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Hyperglykämische Klemme und hypoglykämische Klemme bei bewussten Mäusen

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DOI:

10.3791/65581

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26. Januar 2024

 , 
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine hyperglykämische Klemme wird zur Messung der Insulinfreisetzung bei anhaltend höherer Blutzuckerkonzentration verwendet. Eine hypoglykämische Klemme dient zur Messung der Glukoseproduktion, die durch gegenregulatorische Reaktionen induziert wird. Beide Methoden verwenden das gleiche chirurgische Verfahren. Hier stellen wir eine Clamp-Technik zur Beurteilung des systemischen Glukosestoffwechsels vor.

Zusammenfassung

Diabetes mellitus (DM) wird durch eine unzureichende Insulinausschüttung aus den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse (Typ1-DM) und eine Insulinsensitivität in Muskeln, Leber und Fettgewebe (Typ2-DM) verursacht. Die Insulininjektion behandelt DM-Patienten, führt jedoch als Nebenwirkung zu Hypoglykämie. Cortisol und Katecholamine werden freigesetzt, um die Glukoseproduktion aus der Leber zu aktivieren, um eine Hypoglykämie wiederherzustellen, die als gegenregulatorische Reaktionen (CRR) bezeichnet wird. In der DM-Forschung mit Nagetiermodellen werden Glukosetoleranztests und 2-Desoxyglukose-Injektion verwendet, um die Insulinfreisetzung bzw. CRR zu messen. Die Blutzuckerkonzentrationen ändern sich jedoch während der Experimente anhaltend, was zu Schwierigkeiten bei der Beurteilung der Nettoinsulinfreisetzung und der CRR führt. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, bei der der Blutzucker bei bewussten Mäusen bei 250 mg/dl oder 50 mg/dl gehalten wird, um die Freisetzung von Insulin bzw. CRR-Hormonen zu vergleichen.

Polyethylenschläuche werden in die Halsschlagader und die Halsvene der Mäuse implantiert, und die Mäuse können sich von der Operation erholen. Der Jugularvenenschlauch ist mit einer Hamilton-Spritze mit einer Spritzenpumpe verbunden, um eine Insulin- oder Glukoseinfusion mit einer konstanten und variablen Rate zu ermöglichen. Der Karotisschlauch dient der Blutentnahme. Bei der hyperglykämischen Klemme werden 30% Glukose in die Vene infundiert, und der Blutzuckerspiegel wird alle 5 oder 10 Minuten aus dem arteriellen Blut gemessen. Die Infusionsrate von 30% Glukose wird erhöht, bis der Blutzuckerspiegel 250 mg/dl erreicht. Blut wird entnommen, um die Insulinkonzentration zu messen. Bei hypoglykämischer Klemme werden 10 mU/kg/min Insulin zusammen mit 30% Glukose infundiert, deren Infusionsrate variabel ist, um einen Blutzuckerspiegel von 50 mg/dl aufrechtzuerhalten. Blut wird gesammelt, um gegenregulatorische Hormone zu messen, wenn sowohl die Glukoseinfusion als auch der Blutzucker einen stabilen Zustand erreichen. Sowohl hyperglykämische als auch hypoglykämische Klemmen haben das gleiche chirurgische Verfahren und den gleichen Versuchsaufbau. Daher ist diese Methode für Forscher des systemischen Glukosestoffwechsels nützlich.

Einleitung

Glukose ist eine wichtige Energiequelle für Zellen, und ein Mangel an Glukose kann zu einer Vielzahl von Symptomen und Komplikationen führen. Bei niedrigem Glukosespiegel (Hypoglykämie, im Allgemeinen weniger als 70 mg/dl im Nüchternblutzuckerspiegel, sollte aber nicht durch einen einzigen Wertbestimmt werden 1) sind die häufigsten Symptome Schwäche, Verwirrtheit, Schwitzen und Kopfschmerzen. Es kann auch die Gehirnfunktion stören und das Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse und Mortalität erhöhen2. Umgekehrt ist Hyperglykämie eine Erkrankung, bei der die Plasmaglukosekonzentration die normalen Werte überschreitet (im Allgemeinen > 126 mg/dl bei Nüchternblutzuckerspiegel3). Dies kann bei Personen mit Diabetes auftreten, die entweder ein Defizit in der Insulinproduktion oder -verwertung haben. Hyperglykämie kann zu diabetischer Ketoazidose führen, die auftritt, wenn der Körper Glukose nicht zur Energiegewinnung verwenden kann, sondern stattdessen Fettsäuren als Brennstoff abbaut. Der hyperglykämische hyperosmolare Zustand erhöht auch die Mortalität4. Langfristige Hyperglykämie kann Blutgefäße, Nerven und Organe schädigen und zur Entwicklung mehrerer chronischer Komplikationen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Retinopathien und Nierenerkrankungen führen. Daher muss die Blutzuckerkonzentration in einem engen Bereich zwischen 100 mg/dl und 120 mg/dl gehalten werden.

