Isolierung und Aufreinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation

Summary

Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung und Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (BEVs), die aus menschlichen Fäkalien mittels Dichtegradientenzentrifugation (DGC) angereichert wurden, identifiziert die physikalischen Eigenschaften von BEVs anhand von Morphologie, Partikelgröße und Konzentration und diskutiert die potenziellen Anwendungen des DGC-Ansatzes in der klinischen und wissenschaftlichen Forschung.

Abstract

Bakterielle extrazelluläre Vesikel (BEVs) sind Nanovesikel von Bakterien, die eine aktive Rolle bei der Kommunikation zwischen Bakterien und Bakterien spielen, indem sie bioaktive Moleküle wie Proteine, Lipide und Nukleinsäuren übertragen, die von den Mutterbakterien geerbt wurden. BEVs, die aus der Darmmikrobiota gewonnen werden, haben Wirkungen im Magen-Darm-Trakt und können entfernte Organe erreichen, was erhebliche Auswirkungen auf die Physiologie und Pathologie hat. Theoretische Untersuchungen, die die Arten, Mengen und Rollen von BEVs aus menschlichen Fäkalien untersuchen, sind entscheidend für das Verständnis der Sekretion und Funktion von BEVs aus der Darmmikrobiota. Diese Untersuchungen erfordern auch eine Verbesserung der aktuellen Strategie zur Isolierung und Reinigung von BEVs.

In dieser Studie wurde der Isolierungs- und Reinigungsprozess von BEVs optimiert, indem zwei Dichtegradientenzentrifugationsmodi (DGC) etabliert wurden: Top-down und Bottom-up. Die angereicherte Verteilung der BEVs wurde in den Fraktionen 6 bis 8 (F6-F8) bestimmt. Die Wirksamkeit des Ansatzes wurde anhand der Partikelmorphologie, der Größe, der Konzentration und des Proteingehalts bewertet. Die Partikel- und Proteinrückgewinnungsraten wurden berechnet und das Vorhandensein spezifischer Marker analysiert, um die Wiederfindung und Reinheit der beiden DGC-Modi zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Top-down-Zentrifugationsmodus geringere Kontaminationswerte aufwies und eine ähnliche Rückgewinnungsrate und Reinheit wie der Bottom-up-Modus erreichte. Eine Zentrifugationszeit von 7 h war ausreichend, um eine fäkale BEV-Konzentration von 10⁸/mg zu erreichen.

Abgesehen von Fäkalien kann diese Methode auch auf andere Arten von Körperflüssigkeiten angewendet werden, wobei die entsprechenden Modifikationen entsprechend den Unterschieden in den Komponenten und der Viskosität durchgeführt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses detaillierte und zuverlässige Protokoll die standardisierte Isolierung und Aufreinigung von BEVs erleichtern und damit eine Grundlage für nachfolgende Multi-Omics-Analysen und funktionelle Experimente schaffen würde.

Introduction

Der Darm gilt weithin als das Organ, das die am häufigsten vorkommenden mikrobiellen Gemeinschaften im menschlichen Körper beherbergt, wobei über 90 % der Bakterien an der Besiedlung und Vermehrung beteiligt sind ^1,2. Es gibt umfangreiche Belege dafür, dass die Darmmikrobiota die Darmmikroumgebung moduliert und gleichzeitig mit Funktionsstörungen in entfernten Organen interagiert, vor allem durch eine gestörte Darmbarriere ^3,4. Es gibt immer mehr Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen dem Ungleichgewicht der Darmmikrobiota und dem Fortschreiten von c....

Protocol

Die Ethikkommission des Nanfang Krankenhauses der Southern Medical University genehmigte diese Studie, die mit der informierten Zustimmung der Teilnehmer durchgeführt wurde. Alle hier verwendeten Methoden entsprechen den Standard-Betriebsrichtlinien der International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle nachfolgenden Liquid-Handling-Verfahren mussten in einer Biosicherheitswerkbank oder einer Reinstbank durchgeführt werden.

1. Entnahme und Aliquotierung von Kotproben

1. Verteilen Sie einen Stuhlprobenehmer, einen versiegelten Beutel und eine Eisbox und geben Sie den Teilnehmer....

Results

Bestimmung der Verteilung von BEV-angereicherten Fraktionen
Um die Verteilung der mit bakteriellen extrazellulären Vesikeln (BEVs) angereicherten Fraktionen zu bestimmen, wurde eine Blindkontrolle zur Messung der Absorptionswerte bei OD 340 nm etabliert und die Dichte jeder Fraktion basierend auf den Messungen und den Iodixanol-Richtlinien berechnet (Schritt 8.1). Tabelle 2 zeigt die Dichteergebnisse, die zeigen, dass die Fraktionen F4 bis F9 Dichten innerhalb des Bereichs aufwiesen, .......

