Anwendung der durchflusszytometrischen Analyse zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in 3D-Hirnorganoiden

Summary

Dieses Protokoll berichtet über eine einzigartige Methode zur Verwendung eines Strömungszytometers und mehrerer Antikörper zur gleichzeitigen Bewertung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter, einschließlich Veränderungen des mitochondrialen Volumens, der Mengen der Untereinheiten des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes (MRC) und der Replikation der mitochondrialen DNA (mtDNA).

Abstract

Mitochondriale Dysfunktion ist ein häufiger primärer oder sekundärer Faktor für viele Arten von Neurodegeneration, und Veränderungen der mitochondrialen Masse, der mitochondrialen Atmungskette (MRC) und der Kopienzahl der mitochondrialen DNA (mtDNA) sind häufig an diesen Prozessen beteiligt. Organoide des menschlichen Gehirns, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen werden, rekapitulieren die dreidimensionale (3D) zytoarchitektonische Anordnung des Gehirns und bieten die Möglichkeit, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und neue Therapeutika in einem komplexen menschlichen System zu screenen. Hier berichten wir über einen einzigartigen, auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in iPSC-abgeleiteten kortikalen Organoiden. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll für die Generierung kortikaler Hirnorganoide aus iPSCs, die Einzelzelldissoziation der erzeugten Organoide, die Fixierung, Färbung und die anschließende durchflusszytometrische Analyse zur Beurteilung mehrerer mitochondrialer Parameter. Die Doppelfärbung mit Antikörpern gegen die MRC-Komplex-Untereinheit NADH: Ubichinon-Oxidoreduktase Untereinheit B10 (NDUFB10) oder mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM) zusammen mit dem spannungsabhängigen anionenselektiven Kanal 1 (VDAC 1) ermöglicht die Bestimmung der Menge dieser Proteine pro Mitochondrium. Da die Menge an TFAM der Menge an mtDNA entspricht, liefert sie eine indirekte Schätzung der Anzahl der mtDNA-Kopien pro mitochondrialem Gehalt. Dieser gesamte Vorgang kann innerhalb einer Zeitspanne von 2-3 Stunden abgeschlossen werden. Entscheidend ist, dass es die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer mitochondrialer Parameter ermöglicht, einschließlich sowohl der Gesamt- als auch der spezifischen Spiegel relativ zur mitochondrialen Masse.

Introduction

Mitochondrien sind essentielle Zellorganellen und der Hauptort der Produktion von Adenosintriphosphat (ATP). Mitochondrien liefern nicht nur Energie für die Zellen, sondern sind auch an mehreren zellulären Prozessen beteiligt, einschließlich der Übertragung von Zellinformationen, der Zelldifferenzierung und der Apoptose, und haben die Fähigkeit, das Zellwachstum und den Zellzyklus zu regulieren. Veränderungen der mitochondrialen Funktion wurden bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen festgestellt, darunter die Parkinson-Krankheit (PD)^1,2, die Alzheimer-Krankheit (AD)³ und die amyotrophe Lateralsklerose (ALS)⁴. Mitochondriale Dysfunktion spielt eine Rolle im Alterungsprozess, indem sie somatische mtDNA-Mutationen akkumuliert und die Funktion der Atmungskette abnimmt⁵.

Bei der Neurodegeneration treten verschiedene Arten von mitochondrialer Dysfunktion auf, und die Möglichkeit, solche Veränderungen zu messen, ist äußerst nützlich bei der Untersuchung von Krankheitsmechanismen und der Erprobung potenzieller Behandlungen. Darüber hinaus ist die Etablierung geeigneter In-vitro-Modellsysteme, die Krankheiten in menschlichen Gehirnzellen rekapitulieren, von entscheidender Bedeutung, um Krankheitsmechanismen besser zu verstehen und neue Therapien zu entwickeln. iPSCs von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen wurden verwendet, um verschiedene Gehirnzellen zu erzeugen, die mitochondriale Schäden aufweisen 6,7,8,9. Die Entwicklung von 3D-Gehirnorganoiden, die aus iPS-Zellen gewonnen werden, ist ein wichtiger Schritt in der Modellierung von Krankheiten. Diese iPSC-abgeleiteten Hirnorganoide sorgen für Komplexität und enthalten den eigenen genetischen Hintergrund des Patienten, wodurch ein Krankheitsmodell bereitgestellt wird, das die Pathologie im Gehirn des Patienten genauer widerspiegelt.

