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De-novo-Verfolgung von Lipiden mittels stabiler Isotopenmarkierung LC-TIMS-TOF MS/MS

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DOI:

10.3791/65590

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23. August 2024

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1Deparment of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Institute of Parasitology, Biology Centre CAS, 4Department of Biological Sciences, Florida International University, 5Department of Parasitology, University of South Bohemia, 6Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird eine Methode zum Screening von Lipidstrukturen durch Markierung stabiler Isotope unter Verwendung ihrer Retentionszeit, Mobilität und Fragmentierung vorgestellt.

Zusammenfassung

Lipide sind sehr vielfältig, und kleine Veränderungen in der Lipidstruktur und -zusammensetzung können tiefgreifende Auswirkungen auf kritische biologische Funktionen haben. Die Markierung stabiler Isotope (SIL) bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung der Lipidverteilung, -mobilisierung und des Metabolismus sowie für die De-novo-Lipidsynthese . Die erfolgreiche Implementierung der SIL-Technik erfordert die Entfernung von Interferenzen durch endogene Moleküle. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein analytisches Hochdurchsatzprotokoll für das Screening von SIL-Lipiden aus biologischen Proben; Es werden Beispiele für die De-novo-Identifizierung von Lipiden während der Entwicklung der Eierstöcke von Mücken gezeigt. Der Einsatz von komplementärer Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie für gefangene Ionen und Massenspektrometrie ermöglicht die Trennung und Zuordnung von Lipiden aus einer einzelnen Probe in einem einzigen Scan (<1 h). Der beschriebene Ansatz nutzt die jüngsten Entwicklungen in der datenabhängigen Erfassung und der datenunabhängigen Erfassung, indem er parallele Akkumulation in der Mobilitätsfalle verwendet, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation. Die Messung von SIL auf der Ebene der Fettsäurekette zeigt Veränderungen in der Lipiddynamik während der Entwicklung der Eierstöcke von Mücken. Die De-novo-Strukturen der Lipide werden basierend auf ihrer Retentionszeit, Mobilität und ihrem Fragmentierungsmuster sicher zugeordnet.

Einleitung

Bei der Analyse von Lipiddaten ist die Markierung stabiler Isotope (SIL) eine effektive Methode, um Stoffwechselwege in lebenden Organismen zu beurteilen. Bei dieser Methode werden Atome innerhalb eines Analyten durch stabile Isotope ersetzt, die 13C oder 2H enthalten. Diese Isotope werden weiter in Vorläufer eingebaut, die später in die Fettsäuren eingebettet werden und die Bereiche markieren, in denen sie sich befinden. Mit diesen Isotopen ist man in der Lage, die Verteilung und den Stoffwechsel von Lipiden zu identifizieren, da sie sich vom unmarkierten Hintergrundabheben 1. Gängige Massenspektrometrie-Plattformen sind nicht in der Lage, das Signal, das von endogenen Molekülen ausgeht,zu unterscheiden 2. Der Erfolg von SIL erfordert den Einsatz ultrahochauflösender Analysewerkzeuge. Die Flüssigchromatographie in Verbindung mit der hochauflösenden Mobilitätsspektrometrie für gefangene Ionen, der sequentiellen Fragmentierung, der Flugzeit-Tandem-Massenspektrometrie (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) ermöglicht die Trennung von markierten und unmarkierten Spezies2. Der Vorteil der LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS-Analyse besteht darin, dass das MS-Signal nach der Retentionszeit (RT) und Mobilität gefiltert werden kann, wodurch potenzielle Interferenzen endogener Moleküle sowie die Quantifizierung und Trennung aller gewünschten Spezies reduziert werden2. Bei TIMS wird ein Ion zunächst gegen eine gasmobile Phase stationär gehalten und anschließend entsprechend ihrer Beweglichkeit wieder freigesetzt. Dies bietet hochauflösende Mobilogramme und arbeitet gleichzeitig mit einer niedrigeren Spannung als frühere IMS-Instrumente3. Mobilogramme sind Diagramme der Masse zu Ladung im Vergleich zur Driftzeit, die zur Unterscheidung zwischen Verbindungen auf der Grundlage ihrer Driftzeit und des Ausmaßes der Überlappungverwendet werden können 4.

Durch die Verwendung einer zusätzlichen PASEF-Technik wird die Sequenzierungsgeschwindigkeit erheblich erhöht, ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen5. Die PASEF-Theorie beinhaltet die Akkumulation von Ionen, gefolgt von ihrer sequentiellen Freisetzung in der Reihenfolge ihrer Mobilität. Dies geschieht durch die Akkumulation von Ionen in paralleler Ausrichtung zu ihrer Beweglichkeit. Die Akkumulation auf diese Weise verhindert den Ionenverlust. Darüber hinaus erfolgt die Auswahl der Vorläuferionen gleichzeitig mit der Akkumulation und Freisetzung der Ionen. Bei dieser Methode wählt PASEF bei jedem TIMS-Scan mehrere Vorläufer in Reihe aus, anstatt der einzelnen Vorläufer pro Scan, die für ein TIMS-Gerät typisch sind, das PASEF nicht verwendet. Wenn die Vorläuferionen gleichzeitig akkumuliert und in 2-ms-Spitzen innerhalb eines TIMS-Scans von etwa 100 ms pro Frame freigesetzt werden, wird das Signal um mehr als eine Größenordnung verstärkt, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis3 erhöht wird. Die PASEF-Ergänzung des TIMS erhöht die Effizienz des MS/MS. Da TIMS-PASEF mit MS/MS gekoppelt ist, ist eine effizientere Fragmentierung möglich. Im Gegensatz zur herkömmlichen MS/MS-Detektion wird das Vorläufersignal vom TIMS-PASEF komprimiert, und die Fragmentionen werden gleichzeitig mit der TIMS-Elutionszeit und der Ionenmobilitätsposition des Vorläufers3 detektiert.