Discussion

Bakterielle extrazelluläre Vesikel (BEVs) sind Lipid-Doppelschicht-Nanopartikel, die von Bakterien abgesondert werden und eine Fülle von Proteinen, Lipiden, Nukleinsäuren und anderen bioaktiven Molekülen tragen, die zur Vermittlung der funktionellen Wirkungen von Bakterien beitragen²⁰. Es wurde nachgewiesen, dass aus dem Darm gewonnene BEVs an der Entwicklung von Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Darmkrebs beteiligt sind, den allgemeinen Stoffwechsel beeinflussen und.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 % (w/v) Glutaraldehyd (hergestellt aus 2,5 %iger Stammlösung in deionisiertem Wasser)	ACMEC	AP1126	Morphologische Beobachtung für BEVs unter Verwendung von TEM in Schritt 8.3.3
1 % (w/v) Methylcellulose (hergestellt aus ursprünglichem Pulver in deionisiertem Wasser)	Sigma-Aldrich	M7027	Morphologische Beobachtung für BEVs unter Verwendung von TEM in Schritt 8.3.6
1,5 % (w/v) Uranylacetat (hergestellt aus ursprünglichem Pulver in deionisiertem Wasser)	Polysciences	21447-25	Morphologische Beobachtung von BEVs mit TEM in Schritt 8.3.5
1000 μ L, 200 μ L, 10 μ L Pipette	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Übertragen Sie die Lösung
5 % (w/v) Rinderserumalbuminlösung (hergestellt aus dem ursprünglichen Pulver in TBST-Puffer)	Fdbio science	FD0030	Wird beim Western Blotting zum Blockieren bei Schritt 8.5.6
5 & Ladepuffer	Fdbio science	FD006	Wird bei Western Blotting und Coomassie Brilliant Blue Färbung bei Schritt 8.5.1 verwendet
75 % (v/v) Alkohol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Flächendesinfektion
96-Well-Platte	Rar	A8096	Messen Sie die Absorptionswerte
Anti-Calnexin-Antikörper	Abcam	ab92573	Western Blot (Primärer Antikörper)
Anti-CD63-Antikörper	Abcam	ab134045	Western Blot (Primärer Antikörper)
Anti-CD9-Antikörper	Abcam	ab236630	Western Blot (Primärer Antikörper)
Anti-Flagellin-Antikörper	Sino Biological	40067-MM06	Western Blot (Primärer Antikörper)
Anti-Integrin beta 1 Antikörper	Abcam	ab30394	Western Blot (Primärer Antikörper)
Anti-LPS Antikörper	Thermo Fisher	MA1-83152	Western Blot (Primärer Antikörper)
Anti-LTA Antikörper	Thermo Fisher	MA1-7402	Western Blot (Primärer Antikörper)
Anti-OmpA Antikörper	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western Blot (Primärer Antikörper)
Anti-Syntenin Antikörper	Abcam	ab133267	Western Blot (Primärer Antikörper)
Anti-TSG101 Antikörper	Abcam	ab125011	Western Blot (Primärer Antikörper)
Autoklav	ZEALWAY	GR110DP	Sterilisation von Verbrauchsmaterialien und Medien, die im Experiment verwendet wurden
Balance	Mettler Toledo	AL104	Waage der mit PBS
Bicinchoninsäure beladenen	Fdbio science	FD2001	Messung des Proteingehalts von BEVs in Schritt 8.2
BioRender	BioRender https://app.biorender.com		Erstellen Sie den schematischen Arbeitsablauf der Isolierung und Reinigung von BEVs in Abbildung 1
Biosicherheitswerkbank	Haier	HR1200- II B2	Zeigen Sie die Verfahren zur Handhabung von Kotproben
Zentrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, Adapter: 5804774000	Preprocess für BEVs (Schritt 3)
Chemilumineszenz-Gerät	BIO-OI	OI600SE-MF	Wird im Western Blotting zur Signaldetektion bei Schritt 8.5.12
Cytation 5	BioTek	F01	Mikroplatten-Detektor zur Messung der Absorptions- (Schritt 8.1) und Fluoreszenzwerte (Abbildung 6) verwendet;
Dil-labelled Low Density Lipoprotein	ACMEC	AC12038	Definition der Verteilung der störenden Komponenten
Elektrophorese-Gerät	Bio-rad	1658033	Wird beim Western Blotting für die Proteintrennung und -übertragung in den Schritten 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 verwendet
Erweitertes Chemilumineszenz-Kit HRP	Fdbio science	FD8020	Wird im Western Blotting zur Signaldetektion bei Schritt 8.5.12
verwendetEscherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	Isolate BEVs als Positivkontrolle. Protokoll: 25 g des LB-Pulvers in 1 l deionisiertem Wasser auflösen und autoklavieren. Übertragen Sie die 800 μ L konservierter Escherichia coli in das Medium. Anbau bei 37 > C im Inkubatorschüttler. Dann zentrifugieren Sie bei 3.000 & mal; g für 20 min bei 4 ° G; C, 12.000 & mal; g für 30 min bei 4 ° G; C, den Überstand durch 0,22 μ filtern m-Membran und führen Sie eine Ultra-Speed-Zentrifugation bei 160.000 & x durch; g für 70 min bei 4 °C. Pellets, definiert als rohe BEVs aus Escherichia coli, wurden in 1,2 mL PBS suspendiert (Schritt 3, 4).