Während einige Forschungen zu mitochondrialen Studien mit iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden durchgeführt wurden 10,11,12, sind bequeme und zuverlässige Techniken zur Bestimmung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter in iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden nach wie vor begrenzt. Die Durchflusszytometrie bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Messung mitochondrialer Parameter auf Einzelzellebene, wie wir bereits gezeigt haben¹³. Diese Studie bietet ein detailliertes Protokoll für die Generierung kortikaler Organoide aus iPSCs, kombiniert mit einem neuartigen auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz zur gleichzeitigen Messung mehrerer mitochondrialer Parameter, einschließlich der mitochondrialen Masse, der Untereinheiten des Atmungskettenkomplexes und der mtDNA-Kopienzahl (Abbildung 1). Wichtig ist, dass durch die Verwendung der mitochondrialen Masse als Nenner diese Protokolle es ermöglichen, sowohl die Gesamt- als auch die spezifischen Spiegel pro mitochondrialer Einheit zu messen.

Protocol

1. Differenzierung von iPSCs in kortikale Organoide

1. Vorbereitung von matrixbeschichteten Platten
   1. Tauen Sie das Fläschchen mit der handelsüblichen Basalmembranmatrix über Nacht auf Eis auf. In kaltem Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 auf 1:100 verdünnen (1% Endkonzentration). Stellen Sie Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C (siehe Materialtabelle).
   2. Tauen Sie die Membranmatrixlösung bei 4 °C auf (halten Sie sie kalt) und beschichten Sie die erforderliche Anzahl von Vertiefungen (1 mL für eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Bei 37 °C 1 h inkubieren.
   3. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) kommen (eine Stunde einwirken lassen).
      HINWEIS: Die Platten können bis zu 2 Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden (denken Sie daran, sie herauszunehmen und die für diesen Tag erforderlichen beschichteten Vertiefungen bei RT zu erwärmen, bis sie sich vor der Verwendung nicht mehr abkühlen). Es wird empfohlen, die Platten innerhalb von 3 Tagen zu verwenden. Für eine längere Lagerung 1 ml Essential 8 Medium (siehe Materialtabelle) auf die beschichtete Platte geben, um ein Austrocknen des Gels zu vermeiden.

2. Vorbereitung Essential 8 (E8) Medium für die iPSC-Kultur

1. Bereiten Sie E8-Medium in einer sterilen Umgebung vor, indem Sie E8-Basalmedium mit E8-Zusatz kombinieren (siehe Materialtabelle). Dieser kann bei 4 °C 2 Wochen gelagert werden.
   HINWEIS: Tauen Sie das gefrorene E8-Präparat über Nacht bei 4 °C auf, bevor Sie das gesamte Medium vorbereiten. Es wird nicht empfohlen, das gefrorene Nahrungsergänzungsmittel bei 37 °C aufzutauen. Verwenden Sie E8 Medium für 2 Wochen. Vor der Anwendung das für den Tag erforderliche E8 Medium bei RT erwärmen, bis es sich nicht mehr kühl anfühlt.

