Methodenartikel

Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

DOI:

10.3791/65573

⸱

14. Juli 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die konventionelle Knochenregenerationstherapie mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) ist bei Knochendefekten, die größer als die kritische Größe sind, schwierig anzuwenden, da sie keinen Mechanismus zur Induktion der Angiogenese hat. Die Implantation von künstlichem Knorpelgewebe, das aus MSCs hergestellt wird, induziert die Angiogenese und Knochenbildung in vivo durch endochondrale Ossifikation (ECO). Daher könnte dieser ECO-vermittelte Ansatz in Zukunft eine vielversprechende Knochenregenerationstherapie sein. Ein wichtiger Aspekt der klinischen Anwendung dieses ECO-vermittelten Ansatzes ist die Erstellung eines Protokolls zur Vorbereitung von genügend Knorpel für die Implantation zur Reparatur des Knochendefekts. Insbesondere ist es nicht praktikabel, eine einzelne Masse aus transplantiertem Knorpel in einer Größe zu entwerfen, die der Form des tatsächlichen Knochendefekts entspricht. Daher muss der zu transplantierende Knorpel die Eigenschaft haben, bei der Implantation mehrerer Stücke Knochen integral zu bilden. Hydrogele können ein attraktives Werkzeug für die Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten für die endochondrale Ossifikation sein, um den klinischen Anforderungen gerecht zu werden. Obwohl viele natürlich gewonnene Hydrogele die MSC-Knorpelbildung in vitro und ECO in vivo unterstützen, muss das optimale Gerüstmaterial für die Anforderungen klinischer Anwendungen noch bestimmt werden. Hyaluronsäure (HA) ist ein entscheidender Bestandteil der extrazellulären Matrix des Knorpels und ist ein biologisch abbaubares und biokompatibles Polysaccharid. Hier zeigen wir, dass HA-Hydrogele hervorragende Eigenschaften haben, um die in vitro Differenzierung von MSC-basiertem Knorpelgewebe zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern.

Einleitung

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Autologer Knochen ist nach wie vor der Goldstandard für die Reparatur von Knochendefekten aufgrund von Traumata, angeborenen Defekten und chirurgischer Resektion. Die autogene Knochentransplantation hat jedoch erhebliche Einschränkungen, einschließlich Spenderschmerzen, Infektionsrisiko und begrenztes Knochenvolumen, das von den Patienten isoliert werden kann 1,2,3,4. Als Knochenersatz wurden zahlreiche Biomaterialien entwickelt, die natürliche oder synthetische Polymere mit mineralisierten Materialien wie Kalziumphosphat oder Hydroxylapatitkombinieren 5,6. Die Knochenbildung in diesen technischen Materialien wird in der Regel durch die Verwendung des mineralisierten Materials als Priming-Material erreicht, damit sich Stammzellen durch den Intramembran-Ossifikationsprozess (IMO) direkt in Osteoblasten differenzierenkönnen 7. Bei diesem Prozess fehlt der angiogene Schritt, was zu einer unzureichenden In-vivo-Vaskularisierung des Transplantats nach der Implantation führt 8,9,10, und daher sind Ansätze, die ein solches Verfahren verwenden, möglicherweise nicht optimal für die Behandlung großer Knochendefekte 11.