Der Blutzucker wird durch das Gleichgewicht zwischen Glukosezufuhr und -ausgang in einem Einkompartimentmodell reguliert (Abbildung 1A). Der Glukoseeintrag umfasst absorbierte Glukose aus der Nahrung und die Glukoseproduktion aus Leber, Nieren und Dünndarm. Die Glukoseproduktion umfasst die Glukoseaufnahme im Gewebe und die Glukoseentsorgung aus den Nieren. Sowohl die Menge der Glukosezufuhr als auch die Glukoseabgabe werden durch endokrine Hormone reguliert. Zum Beispiel werden Glucagon, Corticosteron und Katecholamine, die als gegenregulatorische Hormone bekannt sind, freigesetzt, wenn der Blutzuckerspiegel sinkt5. Sie stimulieren den Abbau von Glykogen und die Synthese von Glukose, hauptsächlich aus der Leber; Diese Prozesse werden als Glykogenolyse bzw. Glukoneogenese bezeichnet. Hyperglykämie erhöht die Insulinfreisetzung aus den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse und stimuliert die Glukoseaufnahme in den Muskeln, im Fettgewebe und im Herzen 6,7,8,9. Bewegung erhöht die insulinunabhängige Glukoseaufnahme10. Das sympathische Nervensystem erhöht die Glukoseaufnahme in Muskeln und braunem Fettgewebe 6,11. Um die Fähigkeit zu messen, den Glukosestoffwechsel in peripheren Geweben zu regulieren, verwenden Forscher typischerweise den Glukosetoleranztest (GTT) und den Insulintoleranztest (ITT) (Abbildung 1B, C). Bei GTT müssen zwei Faktoren berücksichtigt werden: Insulinfreisetzung und Insulinsensitivität (Abbildung 1B). Die Glukosekonzentrationskurve während des 120-minütigen Tests ist jedoch bei jeder Maus unterschiedlich, was sich auf unterschiedliche Mengen der Hormonfreisetzung auswirken kann. Bei ITT wird der Blutzucker sowohl durch die Insulinsensitivität als auch durch die Freisetzung von gegenregulatorischen Hormonen reguliert. Daher ist es schwierig, die genaue Bedeutung des Glukosestoffwechsels, der Insulinfreisetzung und der Insulinsensitivität in GTT und ITT in Situationen zu bestimmen, in denen der Blutzuckerspiegel nicht konstant ist.

Um diese Probleme zu überwinden, ist es wünschenswert, den Blutzucker auf einem konstanten Niveau zu halten (oder "Klemme"). Bei hyperglykämischer Klemme wird Glukose in den Blutkreislauf infundiert, um den Blutzuckerspiegel auf ein bestimmtes Niveau zu erhöhen, und dann für einen bestimmten Zeitraum auf diesem Niveau gehalten. Die Menge der infundierten Glukose wird auf der Grundlage von Messungen des Blutzuckerspiegels alle 5-10 Minuten angepasst, um einen stabilen Zustand aufrechtzuerhalten. Diese Technik ist besonders nützlich, um die Parameter der Insulinsekretion bei einem geklemmten Glukosespiegel zu verstehen. Hypoglykämische Klemme ist eine Methode zur Aufrechterhaltung eines niedrigen Blutzuckerspiegels durch Injektion von Insulin. Glukose wird mit einer variablen Rate infundiert, um einen bestimmten Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten. Wenn sich die Maus nicht von einer Hypoglykämie erholen kann, sollte mehr Glukose infundiert werden.

Obwohl die Durchführung von hyperglykämischen und hypoglykämischen Klemmen viele Vorteile bietet, gelten die chirurgischen und experimentellen Verfahren als technisch schwierig. Daher waren nur wenige Forschungsgruppen in der Lage, dies zu tun. Unser Ziel war es, diese Methoden für Forscher mit finanziellen und personellen Einschränkungen zu beschreiben, um diese Experimente mit einem geringeren Budget zu starten.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Kumamoto genehmigt.

HINWEIS: Zur Schmerzlinderung wurde Ibuprofen 48 Stunden lang in Trinkwasser (0,11 mg/ml) und Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg i.p.) 30 Minuten vor der Operation verabreicht. Zu den sterilen Bedingungen gehören Handschuhe, Masken und autoklavierte Instrumente, die mit Ethylenoxid zwischen Tieren sterilisiert wurden. Die Operation wurde auf einem Heizkissen durchgeführt, das auf 37 °C eingestellt und für jedes Tier mit einer neuen Labormatte bedeckt war. Vor der Operation wurde der Operationsbereich mit einer Betadinlösung und Alkohol gereinigt. Alle chirurgischen Instrumente wurden mit einem Autoklaven sterilisiert (für nicht mehr als zwei Operationen). Vor dem Schnitt wurden die Mäuse untersucht, um sicherzustellen, dass sie vollständig betäubt waren. Die Anästhesietiefe für jede Maus wurde vor und während der Operation durch ein Zehenkneifen bestimmt. Die Akklimatisierungszeit betrug jedes Mal nicht mehr als 5 Minuten. Befolgen Sie die Anweisungen der IACUC an der jeweiligen Einrichtung.