3. Subkulturierung von iPSCs

1. Matrixbeschichtete Platten im RT oder Inkubator bei 37 °C für 20-30 min vorwärmen. Die benötigte Menge an E8 Medium bei RT vorwärmen.
2. Aspirieren Sie das Nährmedium mit einer Pipette.
3. Spülen Sie iPSCs (siehe Materialtabelle) mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (Ca²⁺/Mg²⁺ frei) (DPBS-/-) (4 mL für eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
4. Fügen Sie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,5 mM) hinzu (1 ml für eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Inkubieren Sie bei 37 °C, bis sich die Ränder der Bienenvölker von der Platte zu lösen beginnen (normalerweise 3-5 Minuten).
5. Aspirieren Sie die Dissoziationslösung.
6. Geben Sie vorgewärmtes E8 Medium (4 mL für eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu und verwenden Sie hohen Druck, um iPSC-Kolonien zu lösen.
7. In zwei verschiedene Vertiefungen in einer matrixbeschichteten 6-Well-Platte überführen (2 mL für eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bevor Sie sie in den Inkubator legen. Das Split-Verhältnis kann 1:2-1:4 betragen.
8. Tauschen Sie täglich Medien aus, bis die Kolonien zu 80% zusammenfließen und eine gute Größe und Verbindungen haben.
   HINWEIS: Überwachen Sie auf Kolonien geeigneter Größe, die sich in der Regel durch eine genau definierte, kreisförmige Form und einen Durchmesser von 0,5 bis 1 mm auszeichnen. Die Völker sollten dichte, kompakte Strukturen mit klar abgegrenzten, glatten Rändern aufweisen.

4. Bildung des Embryoidkörpers (EB) und neuronale Induktion

1. Bereiten Sie das neuronale Induktionsmedium (NIM) vor, indem Sie die in der Materialtabelle aufgeführten Komponenten kombinieren.
2. Aspirieren Sie Medium und spülen Sie die Zellen mit DPBS -/- (4 mL pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
3. Geben Sie vorgewärmtes Accutase (1 mL pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) (siehe Materialtabelle) in die Vertiefung und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 37 °C.
4. Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig 3 bis 4 Mal mit einer 1000-μl-Pipettenspitze auf und ab.
5. Neutralisieren Sie mit 2 mL DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und zentrifugieren Sie das konische 15-ml-Röhrchen mit den Zellen bei 600 x g für 5 min bei RT. Aspirieren Sie den Überstand.
6. Resuspendieren Sie die Zellpellets, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, bis sie zu einzelligen Paletten gelangen.
7. Zählen und berechnen Sie die Konzentration lebender Zellen mit Trypanblau¹⁴ in einem automatisierten Zellzähler.
8. Berechnen Sie das Verdünnungsverhältnis und verdünnen Sie die Zellen in NIM, um eine endgültige Zellkonzentration von 60.000 lebenden Zellen/ml zu erreichen.
9. Geben Sie den Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor Y-27632 (Endkonzentration 50 μM) (siehe Materialtabelle) in die Zellsuspension und mischen Sie ihn vorsichtig.
10. Geben Sie 150 μl Einzelzellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit extrem geringer Bindung (siehe Materialtabelle) und legen Sie sie in den Inkubator. Als Tag 0 einrichten.
11. Überprüfen Sie an Tag 1 die Zellen und EB-Formen in jeder Vertiefung.
    HINWEIS: Bewerten Sie die erfolgreiche EB-Bildung anhand ihres hellen, sphärischen und durchscheinenden Aussehens unter dem Mikroskop, ihrer Fähigkeit, frei schwebend und getrennt zu bleiben, und des Fehlens abgestorbener Zellen, die als dunkle Flecken erscheinen.
12. Nehmen Sie an Tag 2 vorsichtig 75 μl Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 150 μl NIM zusammen mit 50 μM Y-27632 in jede Vertiefung hinzu.
13. Nehmen Sie an den Tagen 4, 6 und 8 100 μl Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 150 μl NIM in jede Vertiefung hinzu.