Es hat sich gezeigt, dass Strategien, die zur Rekapitulation des endochondralen Ossifikationsprozesses (ECO), einem angeborenen Mechanismus der Skelettgenese während der Entwicklung, angewendet werden, erhebliche Probleme überwinden, die mit traditionellen IMO-basierten Ansätzen verbunden sind. Bei ECO setzen Chondrozyten in der Knorpelschablone den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) frei, der die vaskuläre Infiltration und den Umbau der Knorpelschablone in Knochen fördert12. Der ECO-vermittelte Ansatz zur Osteogenese über Knorpelumbau und Angiogenese, der auch bei der Frakturreparatur aktiviert wird, verwendet künstlich erzeugtes Knorpelgewebe, das aus MSCs gewonnen wird, als Priming-Material. Chondrozyten können Hypoxie bei Knochendefekten tolerieren, Angiogenese induzieren und ein gefäßfreies Knorpeltransplantat in angiogenes Gewebe umwandeln. Zahlreiche Studien haben berichtet, dass MSC-basierte Knorpeltransplantate Knochen in vivo erzeugen, indem sie ein solches ECO-Programm implementieren 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Eine wesentliche Voraussetzung für die klinische Anwendung dieses ECO-vermittelten Ansatzes ist die Herstellung der gewünschten Menge an Knorpeltransplantaten in einem klinischen Umfeld. Die Herstellung von klinischem Knorpel in einer Größe, die zum tatsächlichen Knochendefekt passt, ist nicht praktikabel. Daher muss Transplantatknorpel Knochen integral bilden, wenn mehrere Fragmente implantiert werden22. Hydrogele können ein attraktives Werkzeug für die Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten für die endochondrale Ossifikation sein. Viele natürlich gewonnene Hydrogele unterstützen die MSC-Knorpelbildung in vitro und ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Das optimale Trägermaterial, um die Anforderungen der klinischen Anwendung zu erfüllen, ist jedoch noch nicht festgelegt. Hyaluronsäure (HA) ist ein biologisch abbaubares und biokompatibles Polysaccharid, das in der extrazellulären Matrix des Knorpelsvorkommt 33. HA interagiert mit MSCs über Oberflächenrezeptoren wie CD44, um die chondrogene Differenzierung zu unterstützen 25,26,28,30,31,32,34. Darüber hinaus fördern HA-Scaffolds die IMO-vermittelte osteogene Differenzierung von Stammzellen der menschlichen Zahnpulpa35 und Scaffolds in Kombination mit Kollagen die ECO-vermittelte Osteogenese36,37.

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Herstellung von HA-Hydrogelen unter Verwendung von aus dem Knochenmark gewonnenen adulten humanen MSCs vor und ihre Verwendung für die hypertrophe Chondrogenese in vitro und die anschließende endochondrale Ossifikation in vivo38. Wir verglichen die Eigenschaften von HA mit denen von Kollagen, einem Material, das im Bone Tissue Engineering mit MSCs weit verbreitet ist und ein nützliches Material für die Skalierung künstlicher Transplantate für die endochondrale Ossifikation ist17. In einem immungeschwächten Mausmodell wurden HA- und Kollagenkonstrukte, die mit humanen MSCs ausgesät waren, durch subkutane Implantation auf ihr in vivo ECO-Potenzial untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass HA-Hydrogele hervorragend als Gerüst für MSCs geeignet sind, um künstliche Knorpeltransplantate herzustellen, die die Knochenbildung durch ECO ermöglichen.

Das Protokoll gliedert sich in zwei Schritte. Zunächst werden Konstrukte von humanen MSCs, die auf Hyaluron-Hydrogel ausgesät sind, hergestellt und in vitro zu hypertrophem Knorpel differenziert. Als nächstes werden die differenzierten Konstrukte subkutan in ein Nacktmodell implantiert, um eine endochondrale Ossifikation in vivo zu induzieren (Abbildung 1).

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Protokoll

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Bei diesem Protokoll werden 4 Wochen alte männliche Nacktmäuse verwendet. Halten Sie vier Mäuse in einem Käfig unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 22−24 °C und 50%−70% relativer Luftfeuchtigkeit. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Tokyo Medical and Dental University genehmigt wurden (Zulassungs-ID: A2019-204C, A2020-116A und A2021-121A).

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

  1. Bereiten Sie mesenchymales Stammzellwachstumsmedium (MSC-Wachstumsmedium) vor, indem Sie das Ergänzungskit des MSC-Wachstumsmediums zu MSC-Basalmedien hinzufügen und bei 4 °C lagern.
  2. Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium und Ham's F12 (DMEM/F-12) Medium vor, indem Sie dem Medium 10 % fötales Kälberserum (FBS), 50 μg/ml Gentamicin, 200 μM L-Alanyl-L-Glutamin und 1 ng/ml basischen fibroblastischen Wachstumsfaktor hinzufügen und bei 4 °C lagern.
  3. Bereiten Sie chondrogenes Medium vor, indem Sie DMEM kurz vor der Anwendung 1 % ITS-G-Ergänzung, 0,12 % Rinderserumalbumin, 50 μg/ml Gentamicin, 0,35 mM L-Prolin, 100 nM Dexamethason und 10 ng/ml TGF-β3 hinzufügen.
  4. Bereiten Sie hypertrophes Medium vor, indem Sie 10 mM β-Glycerophosphat, 0,12 % Rinderserumalbumin, 10 nM Dexamethason, 200 μM Ascorbat-2-phosphat, 50 nM L-Thyroxin, 50 μg/ml Gentamycin und 50 pg/ml IL-1β zu DMEM kurz vor der Anwendung hinzufügen.
  5. Eine 24-Well-Kulturschale mit 200 μl geschmolzenem Paraffin bestreichen, das auf 60 °C vorgewärmt wurde. Bei Raumtemperatur stehen lassen, bis das Paraffin fest geworden ist.