1. Herstellung von Schläuchen für die Halsvene und die Halsschlagader

  1. Sterilisieren Sie alle Schläuche, Polypropylen-Verbrauchsmaterialien (z. B. Pipettenspitzen) und Nähte mit einem Autoklaven oder Ethylenoxid. Verbinden Sie für die Halsvene 8 cm Schlauch1 (siehe Materialien) und 3 cm Schlauch2 mit Klebstoff (Abbildung 2A). Legen Sie 2 mm Schlauch1 auf die Oberseite, da Schlauch 2 (Polyethylen) zu hart ist und Blutgefäße beschädigen kann (Schlauch1.1).
  2. Verlängerungsrohr für die Halsvene (Tubing1.2) zur Infusion von Glukose und Insulin
    1. Bereiten Sie zwei 30-cm-Röhrchen und ein 10-cm-Röhrchen mit Schlauch2 vor (Abbildung 2A). Schneiden Sie das scharfe Ende einer 20-μl-Pipettenspitze ab (oder alles, was ein schmales Spitzenende mit einem Außendurchmesser < 0,5 mm hat, um es mit Schlauch 1.1 zu verbinden) und legen Sie drei Schläuche2 (30 cm, 30 cm und 10 cm) zusammen hinein. Mit Klebekleber versiegeln.
    2. 5 cm Schlauch1 am anderen Ende des Schlauchs2 anbringen.
  3. Für die Halsschlagader (Schlauch 1.3): Dehnen Sie den Schlauch2, um ihn dünner zu machen. Verbinden Sie 8 cm Schlauch1 und 3 cm des gedehnten Schlauchs2 mit Klebstoff (Abbildung 2A). Markieren Sie 9 mm von der Spitze entfernt.
  4. Nadel mit nicht scharfem Ende, die den Schlauch mit der Spritze verbindet: Machen Sie mit einer Metallfeile einen Kratzer in der Nähe des scharfen Endes der Nadel (23 G), biegen Sie sie vorsichtig mit einer Zange hin und her und brechen Sie sie. Machen Sie den gleichen Schnitt in der Mitte der Nadel, um ein Stück Metallverbinder herzustellen (Abbildung 2A).
  5. Verlängerungsschlauch für die Arterie zur Blutentnahme (Schlauchset1.4): Verbinden Sie 10 cm Schlauch1 mit dem Metallanschluss und der nicht scharfen Nadel, die in Schritt 1.4 hergestellt wurde.
    HINWEIS: Alle Schläuche und Nähte werden mit einem Autoklaven oder Ethylenoxid sterilisiert

2. Chirurgie

  1. Betäuben Sie eine Maus mit Isofluran (1,5-2,0%) oder Ketamin/Xylazin (Ketamin 10 mg/ml, Xylazin 1 mg/ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung, 0,1 ml/10 g Körpergewicht (KG) durch intraperitoneale [ip]-Injektion). Halten Sie die Maus auf dem warmen Pad (37 °C), um körperliche Belastungen zu reduzieren. Warten Sie 5-10 Minuten auf die Tiefennarkose. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Pedalreflex, Atmung und Herzfrequenz und die Reaktion auf Reize durch Zehenkneifen. Während der Operation sollte chirurgisches Klebeband verwendet werden, um die Nasenkappe für eine kontinuierliche Inhalation der Anästhesie am Operationstisch zu befestigen. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
  2. Füllen Sie heparinisierte Kochsalzlösung (100 U/ml) in die Schläuche 1.1 und 1.3 und verbinden Sie sie mit einer 1-ml-Spritze mit einer nicht scharfen Nadel (Abbildung 2B). Schließen Sie das Ende des Schlauchs3 (siehe Materialtabelle), indem Sie ihn mit einem Lötkolben schmelzen, der als Kappen für Schläuche1.1 und Schläuche1.3 verwendet wird.
  3. Rasieren und wischen Sie den ersten (Zwischenschulter auf der Rückseite) und den zweiten (Hals vorne) Schnittbereich mit drei Zyklen von 10% Betadin ab, gefolgt von einem präoperativen Präparat mit sterilem 70% Alkohol. Machen Sie einen kleinen vertikalen Mittellinienschnitt 5 mm Kopflinie zum Brustbein, stumpf das Gewebe sezieren und die Arterie freilegen. Trennen Sie den Vagusnerv von der Arterie. Dies reduziert die negativen Auswirkungen der Entfernung des Vagusnervs auf den Glukosestoffwechsel.
    HINWEIS: Der Schritt vom ventralen Schnitt bis zu dem Schritt, an dem der Katheter in die Vene eingeführt und mit Seidennähten gesichert wird, wird unter einem Mikroskop durchgeführt.
  4. Legen Sie zwei Seidennähte unter die Arterie. Stoppen Sie den Blutfluss, indem Sie eine Naht fest auf der kranialen Seite (Abbildung 2C-1) und die andere locker auf der kaudalen Seite (Abbildung 2C-2) binden, was ausreicht, um den Blutfluss zu stoppen, aber genug, um sich später wieder zu öffnen. Legen Sie eine weitere Naht unter die Arterie (Abbildung 2C-3).
  5. Schneiden Sie die Arterie in der Nähe von Abbildung 2C-1 mit einer Federschere und legen Sie Schlauch1.3 in die Arterie. Machen Sie sowohl an der Arterie als auch am Schlauch eine lockere Bindung (Abbildung 2C-3, nicht fest binden. Der Schlauch wird tiefer in die Arterie eingeführt). Öffnen Sie den Knoten auf der kaudalen Seite (Abbildung 2C-2), um den Schlauch einzuführen, bis die 9-mm-Markierung den Knoten in der Mitte erreicht (Abbildung 2C-3). Binden Sie alle Ligaturen sicher zusammen und spülen Sie sie mit heparinisierter steriler Kochsalzlösung.
  6. Legen Sie die rechte Halsvene aus demselben Schnitt wie die rechte Halsschlagader für den Jugularkatheter frei. Isolieren Sie das Schädelende und ligieren Sie es mit Seidennaht (Abbildung 2D-1, Materialtabelle). Legen Sie ein weiteres Stück Naht am kaudalen Ende der freiliegenden Vene an (Abbildung 2D-2). Schneiden Sie die Vene in der Nähe der Markierung Abbildung 2D-1 mit einer Federschere.
  7. Führen Sie den Katheter ein (nicht zu tief, um ein Eindringen in die Gefäße zu verhindern), binden Sie ihn ab und bestätigen Sie visuell, dass Blut entnommen wird. Spülen Sie mit heparinisierter steriler Kochsalzlösung (0,2 ml) und bestätigen Sie visuell, dass kein Blut im Katheter verbleibt.
  8. Legen Sie die Maus auf das neue sterile OP-Tuch, um eine Infektion ab der ersten Wunde zu verhindern. Drehen Sie die Maus um, wischen Sie mit drei Zyklen Betadin ab, gefolgt von einem präoperativen Präparat mit sterilem Alkohol, und machen Sie einen kleinen Schnitt zwischen den Schulterblättern.
  9. Führen Sie einen Nadelhalter vom Schnitt auf der Rückseite zur Bauchseite unter die Haut. Klemmen Sie die Katheter mit dem Nadelhalter fest, führen Sie sie unter die Haut und bringen Sie sie zurück. Reinigen Sie die Inzisionsstelle und verschließen Sie die ventralen Schnitte mit einer synthetischen Naht (Durchmesser 0,15-0,2 mm). Klemmen Sie den Venenkatheter mit Micro Serrefine an der Inzisionsstelle zwischen den Schulterblättern.
  10. Schneiden Sie den Katheter 1 cm über der Klemme ab, spülen Sie ihn mit heparinisierter Kochsalzlösung und verschließen Sie ihn mit einer Kappe (Schritt 2.4). Befolgen Sie das gleiche Verfahren für den arteriellen Katheter. Schließen Sie den dorsalen Schnitt mit einer synthetischen Naht (Durchmesser 0,15-0,2 mm).
  11. Legen Sie die Maus in einen warmen, sauberen Käfig (Abbildung 2E). Führen Sie täglich eine postoperative Versorgung durch.