5. Entstehung kortikaler Organoide

1. Bereiten Sie das neuronale Differenzierungsmedium minus Vitamin A (NDM-) vor, indem Sie die in der Materialtabelle aufgeführten Komponenten kombinieren.
2. Übertragen Sie EBs an Tag 10 mit einer 5-ml-Pipette von der 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz auf die 6-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz. Übertragen Sie acht EBs vorsichtig in jedes Bohrloch (Abbildung 2). Geben Sie 5 mL NDM- in jede Vertiefung.
3. Legen Sie die Platte auf den Orbitalschüttler im Inkubator und beginnen Sie mit 80 U/min zu drehen.
4. Ersetzen Sie an den Tagen 12, 14 und 16 das NDM- durch 4 mL, nachdem Sie 3 mL altes Medium aspiriert haben.

6. Reifung und Langzeitkultivierung kortikaler Organoide

1. Bereiten Sie das neuronale Differenzierungsmedium mit Vitamin A (NDM+) und dem vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) vor. Weitere Informationen finden Sie unter Materialtabelle.
2. Entfernen Sie am 18. Tag das 3-ml-Medium und fügen Sie 4 mL NDM+ hinzu.
3. Bringen Sie die Platte wieder in die Spinnkultur zurück.
4. Füttern Sie alle 4 Tage und pflegen Sie die differenzierten kortikalen Organoide in NDM+ bis zur Anwendung. Für die Downstream-Analyse wurden 25-40 Tage alte kortikale Organoide verwendet.
   HINWEIS: Die kortikalen Organoide können länger (bis zu 3-4 Monate) aufbewahrt werden; Aber die Lebensfähigkeit der Zellen wird aufgrund des fehlenden Nährstoffaustauschs sinken.

7. Zellcharakterisierung durch Immunzytochemie und Immunfluoreszenzfärbung

1. Verwenden Sie eine 1000-μl-Pipette, um das Organoid vorsichtig aus dem Medium zu sammeln, und platzieren Sie es vorsichtig auf einem Medium mit minimalem Medium auf einem Standard-Objektträger.
2. Lassen Sie es bei RT vollständig trocknen und fügen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) (300 μL pro Probe) für 30 min hinzu. Entfernen Sie PFA und spülen Sie es dann zweimal mit PBS aus.
   HINWEIS: PFA ist giftig und steht im Verdacht, krebserregend zu sein. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen und handhaben Sie es unter einem chemischen Abzug.
3. Geben Sie 30 % Saccharoselösung (300 μl pro Probe) zu den Objektträgern und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
4. Blockieren und permeabilisieren Sie die Organoide mit Blockierungspuffer (BB) (300 μl pro Probe), der PBS (mit Ca²⁺/Mg²⁺), 0,3 % Triton X-100 und 10 % normales Ziegenserum für 2 h bei RT (oder über Nacht bei 4 °C) enthält. Umreißen Sie die Organoide mit einem hydrophoben Barrierestift, um den Puffer auf dem Objektträger zu halten.
5. Die Proben werden mit Primärantikörpern in Blockierungspuffer (300 μl pro Probe), Anti-SRY (geschlechtsbestimmende Region Y)-Box 2 (SOX2, 1:100) und antineuralen Markern Tuberin beta III (Tuj1, 1:1000) überlagert und über Nacht bei 4 °C im Dunkeln inkubiert (siehe Materialtabelle).
6. 3 h in PBS mit zwei bis drei Pufferwechseln auf einer sanft wippenden Plattform waschen.
7. Inkubieren Sie mit einem Sekundärantikörper (300 μl pro Probe), Anti-Alexa-Mehl 488 (1:800) und Anti-Alexa-Mehl 594 (1:800) über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Dunkelkammer. Gleichzeitig ist der Kernfleck Hoechst 33342 (1:5000) zuzugeben (siehe Materialtabelle).
8. Aspirieren Sie den Antikörper und spülen Sie ihn schnell mit PBS aus, dann fügen Sie PBS mit 0,01 % Naazid für 1-2 Tage bei 4 °C hinzu, um eine Kontamination zu vermeiden.
9. Aspirieren Sie das PBS und entfernen Sie die überschüssige Lösung. Montieren Sie die Organoide mit Eindeckmedium (siehe Materialtabelle) und fügen Sie dann ein Deckglas hinzu. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen und stellen Sie sie für mindestens 12 Stunden in einen dunklen Raum bei RT, damit die Halterung vollständig polymerisieren kann.
   HINWEIS: Die Probe kann nun unter einem Fluoreszenzmikroskop imaginiert werden.