Bei der Datenerfassung von einem Massenspektrometer gibt es Optionen im gewünschten Scan-Modus. Bei der datenabhängigen Erfassung (DDA) werden Vorläuferionen aus dem MS1-Scan basierend auf ihren Häufigkeiten ausgewählt, bevor sie fragmentiert und der MS2-Scan durchgeführt wird. In diesem Scan-Modus werden so viele Vorläufer wie möglich fragmentiert. Der DDA-Ansatz ist zielgerichtet, und die Ergebnisse hängen von der Ionenauswahlab 3. Allerdings hat DDA-PASEF oft Probleme bei der Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten. Während DDA ein großartiges Werkzeug für eine fokussierte Analyse ist, haben komplexe Mischungen größere Schwierigkeiten bei der Datenerfassung6. Dies liegt daran, dass nur eine kleine Menge an Ionen gleichzeitig überwacht werden kann3. Die datenunabhängige Erfassung (DIA) ist eine Methode, bei der vorausgewählte Fenster von m/z unabhängig von ihrer Intensität fragmentiert werden und alle innerhalb des Bereichs7 gescannt werden. Mit diesem Scan-Modus werden ganze Ionenwolken vom IMS zum Massenspektrometer3 übertragen. In Proteomik-Studien führt dies dazu, dass im Vergleich zu DDA größere Mengen an Proteinen in kürzerer Zeit quantifiziert werden können. Darüber hinaus fehlen bei DIA im Vergleich zu DDA weniger m/z-Werte. Daher hat diese Alternative große Verbesserungen bei der Reproduzierbarkeit der Daten im Signal-Rausch-Verhältnis und eine bessere Quantifizierung als DDA gezeigt. In der vorliegenden Arbeit ist es unser Ziel, DIA in die von Tose et al.2 beschriebene Methode zu implementieren. Wir verbesserten die Reproduzierbarkeit und Intensität der Signale und lieferten weitere und schlüssigere Informationen über die Mobilisierung, Verteilung und den Metabolismus von SIL-Lipiden in biologischen Proben, indem wir die Vorteile der DDA- und DIA-Akquisition nutzten.

Protokoll

1. Vorbereitung der Probe

  1. Insekten-Dissektion
    1. Präparieren Sie die Eierstöcke der Aedes aegypti-Mücke im Alter von 7 Tagen in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung mit Mikronadeln.
    2. Sammeln Sie acht Eierstöcke aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Mikronadeln und lagern Sie sie in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 °C.
    3. Sammeln Sie Eierstöcke in biologischen Replikaten.
  2. Extraktion von Lipiden
    1. Geben Sie 10 μl internen Standard (ISTD) in einer Konzentration von 1 ppm in die acht entnommenen Eierstöcke. Das ISTD ist ein markiertes Lipidgemisch mit sieben Deuterium von 1-Pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin-D7 (15: 0-18:1 (D7) PC), Lysophosphatidylcholin-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-Pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamin-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-Oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-Dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-Pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-Octadecenoyl-sn-glycerol-D7 (18:1 MAG (D7)), Cholesteryloleat-D7 (18:1 (D7) Cholester).
    2. Warten Sie, bis es bei Raumtemperatur trocken ist. 100 μl Butanol/Methanol und 3 μl butyliertes Hydroxytoluol zugeben. 10 s lang manuell mit 1,5 mL Polypropylen-Stößeln homogenisieren.
    3. Den Stößel mit 200 μl Butanol/Methanol spülen und mit der homogenisierten Lösung vermengen.
    4. Beschallen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur und mittlerer Leistung für 30 min.
    5. Zentrifugenröhrchen bei 1600 x g für 10 min bei 20 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein Autosampler-Fläschchen mit 300 μl silanisierten Glaseinsätzen.