2. Ausbreitung humaner MSCs

ANMERKUNG: Vor Beginn der Experimente sollten MSCs mit einem hohen Potenzial für die MSC-Chondrogenese in Mikro-Massenkultur ausgewählt werden, wie in17 beschrieben.

  1. Gemäß den Anweisungen des Herstellers sind primäre MSCs aus menschlichem Knochenmark (Passage 2) mit MSC-Wachstumsmedium in einer 10-cm-Schale mit einer Dichte von 5 x 103 Zellen/cm2 bei 37 °C in einem 5 % CO2 und 95 % befeuchteten Luftinkubator zu kultivieren.
  2. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht haben, wird das Medium mit einer Vakuumpumpe aus der Zellkulturschale abgesaugt, mit 5 ml PBS gewaschen und dann die Lösung mit einer Vakuumpumpe abgesaugt.
  3. 1 ml 0,05 % Trypsin/0,02 % EDTA-Lösung in die Schale geben. Die Schale 5-10 min bei 37 °C inkubieren.
  4. Fügen Sie 1 ml MSC-Wachstumsmedium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Die Zellsuspension wird in ein 50-ml-Röhrchen überführt.
  5. Mischen Sie die Zellsuspension aus anderen Schalen in das 50-ml-Röhrchen und bewahren Sie es auf Eis auf.
  6. Verwenden Sie den Zellzähler, um die Zellen zu zählen, indem Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl 0,4%iger Trypanblaufärbung mischen.
  7. Die verbleibende Zellsuspension wird bei 220 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie Kryokonservierungslösung in einer Konzentration von 1,0 x 106 Zellen pro ml hinzu.
  8. Geben Sie 1 ml der Zellsuspension in jedes Kryoröhrchen und lagern Sie es 12 Stunden lang bei -80 °C, bevor Sie in flüssigen Stickstoff übergehen. Die daraus resultierenden gefrorenen Bestände (Passage 3) werden für dieses Protokoll verwendet.
  9. Für die Versuche werden die vorrätigen MSCs in einer 10-cm-Schale mit einer Dichte von 5 x 103 Zellen/cm2 ausgesät. Kultur der Zellen bis zu 80%-90% konfluent (Passage 4) in DMEM/F-12 Medium.