3. Wiederherstellung

  1. Bringen Sie die Maus einzeln unter, da eine andere Maus in den Katheter im Gruppengehäuse beißen kann.
    1. Um Stress durch soziale Isolation zu reduzieren, halten Sie Mäuse mit Umweltanreicherungen (z. B. Unterständen). Führen Sie täglich eine postoperative Versorgung durch. Um Schmerzen, Ängste und Beschwerden zu lindern, bieten Sie postoperative Versorgung, einschließlich Analgesie (Ibuprofen im Trinkwasser (0,11 mg/ml).
    2. Beobachten Sie Mäuse auf Anzeichen einer Infektion wie Eitern, Lethargie oder Schmerzen an der Inzisionsstelle. Die meisten gesunden Mäuse beginnen etwa 2 Stunden nach der Operation zu laufen und zu fressen. Eine gebeugte Haltung, zerzaustes Fell und verminderte Nahrungsaufnahme können auf Schmerzen hinweisen. Wenn diese Anzeichen beobachtet werden, euthanasieren Sie die Mäuse sofort ein, indem Sie sie unter tiefer Betäubung oder Kohlendioxid-Erstickung enthaupten.
  2. Blut tritt in den Katheter in der Arterie ein und bildet ein Gerinnsel. Um die Katheterleitungen aufrechtzuerhalten, entfernen Sie das Gerinnsel täglich, indem Sie die Schritte 3-6 befolgen.
  3. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze und eine 23-g-Nadel (nicht scharfes Ende) mit heparinisierter Kochsalzlösung (100 U/ml). Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer leicht mit Isofluran (1,0%-1,5%). Entfernen Sie dann die Maus aus der Kammer und führen Sie die Entfernung von Gerinnseln unter Isofluran-Anästhesie mit einer Nasenkappe durch.
  4. Klemmen Sie den Schlauch für die Arterie auf der Rückseite der Maus mit Micro Serrefin fest, entfernen Sie die Kappe und extrahieren Sie das Blut und die Blutgerinnsel. Spülen Sie den Katheter mit heparinisierter Kochsalzlösung mit einer weiteren 1-ml-Spritze mit einer 23-G-Nadel (nicht scharfes Ende) und verschließen Sie ihn erneut. Reinigen Sie die Venenleitung wie die arterielle Leitung bei starker Gerinnung.
  5. Führen Sie das gleiche Verfahren durch, um den Katheter 3-5 Tage lang einmal täglich zu reinigen.
  6. Überprüfen Sie das Körpergewicht der Maus. Wenn das Körpergewicht ab dem Tag der Operation um mehr als 10 % abnimmt, wenden Sie unterstützende Pflege an und versuchen Sie, den normalen Körperkonditionswert zu verbessern, und verwenden Sie die Maus für ein weiteres Experiment.
    HINWEIS: Der Gewichtsverlust der Tiere betrug in den Experimenten in dieser Studie weniger als 10%. Gewichtsverlust wirkt sich stark auf den systemischen Glukosestoffwechsel aus. Daher wird empfohlen, auf die Erholung des Körpergewichts zu warten oder das Klemmexperiment zu entfernen.