2. Einrichtung des Instruments

  1. Vorbereitung der mobilen Phase
    1. Bereiten Sie die mobile Phase mit einer Zusammensetzung von 30:40:30 (mobile Phase A) und 10:5:85 (mobile Phase B) unter Verwendung von Acetonitril, Wasser und Isopropanol als jeweiligem Verhältnis vor. In beiden mobilen Phasen werden 10 mmol/l Ammoniumformiat in Wasser und 0,1 % Ameisensäure zugegeben, um eine Pufferbedingung zu schaffen.
    2. Wiegen Sie 3,15 g Ammoniumformiat in 10 ml Wasser ab. Geben Sie 500 μl dieser Lösung in 12,5 ml Wasser. Nacheinander in einen 250-ml-Messkolben geben und etwa 2/3 des Kolbens mit Isopropanol füllen. Durch Schwenken mischen.
    3. Geben Sie 250 μl Ameisensäure (85 %), füllen Sie es mit 25 mL Acetonitril und Isopropanol bis zur Fülllinie von 250 mL und mischen Sie.
  2. Bestimmen Sie im MS-System auf der linken Seite des Bildschirms bei den MS-Einstellungen den Massenbereich, indem Sie 50 als Minimum und 1850 als maximale Scan-Einstellung auswählen.
    1. Wählen Sie Polarität als positiven Ionenmodus. Wählen Sie den Scan-Modus als DIA-PASEF aus. Wählen Sie dazu Analysemethode aus einer vorherigen DDA-Methode mit den folgenden LC-Parametern optimieren und öffnen.
      1. Für die Gradiententrennung:
        Probeninjektion: 0% B, Haltezeit 1 min.
        Auf 55% B erhöhen, bis 6.4 Min. halten.
        Auf 65% B erhöhen, bis 24 Min. halten.
        Auf 88% B erhöhen, bis 40.8 min halten.
        Auf 95% B erhöhen, bis 48.1 Min. halten.
        Auf 35% B abnehmen, bis 56 min halten.
        Auf 0% B abnehmen, bis 60 min halten.
      2. Für HPLC-Bedingungen:
        Injektionsvolumen: 5 μL
        Lösungsmittelrate: 0,25 mL/min
        Gesamtlaufzeit: 60 min, davon 5 min zur Vorkonditionierung der Säule.
      3. Bereiten Sie den Flüssigkeitschromatographen vor, indem Sie die Säule in den Flüssigkeitschromatographen einsetzen. Führen Sie eine Rohlinge aus, um die Säule zu reinigen und auf Undichtigkeiten zu prüfen. Dies zeigt sich darin, dass das Instrument keinen Druck oder Durchfluss hält.
  3. Um eine neue Methode zu erstellen, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus (Abbildung 1 und Abbildung 2).
    1. Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf Alle Instrumente verbinden. Wenn die Verbindung erfolgreich hergestellt wurde, piept das LC-System einmal, und auf dem Steuerungsbildschirm wird HyStar im Statusfeld ohne Fehlermeldungen angezeigt.
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Akquisition . Suchen Sie im Beispieltabellen-Navigator das Dropdown-Menü für das Tag, und wählen Sie eine vorherige Methode aus.
    3. Verdoppeln Sie die letzte Beispieltabelle. Klicken Sie auf Speichern unter... und speichern Sie die neue Probenliste im Format: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX), wobei (XXXX) ein kurzer Deskriptor der Analyse ist.
    4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Trennmethode und klicken Sie auf Methode bearbeiten. Klicken Sie auf Modulmethode bearbeiten.
    5. Klicken Sie auf Download. Wenn erfolgreich, wird Download erfolgreich angezeigt. Schließen Sie den Bildschirm ohne Speichermethode.
    6. Gehen Sie unter MS-Einstellungen zu TIMS-Einstellungen, wählen Sie 1/k0 Start bei 0,70 und 1/k0 Ende bei 1,85. Legen Sie die Rampenzeit auf 150 ms fest. Damit werden das Tastverhältnis und die Rampenrate automatisch angepasst.
    7. Wählen Sie im unteren Fenster die Registerkarte Quelle aus. Wählen Sie den Quellentyp als ESI und stellen Sie den Offset der Endplatte auf 800 V und die Kapillare auf 4500 V ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen des Verneblers und stellen Sie den Druck auf 4,0 bar ein. Stellen Sie das Trockengas auf 4,0 l/min und die Trockentemperatur auf 250 °C ein.
    8. Wählen Sie rechts neben der Registerkarte "Quelle" die Registerkarte "Optimieren" aus. Klicken Sie auf die Registerkarte "Allgemein " und stellen Sie unter der Überschrift "Übertragung" die folgenden Parameter sicher:
      Auslenkung 1 Delta: 70 V
      Trichter 1 RF: 250 vpp
      isCID-Energie: 0 eV
      Trichter 2 RF: 250 vpp
      Mehrpolig HF: 500 S/S.
      1. Stellen Sie unter der Überschrift der Kollisionszelle die folgenden Parameter sicher:
        Kollisionsenergie: 6,0 eV
        Kollision RF: 1200 vpp.
      2. Stellen Sie unter der Überschrift Quadrupol die folgenden Parameter sicher:
        Ionenenergie: 6 eV
        Geringe Masse: 250 m/z.
      3. Stellen Sie auf der Registerkarte "Pre-TOF" im Fokus die folgenden Parameter sicher:
        Übertragungszeit: 45 μs
        Vor-Impuls-Speicher: 5,0 μs.
    9. Klicken Sie auf die Registerkarte Unterverarbeitung (Processing Sub). Bei der Massenspektren-Peak-Detektion werden die folgenden Parameter sichergestellt:
      Absolute Schwelle: 667
      Absoluter Schwellenwert (pro 100 ms AccuTime): 445.
      1. Bei der Erkennung von Mobilitätsspitzen sind folgende Parameter zu beachten:
        Absolute Schwelle: 30,00.
    10. Klicken Sie auf die Unterregisterkarte TIMS . Stellen Sie auf der Registerkarte Versätze die folgenden Parameter sicher:
      Δt1: -20 V
      Δt2: -150 V
      Δt3: 70 V
      Δt4: 150 V
      Δt5: 0 V
      Δt6: 150 V
      Kollisionszelle: 300 V.
    11. Klicken Sie rechts neben der Registerkarte "Optimieren" auf die Registerkarte "MS/MS ". Stellen Sie auf der Registerkarte "Vorläuferionen" die folgenden Parameter sicher:
      Anzahl der PASEF-Rampen: 8
      Mindestgebühr: 1
      Maximale Ladung: 1.
      1. Klicken Sie auf der Registerkarte Planung auf Erweitert , und stellen Sie sicher, dass die folgenden Parameter vorhanden sind:
        Intensitäten: 0,1500, 5000, 10000
        Wiederholung: 1, 10, 5, 1
        Schwellenwert für Intensität: 1500.
      2. Stellen Sie auf der Registerkarte "Aktiver Ausschluss" die folgenden Parameter sicher:
        Häkchen für aktiven Ausschluss
        Freigabe nach: 0,4 min.
      3. Unter den Einstellungen für die Kollisionsenergie sind folgende Parameter zu beachten:
        K0 (V-s/cm3): 0,70, 1,60
        Kollisionsenergie (eV): 20.00, 35.00.
      4. Stellen Sie bei der Isolation die folgenden Parameter sicher:
        Masse (m/z): 622, 1222
        Breite (m/z): 1,00 2,50.
    12. DIA -PASEF einrichten: Wählen Sie DIA-PASEF aus den MS-Einstellungen auf der linken Seite aus. Wählen Sie auf der Registerkarte MS/MS die Option Fenstereditor aus. Stellen Sie hier die folgenden Parameter sicher (Abbildung 3):
      Fenstereinstellungen: Massenbreite: 50 Da; Massenüberlappung: 0,0 Da; Berechnen Sie aus Polygon: Massenschritte; Anzahl der Mobilitätsfenster: 1.