8. Dissoziation kortikaler Organoide

1. 30 mL DPBS -/- in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen geben.
2. Sammeln Sie die Gehirnorganoide vorsichtig mit einer 10-ml-Pipette im Röhrchen. Für eine Färbung werden mindestens 3 Organoide verwendet, die älter als 25 Tage, aber weniger als 40 Tage sein sollten.
3. Organoide für ca. 5 min sedimentieren. Nicht zentrifugieren.
4. DPBS aspirieren und 2 mL vorgewärmtes Accutase in das Röhrchen geben. Inkubieren Sie die Probe 5 Minuten lang bei 37 °C im Wasserbad.
5. 15 Mal sanft mit einer 1000-μl-Pipettenspitze verreiben, ohne Blasen zu erzeugen. Inkubieren Sie die Probe für weitere 5 Minuten bei 37 °C in einem Wasserbad.
6. Schonende Dissoziation durch 15-malige Verwendung von 1000-μl-Pipettenspitzen, ohne Blasen zu erzeugen (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Wenn noch einige undissoziierte Zellen vorhanden sind, übertragen Sie die undissoziierten Zellen in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen und inkubieren Sie dann weitere 5 Minuten bei 37 °C Wasserbad. Dissoziieren Sie dann sanft, indem Sie 20 Mal 1000 μl Pipettenspitzen verwenden.
7. Neutralisieren Sie mit 4 mL DMEM mit 10 % FBS und zentrifugieren Sie das konische 15-ml-Röhrchen mit den Zellen bei 600 x g für 5 min bei RT.
8. Überstand aspirieren und mit 200 μl DPBS unter Verwendung von 1000 μl Pipettenspitzen 10 Mal resuspendieren, ohne Blasen zu erzeugen.
9. Fügen Sie 200 μl DPBS hinzu, um ein Gesamtvolumen von 400 μl Zellsuspensionen in DPBS herzustellen.
10. Filtern Sie mit dem Filter oder Filterrohr (verwenden Sie 35- oder 40-μm-Filter und spülen Sie den Filter mit DPBS, bevor Sie den Filter verwenden).
11. Trennen Sie die Hälfte der Lösung in ein Röhrchen und verwenden Sie sie als ungefärbte Probe.