4. Richten Sie das Pumpensystem ein (für hypoglykämische Klemme)

  1. Bereiten Sie 1 U/ml Insulin in 0,1% BSA-Kochsalzlösung, 30% Glukose in Kochsalzlösung und heparinisierter Kochsalzlösung vor.
  2. Messen Sie das Körpergewicht der Maus. Berechnen Sie das Volumen für 1 U/ml Insulin, um das Insulin infundieren zu lassen (10 mU/kg/min). Infusion von 1,7 μl/min Insulinlösung in die Mäuse im Clamp-Experiment. Um 300 μl Insulininfusion herzustellen, beträgt das erforderliche Volumen für 1 U/ml Insulin (μl) 2,647 (μl/g) x Körpergewicht (g). Ein Volumen von 300 μl Insulininfusat reicht aus, um das Clamp-Experiment an 1 Maus zu beenden. Tabelle 1 zeigt ein Beispiel für die Infusion von Insulin.
  3. Füllen Sie Insulininfundat und 30 % Glukose in jede Hamilton-Spritze, verbinden Sie sie mit Schlauch 1.2 und setzen Sie die Spritze auf die Spritzenpumpe (Abbildung 3A). Jede Lösung wird in Schlauch 1.2 gefüllt. Füllen Sie Kochsalzlösung in ein 1-ml-Spritzen- und Schlauchset 1.4 (Abbildung 2A).
  4. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (1,0%-1,5%) und verbinden Sie den Schlauch1.2 mit dem Venenkatheter und den Schlauchset1.4 mit dem arteriellen Katheter (Abbildung 3A). Verwenden Sie Zellophanband, um die Schläuche zusammenzuhalten.
  5. Legen Sie die Maus in ein leeres 500-ml-Becherglas.
    HINWEIS: Verwenden Sie für hyperglykämische Clamp Kochsalzlösung anstelle von 1 U/ml Insulin.

5. Hypoglykämische Klemme

  1. Messen Sie den Blutzuckerspiegel alle 5-10 Minuten, wie in Abbildung 3B gezeigt, und entnehmen Sie Blutproben für Hormonmessungen bei -15 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten, 40 Minuten, 60 Minuten, 80 Minuten, 100 Minuten und 120 Minuten. Befolgen Sie Schritt 5.2, um den Blutzucker zu messen.
    HINWEIS: Es ist nicht notwendig, den Blutzucker zu jedem Zeitpunkt zu messen, aber es wird empfohlen, ihn mindestens alle 10 Minuten zu messen. Messen Sie den Blutzucker alle 5 Minuten, wenn der Blutzuckerspiegel und die Glukoseinfusionsrate nicht konstant sind.
  2. Klemmen Sie das obere Ende des Schlauchsets1.4 und schließen Sie eine neue Spritze an, extrahieren Sie 50 μl Blut und legen Sie es zum Waschen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Messen Sie den Blutzuckerspiegel.
    HINWEIS: Dies ist das Blut, das durch die Kochsalzlösung im Röhrchen verdünnt wurde, weil der Katheter nach der vorherigen Probenahme gewaschen wurde. Ein Volumen von 50 μl reicht aus, um verdünntes Blut durch reines Blut zu ersetzen.
  3. Lagern Sie das verdünnte Blut (rote Blutkörperchen). Waschen Sie das gepoolte Blut (~500 μl) mit Kochsalzlösung (siehe Schritte 5.11-5.12) und kehren Sie in den Körper zurück, um Hypoxie zu vermeiden.
  4. Der Katheter ist mit der Arterie mit hohem Blutdruck verbunden, so dass beim Lösen der Klemme Blut abfließt und zur Messung der Glukose mit einem praktischen Glukosemessgerät verwendet wird. 50 μl Kochsalzlösung infundieren, um genügend Blutflüssigkeit zu erhalten.
  5. Entnehmen Sie für die Blutentnahme weitere 50 μl Blut und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen auf Eis. 100 μl (50 μl Ersatz + 50 μl Probenahme) Kochsalzlösung infundieren.
  6. Starten Sie nach 0 Minuten Blutzuckermessung die Insulinspritzenpumpe. Zuerst 30 mU/kg/min für 2 min (5,1 μl/min) in Bolus infundieren, dann 10 mU/kg/min (1,7 μl/min) Infusion für den Rest der Dauer.
  7. Messen Sie den Blutzuckerspiegel und ändern Sie die Glukoseinfusionsrate alle 5-10 Minuten für 120 Minuten.
  8. Schaffen Sie einen stabilen Zustand, in dem sich die Glukoseinfusionsrate nicht ändert und der Blutzuckerspiegel 50 mg/dl beträgt.
  9. Nach der Entnahme der Blutprobe bei t = 120 min wird ein Euthanasiemittel in die Halsvene infundiert und Gewebe für die RNA- oder Proteinanalyse entnommen.
  10. Zentrifugieren Sie Blut bei 1000 x g für 5 min und messen Sie die Hormonkonzentration wie Insulin oder c-Peptid mit einem ELISA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  11. Zum Waschen von Blut zentrifugieren Sie das Blut bei 1000 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 500 μl heparinisierte Kochsalzlösung hinzu und führen Sie das Pipettieren durch.
  12. Wiederholen Sie die Wäsche erneut und geben Sie die gewaschenen roten Blutkörperchen in eine 1-ml-Spritze für die Arterie. Die Blutzellen werden automatisch wieder infundiert, wenn in den Schritten 5.2 und 5.3 50 oder 100 μl Kochsalzlösung infundiert werden. Überwachen Sie den Hämatokrit sorgfältig, um Hypoxie zu vermeiden.
    HINWEIS: Für die Blutzuckermessung wurde ein handelsübliches handliches Glukosemessgerät verwendet.