3. Kalibrierung

  1. Kalibrierung des Geräts (Abbildung 4)
    1. Klicken Sie auf dem Unterreiter Kalibrierung auf m/z, wählen Sie Tuning Mix aus dem Dropdown-Feld und klicken Sie auf Kalibrieren in der unteren rechten Ecke.
    2. Klicken Sie weiter auf Kalibrieren , bis eine Punktzahl von 100 % erreicht ist.
    3. Wählen Sie nun die Registerkarte Mobilität und führen Sie die gleichen Schritte wie oben aus, bis die Kalibrierungsbewertung von 100 % erreicht ist.
  2. Kalibrierkurve
    1. Spike-Lipid-interne Standardmischung mit 10 μl deuterierter interner Standardmischung.
      Verwenden Sie sieben Kalibrierpunkte von 0,1 bis 500 ng/ml Standardgemisch mit 10 μl des deuterierten internen Standardgemisches.
    2. Annotation der Fettsäureketten auf der Grundlage der bereits inNummer 2 beschriebenen PASEF MS/MS-Muster manuell.
  3. Effizienz der SIL-Etikettierung
    1. Berechnen Sie das Verhältnis der Fläche der SIL, die Isotope enthält, zur Fläche der Nicht-SIL, die Isotope enthält.
    2. Berechnen Sie das theoretische Muster, indem Sie die Wahrscheinlichkeit bestimmen, ein markiertes Atom an einer beliebigen Stelle zu finden.
    3. Berechnen Sie die SIL-Anreicherung, indem Sie die experimentellen Isotopenprofile an das theoretische Muster anpassen, das auf einer Datenanalysesoftware simuliert wurde.
  4. Starten des Laufs
    1. Aktivieren Sie den Säulenofen, indem Sie auf die Schaltfläche Thermometer klicken. Aktivieren Sie die Pumpen, indem Sie auf die Schaltfläche Ventil klicken.
    2. Legen Sie die MS-Methode auf die zuvor gespeicherte Methode fest. Stellen Sie sicher, dass das Injektionsvolumen 5 μl beträgt und dass Leitung 1 auf das Fläschchen 20:1 abzielt.
    3. Stellen Sie sicher, dass das Fläschchen 20:1 50 % IPA/ACN enthält. Beispielliste speichern.
    4. Starten Sie die Sequenz und überprüfen Sie, ob eine erfolgreiche Injektion erfolgt ist (bestätigt durch eine Meldung, die auf dem System angezeigt wird, die besagt, dass injiziert wurde).
    5. Kopieren Sie Zeile 1 und fügen Sie sie unten ein, um eine neue Zeile zu generieren. Befüllen Sie Zeile 2 je nach aktuellem Experiment mit Proben. Stellen Sie sicher, dass die richtige Position im Autosampler verwendet wird.
    6. Wenn die mobile Phase frisch ist, führen Sie zuerst einen Peak-Shape-Test durch, indem Sie die Lipidmischungsstandards vom Hersteller injizieren. Vergleichen Sie mit früheren Ergebnissen. 2 Bei den Standards handelt es sich um ein Lipidgemisch aus 1-Pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (15:0-18:1 PC), Lysophosphatidylcholin (18:1 Lyso PC), 1-Pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamin (15:0-18:1 PE), 1-Oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (18:1 Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (15:0-18:1 PS), 1,2- Dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol (15:0-18:1 DAG), 2-Octadecenoyl-sn-glycerol (18:1 MAG), Cholesteryloleat (18:1 Cholester).
    7. Stellen Sie sicher, dass neue Linien die richtige Trennmethode und nicht die in Linie 1 verwendete Vorkonditionierungsmethode haben. Stellen Sie sicher, dass die MS-Methode korrekt ist (Methode des aktuellen Tages).
    8. Stellen Sie sicher, dass die richtige Verarbeitungsmethode geladen ist und dass Automatisierten Prozess ausführen aktiviert ist.
    9. Speichern Sie die Beispielliste, um sicherzustellen, dass die Proben nach Abschluss des aktuellen Laufs analysiert werden.

