Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

Summary

Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

Abstract

Die konventionelle Knochenregenerationstherapie mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) ist bei Knochendefekten, die größer als die kritische Größe sind, schwierig anzuwenden, da sie keinen Mechanismus zur Induktion der Angiogenese hat. Die Implantation von künstlichem Knorpelgewebe, das aus MSCs hergestellt wird, induziert die Angiogenese und Knochenbildung in vivo durch endochondrale Ossifikation (ECO). Daher könnte dieser ECO-vermittelte Ansatz in Zukunft eine vielversprechende Knochenregenerationstherapie sein. Ein wichtiger Aspekt der klinischen Anwendung dieses ECO-vermittelten Ansatzes ist die Erstellung eines Protokolls zur Vorbereitung von genügend Knorpel für die Implantation zur Reparatur des Knochendefekts. Insbesondere ist es nicht praktikabel, eine einzelne Masse aus transplantiertem Knorpel in einer Größe zu entwerfen, die der Form des tatsächlichen Knochendefekts entspricht. Daher muss der zu transplantierende Knorpel die Eigenschaft haben, bei der Implantation mehrerer Stücke Knochen integral zu bilden. Hydrogele können ein attraktives Werkzeug für die Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten für die endochondrale Ossifikation sein, um den klinischen Anforderungen gerecht zu werden. Obwohl viele natürlich gewonnene Hydrogele die MSC-Knorpelbildung in vitro und ECO in vivo unterstützen, muss das optimale Gerüstmaterial für die Anforderungen klinischer Anwendungen noch bestimmt werden. Hyaluronsäure (HA) ist ein entscheidender Bestandteil der extrazellulären Matrix des Knorpels und ist ein biologisch abbaubares und biokompatibles Polysaccharid. Hier zeigen wir, dass HA-Hydrogele hervorragende Eigenschaften haben, um die in vitro Differenzierung von MSC-basiertem Knorpelgewebe zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern.

Introduction

Autologer Knochen ist nach wie vor der Goldstandard für die Reparatur von Knochendefekten aufgrund von Traumata, angeborenen Defekten und chirurgischer Resektion. Die autogene Knochentransplantation hat jedoch erhebliche Einschränkungen, einschließlich Spenderschmerzen, Infektionsrisiko und begrenztes Knochenvolumen, das von den Patienten isoliert werden kann 1,2,3,4. Als Knochenersatz wurden zahlreiche Biomaterialien entwickelt, die natürliche oder synthetische Polymere mit mineralisierten Materialien wie Kalziumphosphat oder Hydroxylapatit....

Protocol

Bei diesem Protokoll werden 4 Wochen alte männliche Nacktmäuse verwendet. Halten Sie vier Mäuse in einem Käfig unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 22−24 °C und 50%−70% relativer Luftfeuchtigkeit. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Tokyo Medical and Dental University genehmigt wurden (Zulassungs-ID: A2019-204C, A2020-116A und A2021-121A).

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

1. Bereiten Sie mesenchymales Stammzellwachstumsmedium (MSC-Wachstumsmedium) vor, indem Sie das Ergänzungskit des MSC-Wachstumsmedi....

Results

MSC-verkapselte HA-Hydrogele wurden in chondrogenem Medium kultiviert, das mit TGFβ3, einem Induktor der Chondrogenese⁴¹ , ergänzt wurde (Schritt 4.1). Wir verglichen die Eigenschaften von HA mit denen von Kollagen, das sich als wirksam bei der Herstellung von MSC-basierten künstlichen Knorpeltransplantaten für die endochondrale Ossifikation erwiesen hat, wie zuvor beschrieben³⁸. Undifferenzierte MSCs wurden nicht als Negativkontrollen in diese Studie einbezogen, da gezeigt.......

Discussion

Die Verwendung geeigneter Gerüstmaterialien, die den Übergang vom hypertrophen Knorpel zum Knochen fördern, ist ein vielversprechender Ansatz, um MSC-basierte hypertrophe Knorpeltransplantate zu skalieren und Knochendefekte klinisch signifikanter Größe zu behandeln. Hier zeigen wir, dass HA ein hervorragendes Gerüstmaterial ist, um die Differenzierung von MSC-basiertem hypertrophem Knorpelgewebe in vitro zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern ³⁸. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 W/v% Trypsin-1 mmol/l EDTA.4Na Lösung	FUJIFILM Wako Reine Chemikalie	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
Ascorbat-2-phosphat	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basischer fibroblastischer Wachstumsfaktor	Reprocell	RCHEOT002
Serumalbumin für Rinder	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7,5 w/v%
Countess Automatisierter Zellzähler mit Zellzählkammer-Objektträgern und Trypanblau-Färbung 0,4	Invitrogen	C10283
Dexamethason	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nährstoffmischung mit hohem Glukosegehalt F-12 Schinken	Merck	D6421
Fötales Rinderserum	Hyklon	SH30396.03
Gentamicinsulfat	FUJIFILM Wako Pure Chemikalie	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochloriges saures Wasser
Humane mesenchymale Stammzellen	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G Ergänzung	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	&mal; 100
L-Alanyl-L-Glutamin	FUJIFILM Wako Reine Chemikalie	016-21841	200mmol/L (&mal; 100)
L-Prolin	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxin	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymales Stammzellwachstum Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
Paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7,4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β 3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Salbe	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-Glycerophosphat	FUJIFILM Wako Pure Chemical	Tel.: 048-34332