6. Hyperglykämische Klemme

  1. Befolgen Sie die Schritte wie bei der hypoglykämischen Clamp-Technik, jedoch ohne Insulininfusion und mit einem auf 250-300 mg/dl eingestellten Blutzucker. Messen Sie den Blutzuckerspiegel alle 5-10 Minuten, wie in Abbildung 3B gezeigt, und entnehmen Sie Blutproben für Hormonmessungen bei -15 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten, 40 Minuten, 60 Minuten, 80 Minuten, 100 Minuten und 120 Minuten.
  2. Schließen Sie eine neue Spritze an das Schlauchset1.4 an, extrahieren Sie 50 μl Blut und legen Sie sie zum Waschen in ein 1,5-ml-Röhrchen.
  3. Entnehmen Sie für die Blutentnahme weitere 50 μl Blut und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen auf Eis. 100 μl (50 μl Ersatz + 50 μl Probenahme) Kochsalzlösung infundieren.
  4. Starten Sie nach 0 Minuten Blutzuckermessung die Glukosespritzenpumpe. Zuerst 30 g/kg/min für 2 min (5,1 μl/min) in Bolus ziehen, dann 10 g/kg/min (1,7 μl/min) für den Rest der Dauer.
  5. Messen Sie den Blutzuckerspiegel und ändern Sie die Glukoseinfusionsrate alle 5 -10 min für 120 min. Schaffen Sie einen stationären Zustand, in dem sich die Glukoseinfusionsrate nicht ändert und der Blutzuckerspiegel 250-300 mg/dl beträgt, ein geklemmter hyperglykämischer Zustand.

Ergebnisse

Die hypoglykämische Clamp-Studie wurde an männlichen C57BL/6N-Mäusen (8 Wochen alt, mehr als 25 g KG) durchgeführt, die zu Beginn des Experiments 3 Stunden nüchtern waren (Abbildung 4A, B). Der anfängliche Blutzuckerspiegel betrug 136 mg/dl (t = -15 min). Wenn es weniger als 90 mg/dl beträgt, kann dies entweder daran liegen, dass die Operation nicht gut verlaufen ist, der Arterienkatheter zu tief eingeführt wurde oder Blutgerinnsel in den Blutfluss gelangt sind. Der Zustand der Maus nach der Operation beeinflusst den Energiestoffwechsel in der Maus. Der physiologische Glukosestoffwechsel kann unter schlechten Gesundheitsbedingungen nicht gemessen werden. C57BL ist nach der Operation anfälliger für Gerinnsel; Mäuse mit einem höheren Körpergewicht, wie FVB- oder ICR-Mäuse, verlieren aufgrund von Gerinnselwaschungen nach der Operation seltener an Gewicht. Daher ist es für Anfänger besser, FVB-Mäuse zum Üben von Klemmverfahren zu verwenden. C57BL-Mäuse benötigen eine intensivere Pflege. Das 9-mm-Kathetereinführen in die Arterie hat uns auch bei FVB- und ICR-Mäusen keine Probleme bei der Blutentnahme bereitet. Insulin wurde bei t = 0 min begonnen und der Blutzuckerspiegel sank (Abbildung 4A). Die GIR war zwischen t = 0 min und t = 70 min nicht stabil gewesen. Anschließend wurde es nach 80 Minuten zu einem stabilen Zustand.

Die hyperglykämische Clamp-Studie wurde auch an männlichen C57BL/6N-Mäusen (8 Wochen alt, mehr als 25 g KG) durchgeführt, die zu Beginn des Experiments 3 Stunden nüchtern waren (Abbildung 4C,D). Nach der Messung des Blutzuckers und der Entnahme von Blutproben bei t = -15 und t = -5 min wurde Glukose ab t = 0 min infundiert. Der Blutzuckerspiegel betrug 250 mg/dl bei t = 40 min. Der stationäre Zustand setzte sich von t = 30 min bis zum Ende fort.