4. Datenanalyse

  1. Offene Datenanalysesoftware (Abbildung 5). Klicken Sie in der oberen linken Ecke auf die Schaltfläche Datei und wählen Sie Öffnen...
  2. Wählen Sie die gewünschten Dateien aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dateinamen und wählen Sie Eigenschaften.
    1. Wählen Sie Calibration Status (Kalibrierungsstatus ) aus (Abbildung 6). Wählen Sie im Dropdown-Feld die Option Erstkalibrierung für das Massenspektrometer aus. Stellen Sie sicher, dass alle Fehler kleiner als 1 ppm sind.
    2. Wählen Sie als Nächstes Initial Mobility Calibration aus , und bestätigen Sie, dass der Fehler kleiner als 1 ppm ist.
    3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Chromatogramm , und wählen Sie Chromatogramm bearbeiten (Abbildung 6C). Klicken Sie unter Typ auf das Dropdown-Feld, und wählen Sie Extrahiertes Ionenchromatogramm aus (Abbildung 6D). Wählen Sie unter Filter die Option Alle MS und im Scanmodus Alle aus. Dies dient dazu, die Peaks für das interessierende Molekül und nicht nur seine Fragmente zu betrachten.
      1. Darunter gibt es zwei Filteroptionen für die Molekülauswahl: Massen oder Formel. Wenn Massen ausgewählt ist, kann man das theoretische m/z der interessierenden Moleküle auswählen. Wählen Sie für diesen Fall 829,7985 m/z. Wenn Formel ausgewählt ist, kann man sowohl die Formel für das Molekül als auch die Ionenformen auswählen, die für das Chromatogramm von Interesse sind. Wählen Sie in diesem Fall Ammonium [M+NH4]. Dies ist auf den Ammoniumpuffer in der mobilen Phase zurückzuführen, der die Ionisation in dieser Ionenform begünstigt (Abbildung 7).
      2. Wählen Sie für die Breite ±1 aus. Stellen Sie bei der Polarität sicher, dass der positive Modus beibehalten wird. Wählen Sie unter Mobilität die Option 1.455-1.465 aus. Dies geschieht, um alle Moleküle herauszufiltern, die nicht innerhalb dieser Werte liegen, und das interessierende Molekül zu isolieren.
  3. Nachdem Sie die Parameter ausgewählt haben, klicken Sie oben rechts auf Hinzufügen > OK . Nach kurzer Zeit verarbeitet die Software die Selektionen und gibt ein Chromatogramm aus.
  4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Basislinie am Anfang des Peaks of Interest und ziehen Sie mit gedrückter Maustaste bis zum Ende des Peaks. Diese manuelle Integration liefert ein Live-Massenspektrum von Fragmenten innerhalb dieser Retentionszeit.
  5. Mobilogramm
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf der linken Seite des Bildschirms auf Mobilogramm , und wählen Sie Mobilogramm bearbeiten (Abbildung 8). Das Fenster mit dem Namen Mobilogramm-Traces bearbeiten wird angezeigt. Führen Sie die gleichen Schritte von C.e.i.1 bis C.e.i.5 aus (Abbildung 9).
    2. Geben Sie bei Retentionszeit die Retentionszeit des Peaks of Interest ein. In diesem Fall 37.45-37.55 min.
    3. Sobald Sie die Parameter ausgewählt haben, klicken Sie oben rechts auf Hinzufügen > OK . Nach kurzer Zeit verarbeitet die Software die Selektionen und gibt ein Chromatogramm aus.
  6. Wiederholen Sie für extrahierte Ionen die Schritte 4.2.3.1 bis 4.3.2.2, bis eine Liste von Ionen gebildet ist.
  7. Wählen Sie am unteren Rand des MS-Fensters "MS profilieren " und "MS fragmentieren" aus. Dies ermöglicht eine Spektralansicht von Ionen aus dem Full Scan und PASEF.
    1. Klicken Sie in der Spektrumansicht mit der rechten Maustaste und wählen Sie Zusammengesetzte Spektren kopieren. Mit den Spektraldaten, die auf der rechten Seite erscheinen, kann man weitere Informationen über die eigene Verbindung finden, wie z. B. Auflösungsvermögen, Intensität und Signal-Rausch-Verhältnis (S/N; Abbildung 10).
  8. Verarbeitung
    1. Um die Daten zu verarbeiten, integrieren Sie das Chromatogramm und die Mobilitätsspitzen manuell, um wertvolle Informationen über das interessierende Molekül zu erhalten (Abbildung 10).
    2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Suchen , und wählen Sie Nur Chromatogramm oder Mobilogramm integrieren (Abbildung 11). Klicken Sie mit der linken Maustaste und markieren Sie den gewünschten Peak. Zu diesen Informationen gehören die Verweildauer, die Fläche, S/N und Mobilität.

