Etablierung eines Oronasale Fistel-Mausmodells

Die oronasale Fistel (ONF), eine abnorme Öffnung zwischen Mund- und Nasenhöhle, manifestiert sich klinisch als Defekt in einem strukturellen Bereich vom Alveolarfortsatz bis zum Zäpfchen, der häufig als Komplikation nach einer Gaumenspaltenreparatur auftritt¹. Patienten mit ONF leiden unter Nahrungsreflux, Artikulationsstörungen und einer Beeinträchtigung der velopharyngealen Funktion, was ihre Lebensqualität erheblich beeinträchtigt ^2,3,4. Die postoperative ONF-Rate liegt zwischen 2,4 % und 55 %, was auf Faktoren wie Spaltbreite, Veau-Typ und Operationsmethode zurückzuführen^ist 5,6,7,8. Darüber hinaus ist die Rezidivrate nach einer ONF-Reparatur hoch und liegt zwischen 0 % und 43 %⁹.

Mehrere neuartige Behandlungen haben sich in letzter Zeit auf dem Gebiet der ONF als vielversprechend erwiesen, darunter verschiedene Materialien, Medikamente und neuartige Techniken 10,11,12,13,14,15,16,17. Eine genaue Bewertung der therapeutischen Effekte ist von entscheidender Bedeutung, da sie die Grundlage für die Auswahl und Weiterentwicklung von ONF-Behandlungen bildet. Es ist jedoch schwierig, kurzfristig eine valide Bewertung für andere therapeutische Wirkungen als die Operation zu erhalten, da die Eigenschaften von ONFs von Patient zu Patient unterschiedlich sind. Daher ist die Etablierung eines ONF-Krankheitsmodells notwendig, um die Wirksamkeit dieser Behandlungsmethoden zu überprüfen.

Seit mehreren Jahrzehnten haben Forscher das Modell der oronasalen Fistel (ONF) bei verschiedenen Tierarten entwickelt, darunter Ratten^18,19, Ferkel 20,21, Minischweine²² und Hunde ²³, da diese Arten einen beträchtlichen harten Gaumen besitzen^, der für chirurgische Eingriffe geeignet ist. Mäuse haben jedoch eine genetische Sequenz und ein vollständiges Genom, die dem des Menschen ähneln, was sie zu einem wichtigen Modell für die Erforschung und Entwicklung neuer Medikamente macht^24,25,26. Darüber hinaus bieten Mäuse nur geringe Variationen von Charge zu Charge, was sie zu einer günstigen Wahl für die Etablierung des ONF-Modells^12,13,27 macht.

Die detaillierten Schritte zur Erstellung von ONF wurden jedoch nicht beschrieben, und die Stabilität der ONF-Größe wurde nicht berücksichtigt. Darüber hinaus stützte sich der Nachweis der ONF-Bildung ausschließlich auf die Beobachtung²⁸, ohne eine direkte Kommunikation zwischen der Mund- und der Nasenhöhle zu gewährleisten. Es wurde nicht mit anderen Mitteln nachgewiesen, wie z. B. dem Verlust des Körpergewichts der Maus aufgrund von Schwierigkeiten beim Fressen, die durch die ONF verursacht wurden. Darüber hinaus wurde die normale Variation der Wundgröße nicht berücksichtigt, was für Studien zu Medikamenten oder Materialien, die die Wundheilung fördern oder hemmen, von entscheidender Bedeutung ist. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Etablierung eines stabilen und validierten ONF-Modells.

Das Ziel dieser Studie war es, ein praktisches ONF-Modell zu entwickeln, das die oben genannten Probleme adressiert, in der Hoffnung, dass dieses Protokoll als Grundlage für zukünftige Forschungen zu den Mechanismen der palatinalen Wundheilung und neuartigen Behandlungen für ONF dienen wird.

Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie wurden vom Ethikkomitee der West China School of Stomatology der Universität Sichuan geprüft und genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden adulte C57BL/6 Mäuse (weiblich) verwendet.