Falcon-Röhrchen 50 mL	KIRGEN	KG2811	Vorprozess für BEVs (Schritt 3)
Feto Protein Staining Buffer	Absci	ab.001.50	Coomassie Brilliant Blue Färbung in Schritt 8.5.4
Filterpapier	Biosharp	BS-TFP-070B	Morphologische Beobachtung für BEVs unter Verwendung von TEM in Schritt 8.3 (Abtupfen der Lösung)
Formvar/Kohlenstoff-gestützte Kupfergitter	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Morphologische Beobachtung von BEVs unter Verwendung von TEM in Schritt 8.3
HEPES-Pulver	Meilunbio	MB6078	Herstellung von Iodixanol-Puffern mit unterschiedlichen Konzentrationen für die Dichtegradientenzentrifugation
HRP AffiniReine Ziege Anti-Maus IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western Blot (Sekundärer Antikörper)
HRP AffiniReine Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Fdbio science	FDR007	Western Blotting (Sekundärer Antikörper)
Inkubatorschüttler	Qiangwen	DHZ-L	Kultivieren Sie Escherichia coli
Kimwipes&Handel; Delicate Task Wipes	Kimtech Science	34155	Wischen Sie die Innenwand des Ultrazentrifugenröhrchens bei Schritt 4.15
LB Brühe	ab Hopebio	HB0128	Kultivieren Sie Escherichia coli
Tiefkühlschrank bei niedriger Temperatur (-80 &Grad; C)	Haier	DW-86L338J	Lagern Sie die Proben
Methanol	Alalddin	M116118	Wird beim Western Blotting zur Aktivierung der PVDF-Membran in Schritt 8.5.5
verwendet Mikroröhrchen 1,5 mL	KIRGEN	KG2211	Rückgewinnung von Fraktionen nach Dichtegradientenzentrifugation
Mikroröhrchen 2 mL	KIRGEN	KG2911	Rückgewinnung von Fraktionen nach Dichtegradientenzentrifugation
Mikro Röhrchen 5 mL	BBI	F610888-0001	Rückgewinnung von Fraktionen nach Dichtegradientenzentrifugation
Mikrotiterplatten-Reader	Thermo Fisher	Multiskan MK3	Messung des Proteingehalts von BEVs in Schritt 8.2
Millipore-Filter 0,22 μ m	Merck Millipore	SLGP033RB	Filtration Sterilisation; Material: Polyethersulfon, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Dichtegradientenzentrifugationslösung
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Dichtegradientenzentrifugationslösung (pH-Einstellung)
Optima™ XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Ultrazentrifugation für die Isolierung von BEVs in Schritt 4, 7
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	Dichtegradientenzentrifugation Stammlösung
Orbital Shaker	Youning	CS-100	Kot bei Schritt 2 auflösen
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Procell PB180327		Kot bei Schritt 2
auflösen Pipettierer	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Lösung umfüllen
Kunststoffpasteurpipette	ABCbio	ABC217003-4	Überstand in der Vorverarbeitung in Schritt 3.4 entfernen
Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Wird beim Western Blotting für den Proteintransfer in Schritt 8.5.5 verwendet
Vorgefertigtes Polyacrylamid-Gel, 4– 20% 15 Wells	ACE	F15420Gel	Wird beim Western Blotting zur Proteintrennung in Schritt 8.5.2, 8.5.3
Primäres Antikörper-Verdünnungsmittel	verwendet Fdbio science	FD0040	Wird beim Western Blotting bei Schritt 8.5.8
Proteinleiter	verwendet Fdbio science	FD0672	Wird beim Western Blotting und Coomassie Brilliant Blue Färbung bei Schritt 8.5
verwendet Schnelle Protein-Blotting-Lösung	UBIO	UW0500	Wird im Western Blotting für den Proteintransfer in Schritt 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Schwingschaufelrotor	Beckman Schar	369650	Ultrazentrifugation für die Isolierung von BEVs in Schritt 4, 7
Spritze 20 mL, 50 ml	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Transferpuffer und entfernen Überstand in der Vorverarbeitung
TBS-Pulver	Fdbio science	FD1021	Wird beim Western Blotting bei Step 8.5
Transmissionselektronenmikroskop (TEM) verwendetHitachi		H-7650	Morphologische Beobachtung für BEVs bei Schritt 8.3
Tween-20	Fdbio science	FD0020	Verwendet beim Western Blotting bei Schritt 8.5
Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman	326823, 355642	Ultrazentrifugation für die Isolierung von BEVs bei Schritt 4, 7
Ultra-Clean	Bench AIRTECH	SW-CJ-2FD	Durchführen der Verfahren zum Umgang mit Flüssigkeiten
Wasserbad	Bluepard	CU600	Zur Messung des Proteingehalts von BEVs in Schritt 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, Software ZetaView (Version 8.05.14 SP7)	Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) zur Messung der Partikelgröße und -konzentration von BEVs in Schritt 8.4