Ergebnisse

Die Markierung stabiler Isotope erleichtert die Visualisierung von Triglyceriden in Lipiddynamikstudien an weiblichen Mücken-Eierstöcken. Im 2D-Mobilitätsbereich wird das Triglycerid 48:1 in einer Region mit einer spezifischen Retentionszeit in Bezug auf die Mobilität 1/K0 angezeigt. Die Intensität des Triglycerids kann durch eine dunklere blaue Linie dargestellt werden. Andere Flecken stellen zusätzliche Triglyceride dar, die sich im Eierstock befinden. Die Verweilzeiten und Mobilitäten variieren aufgrund der Unterschiede in den Massen und Strukturen und erscheinen daher in verschiedenen Bereichen des Diagramms. Diese Unterschiede sind entscheidend für die Unterscheidung zwischen Triglyceriden in einer Probe (Abbildung 12A,B). Die Projektion des amplifizierten Massenspektrums der Region zeigt ein 48:1-Triglycerid-Ion, das mit einem Ammonium-Ion bei 822 m/z gekoppelt ist. Andere Triglyceride, wie z. B. 50:2 und 52:3, sind ebenfalls sichtbar, jedoch aufgrund der Unterschiede in Struktur, Größe und Fragmentierung in höheren m/z-Bereichen (Abbildung 12C,D). In diesem Beispiel waren wir daran interessiert, die mit Deuterium markierten Isotope zu analysieren. Die Region für TG 48:1 wurde weiter amplifiziert, um die isotopenmarkierten Ionen sichtbar zu machen. Mit zunehmender Menge an Deuterium auf dem Ion nimmt die Intensität des Peaks ab. Dies geschieht, da es ein geringeres Vorkommen von Ionen mit hohem Deuterium-Gehalt gibt. Das m/z-Verhältnis steigt mit jeder Zugabe von Deuterium aufgrund der Massenzunahme leicht an. Diese Intensitäten bestimmen weiter die Menge jedes Isotops, das in der Probe vorhanden ist.

Bei der Beurteilung der Intensitäten der Fragmente im Massenspektrum muss man die unmarkierten Isotope mit denen vergleichen, die mit 2H markiert sind (Abbildung 12E). In Blau ist die unbeschriftete Intensität mit den gestrichelten schwarzen Linien als theoretische Intensitäten. In Rot sind die mit Isotopen markierten Ergebnisse zu sehen. Sie weisen größere Intensitäten auf als sowohl die nicht markierten als auch die theoretischen Intensitäten. Die Anreicherung der Spezies mit Isotopenmarkierung führt zu einer höheren Intensität als bei den unmarkierten theoretischen Spezies. Die größeren Intensitäten ermöglichen die Visualisierung der Triglyceride aufgrund der Distriktdiskrepanzen. Die Fragmentierung spielt auch eine Schlüsselrolle bei der Identifizierung von Lipiden, da die PASEF im Vergleich zur Vollscan-MS/MS eine erhöhte Fragmentierung bietet. Dies liegt daran, dass die Fettsäuren in den Lipidketten in unterschiedlichen Mustern fragmentieren können, daher zeigen die Linien in den Spektren die Intensität der Fragmente basierend auf dem Fragmentierungsprozess des Triglycerids (Abbildung 12F). Dies liefert strukturelle Informationen über die Fettsäure und hilft festzustellen, welches Isomer einer Spezies vorhanden ist. Bei der Analyse von Daten aus der DIA-Methode nimmt die Anzahl der Fragmente zu, was zu einem besseren MS/MS-Scan und einer besseren Identifizierung als bei einer typischen DDA-Methode führt.