1. Chirurgische Vorbereitung

1. Stellen Sie die für den Eingriff erforderlichen chirurgischen Instrumente zusammen: Keimer, ophthalmologische Kauter, mikrochirurgische Scheren, mikrochirurgische Pinzetten, Spritzen und Nadeln (26 g x 0,63 Zoll) (Abbildung 1A,B) (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Autoklavieren Sie vor dem chirurgischen Eingriff die chirurgischen Instrumente, einschließlich des ophthalmologischen Kauters, der mikrochirurgischen Pinzette und der mikrochirurgischen Schere, bei 102,9 kPa (1,05 kg/^cm2) und 121 °C für 20 Minuten.
2. Sammeln Sie das erforderliche chirurgische Material: OP-Abdeckungen, Latexhandschuhe, sterile Baumwolle, sterile Bettwäsche, sterile Metallfolie, Schaumstoffplatte als chirurgische Plattform, Gummibänder (die durch Zerreißen eines medizinischen Latexhandschuhs erhalten werden können) und Klebeband (Abbildung 1C) (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Verwenden Sie für jede Maus ein separates Zubehör, einschließlich Spritzen und steriler Tücher für das Operationsfeld.
3. Reinigen Sie den Operationsbereich und die Apparatur (Lichtquelle, Schaumstoffplatte und Temperaturerhaltungsgerät, siehe Materialtabelle) mit Alkoholtüchern. Decken Sie die Knöpfe und Griffe von Instrumenten, die während des Eingriffs erforderlich sein können, mit steriler Metallfolie ab.
4. Öffnen Sie die einzelnen Instrumente aseptisch und positionieren Sie sie vorsichtig im Operationsgebiet. Aktivieren Sie den Keimer (siehe Materialtabelle) und die Lampen für die Verwendung während des Eingriffs. Den ophthalmologischen Kauter in den Keimer geben und 20 min lang auf 250 °C erhitzen.

2. Chirurgischer Eingriff

1. Führen Sie die Fixierung der Maus durch und öffnen Sie die Mundhöhle, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Wählen Sie eine weibliche C57BL/6J-Maus mit einem Gewicht von 20-25 g und einem Alter von 8-12 Wochen. Bringen Sie die Maus 7 Tage lang unter, bevor Sie Eingriffe durchführen.
   2. Die Maus wird durch intraperitoneale Injektion von Zoletil50 (80 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) anästhesiert (siehe Materialtabelle). Tragen Sie Augensalbe auf das Auge der Maus auf. Warten Sie, bis Sie nicht mehr auf das Einklemmen der Zehen reagieren.
      HINWEIS: Die Maus ist bereit für den Vorgang, wenn sie nicht in der Lage ist, sich selbstständig umzudrehen.
   3. Befestigen Sie die Maus auf einer mit sterilen Laken ausgekleideten Schaumstoffplatte. Verwenden Sie Klebeband, um die Maus in Rückenlage an der chirurgischen Plattform zu befestigen (Abbildung 2A).
   4. Öffnen Sie die Mundhöhle der Maus. Positionieren Sie zwei Nadeln (26 g x 0,63 Zoll) vor der Augenhöhle und zwei weitere dahinter. Legen Sie ein Gummiband um die Nadeln und kreuzen Sie die Schneidezähne, um den Mund offen zu halten. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Pinzette, um die Mundwinkel zu öffnen (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der harte Gaumen deutlich freiliegt. Befestigen Sie die Zunge unter dem Gummiband, um eine Behinderung des Sichtfeldes und ein Verbrennen bei nachfolgenden Experimenten zu vermeiden.
2. Erzeugen Sie die oronasale Fistel (ONF) am harten Gaumen (Abbildung 3A-F).
   1. Entnehmen Sie den ophthalmologischen Kauter, der 20 Minuten lang auf 250 °C erhitzt wurde. Platzieren Sie die Kauterspitze 1 mm vom Schnittpunkt der Mittellinie des Gaumens und der Linie des ersten Prämolaren entfernt, wodurch eine Schleimhautverletzung des harten Gaumens in der Mittellinie entsteht.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zunge der Maus zu verbrühen.
   2. Entfernen Sie nach einigen Sekunden den ophthalmologischen Kauter, wenn die Schleimhaut um die Kauterspitze weiß wird.
   3. Den ophthalmologischen Kauter in den Keimer geben und 10 Minuten lang auf 250 °C erhitzen. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, um die Wunde an den Rändern zu vergrößern, bis sie eine Länge von 2,0 mm und eine Breite von 1,5 mm erreicht.
      HINWEIS: Jede Verlängerung sollte der Kante der letzten Verletzung folgen. Verwenden Sie einen Messschieber, um die Länge und Breite der Verletzung zu messen. Die Verletzung sollte 10% des Gaumens bedecken.
   4. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Schere, um überschüssiges denaturiertes Weichgewebe um die Wunde herum zu entfernen. Verwenden Sie sterile Watte, um Blutungen zu stoppen und ein Einatmen des Erstickens der Maus zu verhindern. Messen Sie die Wunde, um sicherzustellen, dass sie eine Verletzung der harten Gaumenschleimhaut in voller Dicke bildet, die 2,0 x 1,5 mm in der Mittellinie misst.