3. Herstellung von MSC-verkapselten Hydrogelen

  1. Trypsinisieren Sie die Zellen und bereiten Sie die Zellsuspension vor, wie in den Schritten 2.3 - 2.6 beschrieben.
  2. Um 10 Konstrukte (2,5 x 10 5 Zellen pro Konstrukt) herzustellen, wird die Zellsuspension mit 2,5 x 106 Zellen in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen aliquotiert.
  3. Die Suspension wird 3 min lang bei 220 x g zentrifugiert, der Überstand mit einer Vakuumpumpe entfernt und auf Eis gelegt.
  4. Bringen Sie die Thiol-modifizierte Hyaluronsäure (HA), den Thiol-reaktiven Vernetzer, das Polyethylenglykoldiacrylat und die entgasten Wasserflaschen auf Raumtemperatur.
  5. Unter sterilen Bedingungen 1,0 ml entgastes Wasser mit einer Spritze mit einer Nadel in die HA-haltige Flasche (siehe Herstellerangaben) geben.
  6. Gelegentlich auf 37 °C erwärmen, bis die Lösung klar ist, dann auf Eis legen. Es dauert weniger als 30 Minuten, bis sich die Feststoffe vollständig aufgelöst haben.
  7. Geben Sie unter sterilen Bedingungen 0,5 ml entgastes Wasser mit einer Spritze mit einer Nadel in die Vernetzerflasche. Durch mehrmaliges Umkehren auflösen, dann auf Eis legen.
  8. 120 μl der gelösten HA-Lösung werden zu dem aliquotierten Zellpellet (2,5 x 106 Zellen) gegeben. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch Hin- und Herpipettieren.
  9. 30 μl der gelösten Vernetzerlösung in das Röhrchen mit HA und Zellen geben (Schritt 3.8) und durch Klopfen auf das Röhrchen vermischen und dann kurz abschleudern. Kombinieren Sie die HA-Lösung und die Vernetzerlösung im Verhältnis 4:1.
  10. Geben Sie 15 μl der kombinierten Lösung mit MSCs (2,5 x 105 Zellen) auf die paraffinbeschichtete 24-Well-Platte und lassen Sie sie bei 37 °C 30 Minuten lang erstarren (Abbildung 2). Aufgrund der hohen Viskosität müssen Sie mindestens 10 % der Zell-/Hydrogelmischung als nötig herstellen.
    ANMERKUNG: Die Eigenschaften des Hydrogels wurden bereits beschrieben39.

4. In-vitro-Differenzierungsbedingungen

  1. Geben Sie 0,5 ml chondrogenes Differenzierungsmedium zu einem Konstrukt aus MSC-besiedelten HA-Hydrogelen. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
  2. Wechseln Sie nach 3 Wochen auf ein hypertrophes Differenzierungsmedium (0,5 ml pro Well) und kultivieren Sie die Konstrukte für weitere 2 Wochen.

5. In-vivo-Implantation von MSCs

  1. Nach insgesamt 5 Wochen In-vitro-Kultur werden die Konstrukte subkutan in den Rücken von Nacktmäusen implantiert, wie zuvor beschrieben38,40.
  2. Mäuse werden gewogen und ein Kombinationsanästhetikum verabreicht, das mit 0,75 mg/kg Körpergewicht (Körpergewicht) Medetomidin, 4,0 mg/kg Körpergewicht Midazolam und 5,0 mg/kg Körpergewicht Butorphanol durch intraperitoneale Injektion hergestellt wurde, wie beschrieben38.
  3. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch Immobilität gegenüber chirurgischen Reizen und überwachen Sie die Atemtiefe durch langsame, regelmäßige Brustbewegungen und die richtige Sauerstoffversorgung durch die Farbe der rosa Schleimhaut regelmäßig während der Operation. Verwenden Sie eine Veterinärsalbe auf den Augen, um Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern.
  4. Legen Sie die Maus auf ein steriles OP-Tuch in Bauchlage, sterilisieren Sie die Inzisionsstelle mit 50 ppm hypochlorigem saurem Wasser (pH 5,0; HAW) und legen Sie ein perforiertes OP-Tuch über die Maus.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Materialien in einem Autoklaven, Ethylenoxidgas oder HAW. Die Chirurgen sollten sich die Finger waschen und OP-Kittel und Handschuhe tragen.
  5. Mit einer Schere zwei 5 mm lange Hautschnitte im Abstand von 2 cm im Schulter- und Hüftbereich entlang der Mittellinie der Wirbelsäule machen.
  6. Führen Sie einen Spatel subkutan durch den Schnitt ein, um eine subkutane Tasche zu schaffen.
  7. Führen Sie zwei bis drei Konstrukte (je ~15 μl, Schritt 5.1) mit einer Pinzette in jede Tasche ein. HA-Konstrukte, die in dieselbe Tasche implantiert werden, neigen sehr häufig zur Fusion. Um eine Verschmelzung zu verhindern, setzen Sie ein HA-Konstrukt in jede Tasche ein.
  8. Verschließen Sie die Schnitte mit 4-0 geflochtenen Seidennähten. Der Maus wird ein Anästhetikumsantagonist injiziert, das mit 0,75 mg/kg Körpergewicht Atipamezol wie beschrieben hergestellt wurde38.
  9. Während sich die Mäuse von der Narkose erholen, setzen Sie die Mäuse in sterile Aufwachkäfige mit steriler Einstreu ohne Futter und Wasserflaschen und überwachen Sie kontinuierlich Körpertemperatur, Puls und Atmung.
  10. Lassen Sie die Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um das Brustbein zu halten. Nach vollständiger Genesung bringen Sie die Tiere mit den anderen Tieren in den Zuchtraum zurück.
  11. Überwachen Sie die Tiere während der Heilungsphase alle paar Tage auf mögliche Komplikationen. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Inhalation von Kohlendioxid mit wenig Leiden 4 und 8 Wochen nach der Implantation.
  12. Schneiden Sie die Haut an den transplantierten Stellen ein und entfernen Sie die implantierten Konstrukte mit einer Pinzette. Fixieren Sie die Konstrukte 16 h lang in 4%igem Paraformaldehyd und unterziehen Sie sie anschließend einer Analyse.