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Abbildung 1: Typischer Startbildschirm der Software. Der Startbildschirm ermöglicht die Erstellung von Methoden und das Starten des Instruments. (A) Software-Bildschirm mit den Einstellungen für TIMS und MS/MS-Steuerung. Am unteren Rand des Bildschirms befindet sich die Registerkarte "Quelle", auf der Sie die Steuerelemente auf dem Instrument bearbeiten können. (B) Software-Bildschirm mit geöffneter Registerkarte "Tune". (C) Hier kann man das Instrument für die allgemeine Stimmung vorbereiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Software-Bildschirm mit geöffneter Registerkarte "Tune". Hier kann man die Parameter für die Verarbeitungsabstimmung bearbeiten. (A) Software-Bildschirm mit geöffneter Registerkarte "Tune". Hier kann man die Tune-Parameter für den TIMS-Teil des Instruments bearbeiten. (B) Software-Bildschirm mit ausgewählter Registerkarte MS/MS am unteren Bildschirmrand. (C) Hier kann man Parameter für das Tandem-Massenspektrometer bearbeiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Bildschirm zur Auswahl der DIA-PASEF-Fensterbreiten. Hier kann man sowohl die Farben für die Fülle als auch die Größe der Fenster für die Datenerfassung bearbeiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Kalibrierung des Massenspektrometers nach Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z). Für die Kalibrierung wird die Referenzliste ausgewählt. (A) Klicken Sie unten rechts auf die Schaltfläche Kalibrieren , bis ein akzeptabler Wert angezeigt wird. Kalibrierung des Ionenmobilitätsspektrometers nach Mobilität. Für die Kalibrierung wird die Referenzliste ausgewählt. (B) Unten rechts wird auf die Schaltfläche Kalibrieren geklickt, bis ein akzeptabler Wert angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Typischer Startbildschirm für die Datenanalysesoftware. Um eine Datei zu öffnen, wird auf die Schaltfläche Datei oben links geklickt, damit das Drop-Box-Feld mit den Optionen angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Datenanalyse-Software. Der Software-Bildschirm, der eine erfolgreiche Kalibrierung mit (A) der Auswahl der Kalibrierungsergebnisse und (B) der Auswahl der Kalibrierungskategorie bestätigt. (C) Auswahl eines zu analysierenden Chromatogramms und (D) Auswahl eines extrahierten Ionenchromatogramms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Popup-Bildschirm. Pop-up zum Auswählen und Extrahieren des Ionenchromatogramms mit (A) Massenfilter und (B) Formelfilter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Datenanalyse-Software. Der Software-Bildschirm, auf dem links ein Mobilogramm für die Analyse ausgewählt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Pop-up-Bildschirm für das Mobilogramm. Pop-up zur Auswahl eines extrahierten Ionenmobilogramms nach (A) Massenfilter und (B) Formelfilter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 10: Bildschirm zur Datenanalyse. (A) Der Software-Bildschirm; Links hervorgehoben kann eine extrahierte Ionenliste gebildet werden. (B) Datenanalysebildschirm, auf dem unten ein Verbindungsspektrum aus den extrahierten Ionen vorbereitet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 11: Bildschirm zur Datenanalyse. Der Software-Bildschirm, der die Ergebnisse einer manuellen Integration von zusammengesetzten Spektren zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 12: LC-TIMS MS Ergebnis. (A) Die LC-TIMS MS MS 4 Tage nach der Fütterung von 2H-markierten Saccharose-Diäten und den Insekten-Eierstöcken ist im 2D-Mobilitätsbereich zu sehen. (B) Typische MS-Projektionen für das Signal, das TG 48:1, TG 50:2 und TG 52:3 entspricht, aus der markierten Probe. (C) Amplifizierter MS-Bereich 822 - 827 m/z , der das markierte TGs-Profil kennzeichnet. (D) Achten Sie besonders auf MS-Peaks in rot, die das Isotopenprofil amplifiziert sind. (E-F) Das 2H markierte Isotopenprofil ist rot hervorgehoben; Unten sind die unmarkierten Isotopenprofile blau hervorgehoben. Die theoretischen Isotopenprofile sind als gestrichelte Linien dargestellt (13C in schwarz; arabische ZifferH in grün). Oben rechts ist auch eine mögliche Struktur für das Triglycerid 48:3 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Bei der Bewertung der Anwendung dieses Protokolls ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Parameter DIA-PASEF und MS/MS auf die betreffenden Triglyceride anwendbar sind. Insbesondere sollten die Mobilitätsfenster und die Fensterbreite dem Muster der Triglyceride folgen. Dies kann mit einem vorherigen Lauf mit der DDA-Methode ermittelt werden. Bei der Verfolgung der Triglyceride im internen Standard sollten die Fenster für die DIA-Einrichtung alle vorab identifizierten Moleküle von Interesse abdecken. Die Fenster sollten alle gleich groß sein, und die Bereiche liegen innerhalb von m/z und 1/k0 der gewünschten Verbindungen (Abbildung 7). Bei einer falschen Dimensionierung der Fenster werden die zu fragmentierenden Ionen übersprungen und die Ertragsspektren hätten eine geringere Reproduzierbarkeit. Ohne eine angemessene Optimierung eines Fensterbereichs in der Lipidomik werden die DIA-Ergebnisse die DDA-Daten im Wesentlichen nicht verbessern. Die Fenster sollten eine schrittweise Form für den Datenerfassungsprozess darstellen. Ist dies nicht der Fall, sollten die Parameter des DIA-PASEF-Fensters so geändert werden, dass sie für das gesamte Lipidprofil repräsentativ sind. Ohne diesen Schritt werden kritische Fettsäuren in den gewonnenen Daten weggelassen.

Zu den instrumentellen Einschränkungen gehören vor allem diejenigen, die mit LC-MS-Methoden einhergehen. Dazu gehören auch Multiplexing-Beschränkungen bei der Peakbreite. Daher muss eine Optimierung der Peak-Elution für eine angemessene Quantifizierung erfolgen, die die Selektivität während der Datenerfassung fördert. In der Regel ist dies bei ausgewählten Vorläufern der Fall, z. B. bei DDA. Bei DIA werden jedoch keine Vorläufer ausgewählt, so dass Einschränkungen in der instrumentellen Selektivität möglich sind8. Obwohl DIA-Methoden eine erhöhte Fragmentierung ermöglichen, gibt es immer noch Einschränkungen. Die prominenteste Einschränkung ist die Verringerung der Selektivität von Vorläufern. Die Fenster für eine DIA-Methode sind 5 bis 10 Mal breiter als für eine typische DDA-Methode. Folglich könnte es bei gleichzeitiger größerer Fragmentierung das Tastverhältnis und die serielle Erfassung reduzieren. Dies kann in Massenspektrometern beobachtet werden, die eine abgestufte Quadrupole verwenden. Da es keine Auswahl an Vorläufern gibt und welche Ionen fragmentiert werden sollen, werden statische Isolationsfenster sequentiell durchlaufen, um das m/z-Fenster abzudecken. Da das Fenster viel größer ist als bei einer typischen DDA-Methode, muss man größere Bereiche verwenden, um zu versuchen, die Empfindlichkeitzu erhöhen 9. Das Problem bei der seriellen Erfassung verringert daher die Empfindlichkeit. Eine zweite Einschränkung betrifft die Generierung von Bibliotheken. Es ist zeitaufwändig und erfordert große Mengen an Proben, um es zu formulieren. Externe Bibliotheken können zwar verwendet werden, aber die Fragmentierungsmuster können sich je nach experimentellen Bedingungen und Instrumentierungunterscheiden 10.