3. Nachsorge

1. Verabreichen Sie der Maus Meloxicam zum Zeitpunkt des postoperativen Aufwachens in einer Dosis von 5 mg/kg/d für 3 Tage subkutan²⁹.
2. Legen Sie die Maus auf ein Temperaturerhaltungsgerät, bis sie wieder vollständig zu Bewusstsein kommt.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Maus so positioniert ist, dass das Atmen erleichtert wird. Drehen Sie die Mäuse alle 10-15 Minuten, um Blutansammlungen oder Kollaps der Lungenlappen zu verhindern. Sobald sich die Maus aufgewärmt hat, setzen Sie sie wieder in ihren Käfig zurück. Stellen Sie steriles Gelee und bestrahltes Futter am Boden des Käfigs bereit, damit die Mäuse es fressen können.

4. Überprüfung der Entstehung der Mund-Nasen-Fistel

HINWEIS: Der Erfolg der Bildung der Mund-Nasen-Fistel (ONF) wird am 7. Tag nach dem chirurgischen Eingriff beurteilt.

1. Bereiten Sie die notwendigen chirurgischen Utensilien vor: Gummiband, Klebeband, Spritzen, OP-Abdecktücher, Latexhandschuhe, sterile Laken, sterile Metallfolie und Schaumstoffplatte.
2. Tragen Sie OP-Abdecktücher und sterile Handschuhe, um die aseptischen Bedingungen aufrechtzuerhalten. Desinfizieren Sie die Schaumstoffplatte, die Lichtquelle und das Temperaturerhaltungsgerät mit Alkohol.
3. Induktion einer Vollnarkose durch intraperitoneale Injektion von Zoletil50 (80 mg/kg). Warten Sie, bis Sie nicht mehr auf das Einklemmen der Zehen reagieren. Verwenden Sie die gleiche Methode wie in den Schritten 2.1.3 und 2.1.4 beschrieben, um die Maus bewegungsunfähig zu machen und den harten Gaumen freizulegen.
4. Führen Sie eine anatomische Strukturüberprüfung durch, indem Sie sicherstellen, dass das Septum an der Wundstelle noch sichtbar ist, was auf eine erfolgreiche ONF-Bildung hinweist (Abbildung 4A,B).
5. Führen Sie eine Funktionsüberprüfung durch: Schließen Sie die Mundhöhle der Maus und injizieren Sie steriles Wasser mit einer sterilen Spritze in die Mundhöhle. Die erfolgreiche Bildung von ONF wird bestätigt, wenn Flüssigkeit aus den Nasenlöchern der Maus fließt.
6. Legen Sie die Maus auf das Temperaturerhaltungsgerät (37 °C), bis sie wieder zu Bewusstsein kommt. Drehen Sie die Mäuse alle 10-15 Minuten, um Blutansammlungen oder Kollaps der Lungenlappen zu verhindern.

Um die Durchführbarkeit und Stabilität dieser experimentellen Methode zu beurteilen, wurde das gleiche Verfahren an zehn Mäusen durchgeführt und Beobachtungen hinsichtlich Mortalität, Veränderungen der Wundgröße, des Körpergewichts und der histologischen Analyse gemacht. Die Mäuse wurden am 7. Tag eingeschläfert.

Das Verfahren wies eine niedrige Mortalitätsrate auf. Der ophthalmologische Kauter und der Keimer, die in Abbildung 1A-C dargestellt sind, waren die wichtigsten Instrumente, die in diesem Experiment verwendet wurden. Das ONF-Modell wurde gemäß dem bereitgestellten Protokoll erstellt. Von den zehn operierten Mäusen starb nur eine am 7. Tag nach der Operation. Die Gesamtmortalitätsrate während des gesamten Experiments lag bei etwa 10 %.

Die Ergebnisse zeigten eine bemerkenswerte Variabilität in der Größe der mit der beschriebenen Methode erzeugten ONF. Am Tag der Operation wiesen alle Mäuse ovale Wunden von 2,0 mm Länge und 1,5 mm Breite auf. Bei der Beurteilung der ONF-Bildung am 7. Tag nach der Operation wurde eine signifikante Variation der ONF-Größe beobachtet (P = 0,0085) (Abbildung 5A,B).

