher94056710
Pipettenspitzen 200µ LFisher94060310
TellermischerIKA MS 3 D S1IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE ultraschneller FlüssigkeitschromatographShimadzu, Japanausgestattet mit DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF ProBruker Daltonics Inc., Billerica, MAtimsTOF-Instrument mit PASEF 

Referenzen

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Fentanyl Analog ScreeningLC TIMS TOF MSTandem Mass SpectrometryLiquid ChromatographyIon Mobility SpectrometryData Dependent AcquisitionData Independent AcquisitionCollision Induced DissociationIsomer DifferentiationHigh Throughput Screening

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