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Abbildung 1: Regulierung des Blutzuckerspiegels. (A) Konzeptdiagramm, das die Regulierung des Blutzuckers im Körper veranschaulicht. (B,C) Regulation des Glukosestoffwechsels im (B) Glukosetoleranztest (GTT) und (C) Insulintoleranztest (ITT). Mehrere Faktoren regulieren den Blutzuckerspiegel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Vorbereitung der Schläuche und Schritte der Operation. (A) Bilder von Schläuchen für die Halsschlagader und die Halsvene. Die Schlauchnummern stimmen mit den Schrittnummern des Protokolls überein. (B) Verfahren zur Vorbereitung der Schläuche für die Operation. (C, D) Die nummerierten Positionen, an denen die Seidenfäden ligiert werden, um den Katheter in die (C) Arterie und (D) Vene einzuführen. Positionen der Seidenfäden in der kranialen (C-(1)) und kaudalen Seite der Arterie (C-(2)) und einer weiteren in der Mitte (C-(3)) (Verfahren 2-4). Positionen der Seidenfäden in der kranialen (D-(1)) und kaudalen Seite der Vene (D-(2)) und einer weiteren in der Mitte (D-(3)) (Verfahren 2-6). (E) Diagramm der arteriellen und venösen Kanülen, die aus dem Rücken austreten Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Einstellung der Klemme. (A) Diagramm, das den Aufbau von Schläuchen, Pumpen, Spritzen und der Maus zeigt. (B) Blatt zur Aufzeichnung des Blutzuckerspiegels und der Glukoseinfusionsrate. 50 μl Blut werden bei t = -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min und 120 min gesammelt. Die Insulininfusionsrate betrug 5,1 μl/min von t = 0 bis 2 min und änderte sich auf 1,7 bei t = 2 min. Der Blutzuckerspiegel wurde alle 10 Minuten gemessen. Der Blutzucker wurde alle 5 Minuten gemessen, wenn sein Wert nicht stabil war. Die Glukoseinfusionsrate wurde jedes Mal geändert, wenn der Blutzucker gemessen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von hypoglykämischer Klemme und hyperglykämischer Klemme. (A) Blutzuckerspiegel und (B) Glukoseinfusionsrate von hypoglykämischer Klemme. (C) Blutzuckerspiegel und (D) Glukoseinfusionsrate der hyperglykämischen Klemme. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

LösungBerechnungFür 20 g Maus
1 U/ml Insulin(2,647 x Körpergewicht) μL52,9 μl
0,1% BSA-Kochsalzlösung300 μL - Volumen des Insulins (μL)247,1 μl

Tabelle 1: Eine Beispielrechnung für die Herstellung von Insulininfusion.

Diskussion

Die hier beschriebene Methode ist eine einfache Methode, die mit Pipettenspitzen, Spritzen und anderen Gegenständen durchgeführt werden kann, die in normalen Labors zu finden sind. Obwohl Forscher möglicherweise zusätzliche Schläuche und Pumpen kaufen müssen, werden keine teure Ausrüstung benötigt. Daher ist dieses Protokoll der Katheterisierung und Klemme im Vergleich zu früheren Berichten einfacher zu starten 12,13,14.

Die Klemmtechnik wurde um 1970 entwickelt und bei Mäusen und Menschen eingesetzt15. Es ist eine nützliche Methode zur genauen Messung des Glukosestoffwechsels und gilt als Goldstandard. Es ist jedoch keine gängige Technik, die von vielen Forschern verwendet wird. Die hyperinsulinämisch-euglykämische Clamp-Technik wurde bei Mäusen13 und Ratten14 berichtet, aber die Katheterisierungsmethode ist hier anders, und die Leser können die einfachere für ihre Experimente wählen. Eines der Ziele dieses Papiers ist es, die Hürde für den Beginn eines Experiments zu verringern. Daher haben wir detaillierte Informationen zu den Materialien handgefertigter Katheter, chirurgischen Eingriffen und einem Beispiel für einen experimentellen Zeitverlauf bereitgestellt. Diese sind informativ für den Forscher, der zum ersten Mal versucht, eine Klemme durchzuführen.

Die Insulinsekretion bei Fettleibigkeit und Diabetes ist stadienabhängig. Viele Berichte deuten darauf hin, dass die Insulinsekretion bei Fettleibigkeit erhöht ist, um den Blutzucker im insulinresistenten Zustandzu senken 16, aber die β-Zell-Funktion wird bei Typ 2 DMbeeinträchtigt 17,18. Tatsächlich wurde berichtet, dass die Anzahl und Fläche der Pankreasinseln und die Insulinsekretion in Adipositas-Mausmodellen erhöht sind, wie z. B. Mäusen, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden19 oder Mäusen mit Leptinmangel20. In diesen Mausmodellen, die einen offensichtlichen Phänotyp aufweisen, können Unterschiede durch Untersuchung des Blutinsulinspiegels 15-30 Minuten nach Glukoseverabreichung im GTT festgestellt werden. In einigen Fällen ist es jedoch nicht einfach, die Unterschiede in der Insulinsekretion zu bestimmen. Wenn zum Beispiel transgene (Tg) Mäuse einen Blutzuckerspiegel von 500 mg/dl haben, während eine WT-Maus 300 mg/dl hat und beide Mäuse den gleichen Insulinspiegel im Blut haben, können wir dann sagen, dass die Insulinsekretion in Tg abnimmt? In diesem Fall können wir die Fähigkeit zur Insulinsekretion nicht vergleichen, es sei denn, der Blutzuckerspiegel ist mit der hier vorgestellten Methode gleich. Dies ist einer der Gründe, warum es keine etablierte Theorie darüber gibt, wann sich die β-Zell-Funktion beim Übergang von Fettleibigkeit zu Diabetes zu verschlechtern beginnt. Wir können die Insulinsekretion auch durch Primärkultur der Bauchspeicheldrüsemessen 21 oder ex vivo22. Es wird jedoch die Wirkung des Zentralnervensystems auf die Insulinausschüttung ruinieren, da die Innervation des Vagusnervs entfernt wird. Die postabsorptive Insulinsekretion ist bekannt, aber das Gehirn und das autonome Nervensystem regulieren auch die Insulinausschüttung23. Das Experiment zur Analyse des letzteren sollte in einer nicht betäubten, ungehemmten und schmerzfreien Blutentnahme durchgeführt werden. Aus diesem Grund muss in Schritt 2.3 auch der Vagusnerv von der Halsschlagader getrennt werden.