6. Statistische Analyse

  1. Geben Sie quantitative Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) an. Führen Sie statistische Analysen mit kommerzieller Software durch.
  2. Verwenden Sie den Student's t-Test oder die unidirektionale ANOVA, gefolgt von dem Tukey-Test für mehrere Vergleiche, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu ermitteln. p<0,05 und p<0,01 deuten auf signifikante Unterschiede zwischen zwei Gruppen hin.

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Ergebnisse

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MSC-verkapselte HA-Hydrogele wurden in chondrogenem Medium kultiviert, das mit TGFβ3, einem Induktor der Chondrogenese41 , ergänzt wurde (Schritt 4.1). Wir verglichen die Eigenschaften von HA mit denen von Kollagen, das sich als wirksam bei der Herstellung von MSC-basierten künstlichen Knorpeltransplantaten für die endochondrale Ossifikation erwiesen hat, wie zuvor beschrieben38. Undifferenzierte MSCs wurden nicht als Negativkontrollen in diese Studie einbezogen, da gezeigt...

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Diskussion

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Die Verwendung geeigneter Gerüstmaterialien, die den Übergang vom hypertrophen Knorpel zum Knochen fördern, ist ein vielversprechender Ansatz, um MSC-basierte hypertrophe Knorpeltransplantate zu skalieren und Knochendefekte klinisch signifikanter Größe zu behandeln. Hier zeigen wir, dass HA ein hervorragendes Gerüstmaterial ist, um die Differenzierung von MSC-basiertem hypertrophem Knorpelgewebe in vitro zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern 38. ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) unterstützt (Grant Nr. JP19K10259 und 22K10032 bis MAI).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 W/v% Trypsin-1 mmol/l EDTA.4Na LösungFUJIFILM Wako Reine Chemikalie209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
Ascorbat-2-phosphatNacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
basischer fibroblastischer WachstumsfaktorReprocellRCHEOT002 
Serumalbumin für RinderFUJIFILM Wako Pure Chemical012-238817,5 w/v%
Countess Automatisierter Zellzähler mit Zellzählkammer-Objektträgern und Trypanblau-Färbung 0,4InvitrogenC10283
DexamethasonMerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle MediumMerckD6429
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nährstoffmischung mit hohem Glukosegehalt F-12 SchinkenMerckD6421
Fötales RinderserumHyklonSH30396.03
GentamicinsulfatFUJIFILM Wako Pure Chemikalie1676045  10 mg/mL
Haccpper GeneratorTechnoMaxCH-400-5QB50 ppm hypochloriges saures Wasser
Humane mesenchymale StammzellenLonzaPT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold KitMerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
ITS-G ErgänzungFUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741&mal; 100
L-Alanyl-L-GlutaminFUJIFILM Wako Reine Chemikalie016-21841200mmol/L (&mal; 100)
L-ProlinNacalai Tesque29001-42
L-ThyroxinMerckT1775
MSCGM Mesenchymales Stammzellwachstum Medium
BulletKit		LonzaPT-3001
ParaffinFUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7,4 100mlMedicago09-2051-100
TGF-β 3 ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare SalbeSAVAVET/SAVA Healthcare
β-GlycerophosphatFUJIFILM Wako Pure Chemical Tel.: 048-34332
%

Referenzen

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