Bei der Analyse von Lipiddaten mittels stabiler Isotopenmarkierung ist es notwendig, die Interferenz durch andere im Organismus vorkommende Moleküle zu minimieren. Dies geschieht durch den Einsatz von hochauflösenden Analysewerkzeugen wie dem LC-TIMS-TOF-MS/MS 2. Derzeit ist die Verwendung dieser hochauflösenden Werkzeuge zur Trennung der markierten Isotope vom Hintergrundrauschen im Vergleich zu herkömmlichen Methoden noch sehr neu. Traditionelle instrumentelle Überlegungen implementieren die Trennung durch Gaschromatographie, gefolgt von chemischer oder Elektronenionisation. Dies ermöglicht entweder eine chemische Ableitung mit Pentafluorbenzylbromid oder eine Fragmentierung aus der Elektronenionisation. In jüngerer Zeit wird die LC-MS in Isotopenstudien eingesetzt. Die Verwendung von hochauflösenden Massenspektrometern ermöglicht eine hohe Massengenauigkeit und die Möglichkeit, Multi-Tracer-Untersuchungen durchzuführen, indem mehrere Isotopenmarkierungen anstelle eines einzigen Isotops verwendet werden. Ohne die hohe Auflösung des Instruments wäre es nicht möglich, zwischen verschiedenen Beschriftungsgraden wie 13C, 2 und 13C zu unterscheiden. Dies ermöglicht mehr Informationen aus einem einzigen Durchlauf im Vergleich zu herkömmlichen Instrumenten mit niedrigerer Auflösung10.

Während DIA eine bessere Reproduzierbarkeit als DDA aufweist, können andere neue Datenerfassungsmethoden vergleichbar sein. Hybride DIA-DDA-Strategien wie p-SMART sind in der Lage, die Stärken jeder Methode zu kombinieren, um eine hervorragende Detektion und Quantifizierung zu gewährleisten und gleichzeitig ein hohes Niveau an gezielten qualitativen Analysen beizubehalten. Bei dieser Methode kann die Verwendung eines angepassten Produktions die DIA-Empfindlichkeit und -Selektivität erhöhen, da sie die DIA-Fenster im Vergleich zu einem breiten ungezielten Ansatz verengt8. In der Lipidomik kann die Struktur eines Triglycerids mit der isomeren Struktur variieren. PASEF ermöglicht die Visualisierung verschiedener Fragmentierungsmuster und verbessert so die Identifizierung von Arten2. Bei der Verwendung von DIA-PASEF liefert die erhöhte Fragmentierung Informationen über Isomere, die ähnlich wie andere Fragmente sind, die normalerweise aufgrund der Einschränkungen der DDA-Methode nicht aufgelöst werden können. Diese Informationen geben Aufschluss darüber, welche Fettsäuren in den Eierstöcken der Mücken vorhanden sind. Diese Methode kann auf andere De-novo-Lipidstudien in verschiedenen Organismen angewendet werden.

Offenlegungen

Matthew Willetts und Melvin A. Park sind Mitarbeiter von Bruker Daltonics Inc., dem Hersteller des kommerziellen Instruments timsTOF. Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die Beiträge von Dr. Cesar Ramirez bei der Entwicklung der ersten Methoden. Diese Forschung wurde durch die NIAID-Zuschüsse finanziert, die an FGN, Projekt 22-21244S, R21AI167849 der Czech Science Foundation, Tschechische Republik, an MN vergeben wurden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Accucore C30 ColumThermo Fisher Scientific27826-252130
Bruker Kompass DatenanalyseBruker Daltonics Inc2363525870Version 5.2
D-Glucose-13C6Sigma-Aldbsp;
Eppendorf TubenFisher Scientific14-282-300
EquiSplash LipidomixAvanti Polar Lipids330731-1EA
GlasfläschchenThermo Fisher Scientific11-417-236
schweres Wasser (2H2O)Sigma-Aldbsp;1.13366
Polypropylen-StößelFisher ScientificBAF199230001
Prominence LC-20 CE ultraschneller FlüssigkeitschromatographShimadzuL20234651907
silanisierte GlaseinsätzeThermo Fisher Scientific03-251-826
Saccharose-13C12Sigma-Aldrich 
timsTOFBruker Daltonics Inc1.84443E+11
Tuning Mix KalibrierstandardAgilent Technologies36
389374605417

Referenzen

  1. Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
  2. Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
  3. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
  4. Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
  5. Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
  6. Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
  7. Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
  8. Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
  9. Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
  10. Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).

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