Es wurde berichtet, dass Diabetes mellitus aufgrund von Insulinresistenz und erhöhter Sekretion von Glucagon24 und anderen gegenregulierenden Hormonen Hyperglykämie verursacht25. Darüber hinaus können wiederholte Hypoglykämie-Episoden bei Menschen mit Diabetes aufgrund von Insulindosierungsfehlern oder anderen Ursachen zu einer Erkrankung führen, die als rezidivierende Hypoglykämie bezeichnet wird und bei der Patienten anfällig für Hypoglykämie sind26. Es wurde vermutet, dass die Abfallrate der Glykämie bei hypoglykämischer Klemme den peripheren oder zentralen Nachweis der Hypoglykämie beeinflusst27. Eine langsam einsetzende Hypoglykämie kann geeignet sein, um die Rolle von Glukosesensoren in portalen Mesenterialvenen zu untersuchen, während eine sehr schnelle Abnahme des Blutzuckers für die Untersuchung von Glukosesensoren im Gehirn geeignet sein kann27. 1 U/ml Insulin wird bei mageren C57BL-Mäusen angewendet. Bei übergewichtigen Mäusen ist jedoch eine höhere Insulinkonzentration erforderlich, da sie eine Insulinresistenz haben und 1 U/ml nicht ausreicht, um den Blutzuckerspiegel zu senken.

Im Ein-Kompartiment-Modell des Blutzuckerpools (Abbildung 1A) kann die Menge der absorbierten Glukose die Rate des Glukoseeintragsbeeinflussen 14. So kann die Rate der Glukoseproduktion, eines der Hauptziele bei der Messung der hyperinsulinämisch-euglykämischen Klemme, durch die Dauer des Fastens beeinflusst werden. Eine lange Fastenzeit kann jedoch die Freisetzung von gegenregulatorischen Hormonen erhöhen. Daher legen die Forscher die Fastenzeit entsprechend ihrem Analysezweck fest. Eine andere Klemmmethode umfasst die Blutentnahme aus dem Schwanz, die einfach ist, da nur eine intravenöse Kanüle eingeführt werden muss14. Blut wird jedoch in einer Fixierung gesammelt, was zu einem moderaten Maß an Fixierungsstress und einem Anstieg von Plasmakatecholaminen und anderen Stresshormonen führt14. Darüber hinaus ist es vorzuziehen, die Hormonkonzentrationen im Blutfluss in der Körpermitte und nicht im Blut an den Extremitäten zu messen. Daher ist die Blutentnahme aus Arterien bei frei beweglichen Mäusen am besten geeignet, um den Glukosestoffwechsel physiologisch zu messen. Die Mäuse bewegen sich nicht, und ein Schwenken ist nicht erforderlich, wenn sie sich an die Versuchsumgebung gewöhnt haben. Es wird jedoch empfohlen, ein Drehgelenk zu verwenden, um ein Verheddern von Infusions- und Probenahmeleitungen zu verhindern. Schlauch1.2 und Schlauchsatz1.4 (Abbildung 3A) sind nicht für die Verwendung eines Drehgelenks geeignet. Das System sollte verbessert werden, wenn der Forscher ein Drehgelenk verwenden muss. Die Reinfusion von Blutzellen hat keinen Einfluss auf den etablierten Steady-State von Blutzucker und Insulin. Die vorliegende Methode kann auch auf Metabolomics-Studien mit Isotopen angewendet werden. Wenn beispielsweise kontinuierlich 13C-Glukose in die Vene infundiert wird, können die systemische metabolische Umsatzrate und intrazelluläre Zwischenmetaboliten gemessen werden28. Daher ist dies eine nützliche Methode zur Analyse des Glukosestoffwechsels.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Leading Initiative for Excellent Young Researchers (von MEXT); ein Zuschuss für wissenschaftliche Forschung (B) (Fördernummer JP21H02352); Japanische Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED-RPIME, Fördernummer JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); die Uehara Memorial Foundation; Astellas Foundation für die Erforschung von Stoffwechselstörungen; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation und Narishige Neuroscience Research Foundation. Wir danken auch Nur Farehan Asgar, Ph.D., für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Selbstklebender KleberHenkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
ELISA Kit (C-Peptid)Morinaga Institute of Bilogical Science IncM1304Maus C-Peptid ELISA Kit ELISA
Kit (Insulin)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411LBIS Maus Insulin ELISA Kit (U-Typ)
Handliches GlukosemessgerätNipro Co.11-777Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)Eli Lilly & Co.428021014Humulin R (100U/ml)
MausJapan SLC Inc.C57BL/6NCrSlcC57BL
NahtmaterialNatsume SeisakushoC-23S-560 Nr. 2Sterilisierte
SpritzenpumpePump Systems Inc.NE-1000
Synthetisches NahtmaterialVÖ MELHR-17
Schlauch1AS ONE Corporation9-869-01LABORAN(R) Silikonschlauch2
Fisher Scientific427400BD Intramedic PE-Schlauch
Schlauch3IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.Größe 5Polyethylen-Schlauch Größe 5

Referenzen

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BlutglukoseregulationInsulinsensitivit tgegenregulatorische ReaktionenGlukoseinfusionJugularvenenkatheterKarotisarterienkatheterGlukosestoffwechsel
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