9. Durchflusszytometrische Messung von MRC-Komplex-Untereinheiten und TFAM in fixierten Zellen

1. Geben Sie Lebendes und Totes (L/D) Färbefarbungsmittel (1: 1000) hinzu (siehe Materialtabelle) (entweder mit Fernrot oder Nahinfrarot, je nach Einstellung der Marker für die Durchflusszytometrie).
   HINWEIS: Wenn ein neues Fläschchen für L/D-Farbstoff geöffnet wird, fügen Sie 50 μl DMSO zur Rekonstitution hinzu und stellen Sie ein 10 μl Aliquot her, um sie bei -20 °C zu lagern.
2. In RT und dunkel 30 min aufbewahren. Fügen Sie 40 mL DPBS -/- hinzu. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min.
3. Nach dem Verwerfen des Überstands in eine einzellige Suspension resuspendieren.
4. Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen mit 1 mL eiskaltem 90%igem Methanol bei -20 °C für 20 min.
5. Blockieren Sie die Proben in 1 ml Blockpuffer, der 0,3 M Glycin, 5 % Ziegenserum und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS enthält (mit Ca²⁺/Mg²⁺).
6. Ein- bis zweimal mit 20 mL Fließpuffer waschen, der PBS (mit Ca²⁺/Mg²⁺) mit 0,2 % BSA enthält.
7. Fügen Sie die primären Antikörper anti-NDUFB10 konjugiert mit Alexa Fluor 405 (1:100), anti-VDAC 1 konjugiert mit Alexa Fluor PE (1:100) und anti-TFAM-Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 488 (1:200) für 30 min hinzu (siehe Materialtabelle).
8. Mit 20 mL Fließpuffer waschen.
9. Aspirieren und belassen Sie ca. 100 μl und rekonstituieren Sie die Zellpellets zu einem 300 μl Flusspuffer.
10. Übertragen Sie die Zellen in 1,5 mL Durchflussröhrchen. Im Dunkeln und Eis aufbewahren.
11. Analysieren Sie auf dem Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle). Signale wurden für Anti-NDUFB10-Alexa 405 mit einem 450/50-Bandpassfilter, TFAM-Alexa 488 mit 530/30-Bandpassfilter, VDAC 1-Alexa 647 mit 670/14-Bandpassfilter und L/D-Farbstoff mit 780/60-Bandpassfilter erkannt (Abbildung 3B).

10. Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie

1. Verwenden Sie ungefärbte und einzeln gefärbte Proben des Kontrollorganoids, um die Spannung der Zytometereinstellungen einzustellen.
2. Verwenden Sie das ungefärbte Kontrollrohr, um die Streudiagramme für die Vorwärtsstreufläche (FSC-A) und die Seitenstreufläche (SSC-A) basierend auf der Größe und Granularität der Zellpopulation festzulegen (Abbildung 4A).
3. Entfernen Sie Trümmer, um lebende Zellen aus FSC-A- und SSC-A-Parzellen auszuwählen. Gate-Out-Dubletten mit der Side Scatter Height (SSC-H) vs. SSC-A-Diagramm (Abbildung 4B).
4. Wählen Sie die lebenden Zellen basierend auf der Färbung des L/D-Farbstoffs aus, indem Sie auf APC-cy7 vs. FSC-A-Diagramm (Abbildung 4C).
5. Zeichnen Sie unter Verwendung der nicht gefärbten Proben jeder Linie ein Gate über der Hauptpopulation der Ereignisse in FSC-A vs. Diagramme von Fluorochromkanälen (FITC, APC, BV 421).
6. Die Einrichtung kompensiert das Durchflusszytometer¹⁵.
7. Verwenden Sie die Isotypsteuerung für die Negativkontrolle, um Hintergrundflecken zu beobachten.
8. Führen Sie die Datenerfassung durch.
   1. Wählen Sie die lebenden Zellen basierend auf der Färbung des L/D-Farbstoffs aus, indem Sie auf APC-cy7 vs. das FSC-A-Diagramm (Abbildung 4C).
   2. Verwenden Sie das Ungefärbte als Negativkontrolle. Dann, bei der Untersuchung der FSC-A vs. Fluorochromkanäle (FITC, APC, BV 421) bilden ein Gate über der Hauptpopulation von Einzelzellereignissen (Abbildung 4D-F).
9. Führen Sie eine Datenanalyse mit der FlowJo-Software durch (siehe Materialtabelle).
   1. Duplizieren Sie die Positionen der Gates auf die gefärbten Zellproben. Dokumentieren Sie die Anzahl der Zellen, die eine positive Färbung aufweisen.
   2. Bewerten Sie für jede Zielpopulation die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) verschiedener Kanäle (FITC, APC, BV 421), die auf der x-Achse eines Histogramms dargestellt sind, um das mitochondriale Signal zu identifizieren. Spezifische Werte für die komplexe I-Untereinheit NDUFB10 und TFAM können bestimmt werden, indem der MFI der komplexen Expression oder TFAM durch den mitochondrialen Massenindikator VDAC 1 dividiert wird.