Das Vorhandensein von ONF kann zu Komplikationen wie Nahrungsreflux und Essstörungen führen, die möglicherweise zu Gewichtsveränderungen führen. Daher wurde auch das Körpergewicht der Mäuse berücksichtigt. Die Mäuse wurden am Tag der Operation (Tag 1) und am 7. Tag (Tag 7) gewogen, als die ONF-Bildung untersucht wurde. Eine signifikante Gewichtsreduktion wurde an Tag 7 im Vergleich zu Tag 1 beobachtet (P < 0,001) (Abbildung 6A,B). Der Verlust ihres Körpergewichts betrug 25,16 %.

Für die histologische Analyse wurden den Mäusen am 7. Tag sowohl die Wunde als auch normales Gewebe entnommen. Isolierte Gaumen wurden als Proben für histologische Schnitte verwendet. Sie wurden in Gewebeeinbettungsboxen gelegt und mit 4 % Paraformaldehyd und 10 % Ameisensäure-Entkalkungsreagenz fixiert. Das Gewebe wurde dann in Paraffin eingebettet, entlang der koronalen Ebene in 7-μm-Scheiben geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Die histologische Analyse der ONF ergab einen Verlust der harten Gaumenschleimhaut, entblößten Knochen und die Bildung von ONF (Abbildung 7). Es wurde eine Histologie der Lunge durchgeführt, und es wurden keine Anomalien zwischen normalen und ONF-Mäusen festgestellt.

Abbildung 1: Chirurgische Instrumente und Zubehör . (A) Der Keimer, der zum Erhitzen des ophthalmologischen Kauters verwendet wird. (B) Chirurgische Instrumente: ophthalmologischer Kauter, mikrochirurgische Scheren, mikrochirurgische Pinzetten, Spritzen und Nadeln (26 g x 0,63 Zoll). (C) Chirurgisches Zubehör: OP-Abdecktücher, sterile Handschuhe, sterile Baumwolle, sterile Bettwäsche, sterile Metallfolie, Schaumstoffplatten, Gummibänder und Klebeband. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Fixierung der Maus und Öffnung der Mundhöhle . (A) Die Vordergliedmaßen der Maus wurden abgeklebt, um sie zu sichern. (B) Spritzennadeln wurden in die Schaumstoffplatte eingeführt und ein Gummiband über die Nadeln gelegt. Die Mundhöhle der Maus wurde mit einem Gummiband und einer mikrochirurgischen Pinzette geöffnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Entstehung der Mundfistel . (A) Freilegung der Mundhöhle. (B) Platzieren der Spitze des ophthalmologischen Kauters auf dem Mittellinienteil des harten Gaumens. (C) Entfernung des ophthalmologischen Kauters. (D) Entfernung von überschüssigem Weichgewebe um die Wunde herum mit einer mikrochirurgischen Schere. (E) Blutungsstopp mit steriler Baumwolle. (F) Endgültig geformte Gaumenwunde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Untersuchung der Gaumenwunde am 7. Tag nach der Operation. (A) Gaumenwunde am Tag 1. (B) Gaumenwunde am 7. Tag. Weiße Pfeile zeigen die Mund-Nasen-Fistel (ONF) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Größe der Gaumenwunde an Tag 1 und Tag 7. (A) Mittelwerte für Mäuse an den Tagen 1 und 7. (B) Signifikanter Unterschied, der durch den t-Test bei gepaarten Stichproben verifiziert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Gewicht der Mäuse an Tag 1 und Tag 7. (A) Mittelwerte für Mäuse an Tag 1 und Tag 7. (B) Signifikanter Unterschied, der durch den t-Test bei gepaarten Stichproben verifiziert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Histologische Beobachtung. Die histologische Analyse der ONF zeigt den Verlust der harten Gaumenschleimhaut, den entblößten Knochen und die Bildung von ONF. (A) Oronasale Fistel am Tag 7, Vergrößerung: 4x. (B) Oronasale Fistel am Tag 7, Vergrößerung: 10x. (C) Verletzungsfreie Kontrolle, Vergrößerung: 4x. (D) Verletzungsfreie Kontrolle, Vergrößerung: 10x. Der schwarze Pfeil zeigt die Position der ONF an. Maßstabsleisten: A,C = 200 μm; B,D = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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