Results

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Differenzierungsprozesses und der für die durchflusszytometrische Analyse verwendeten Strategien. Humane iPSCs wurden in nicht-adhärenten 96-Well-Platten kultiviert, um EBs zu bilden, und dann auf nicht-adhärente 6-Well-Platten übertragen, um ausgewachsene kortikale Organoide zu erhalten. Die zelluläre Zusammensetzung von Organoiden wurde mittels konfokaler Mikroskopie nach Immunfärbung mit neuronalen¹⁶ und glialen M...

Discussion

Es wird ein Protokoll zur Erzeugung kortikaler Hirnorganoide aus humanen iPSCs und zur Durchführung der durchflusszytometrischen Analyse mitochondrialer Parameter in einzelnen Zellen, die aus diesen Organoiden isoliert wurden, vorgestellt. Die zelluläre Zusammensetzung der Organoide wurde durch konfokale Mikroskopie mit immunhistochemischer Färbung auf neuronale und gliale Zellmarker verifiziert. Es hat sich gezeigt, dass die auf Durchflusszytometrie basierende Strategie der Co-Färbung m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-DUFB10 in
Anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa Cruz Technologie	sc-390996
Anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
Antikörper, die bei der
anti-Tuj1	abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
Anti-Alexa Mehl 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
Anti-Alexa Mehl 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
Commercial cellsAG05836
(RRID:CVCL_2B58)			Zur Verfügung gestellt von Gareth John Sullivan vom Institute of Basic Medical Sciences an der Universität Oslo, Norwegen
Essential 8 Medium (iPSC-Kulturmedium)
Essential 8 Basalmedium	Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8 Supplement (50x) 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific	A1517101
Bei 4 & Grad lagern; C und erwärmen Sie sich vor dem Gebrauch auf RT.
Instruments
Heracell 150i CO2 Inkubatoren	Fisher Scientific, USA
Orbitale Schüttler - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, UK
CCD Mikroskop Kamera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Deutschland
Wasserbad Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Stipendium Instruments	Grant Instruments, USA
Flüssigkeitsabsaugsystem BVC-Steuerung	Vacuubrand, Deutschland
Leica TCS SP8 STED Konfokalmikroskop	Leica Microsystems, Deutschland
50 mL Falcon Tube	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, USA
Flowjo Sampler Analyse	FlowJo LLC, USA
10 mL Pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL Pipette	Sigma-Aldrich
40 µ m Zellstariner	Sigma-Aldrich	CLS431750
96-Well-Platte mit extrem geringer Bindung	S-BIO	MS-9096UZ
Countess II automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher Scientific<
strong>Neuronales Differenzierungsmedium  (NDM+)
DMEM/F12	Lebenstechnologien	11330032
Neurobasales Medium	Lebenstechnologien	2110349
Glutamax-Zuschlag 1% (v/v)	Lebenstechnologien	35050
N2 Zuschlag 0,5% (v/v)	Lebenstechnologien	17502-048
B27 Zuschlag 1% (v/v)	Leben Technologien	17504-044
β-Mercaptoethanol 50 &Mikro; M	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
Ascorbinsäure 200 & Mikro; M	Sigma-Aldrich	A92902
Lagern bei 4> C für bis zu 2 Wochen
Neuronales Differenzierungsmedium minus Viatmin A (NDM-)
DMEM/F12	Lebenstechnologien	11330032
Neurobasales Medium	Lebenstechnologien	2110349 Glutamax-Ergänzung
1% (v/v)	Lebenstechnologien	35050
N2 Ergänzung 0,5% (v/ v)	Life technologies	17502-048
B27 Beilage W/O vit. A 1% (v/v)	Life technologies	12587010
β-Mercaptoethanol 50 µ M	Sigma-aldrich	M3148
Store at 4° C für bis zu 8 Tage
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12	Life Technologies	11330032
Knockout Serumersatz 15% (v/v)	Life Technologies	10828028
Glutamax Supplement 1% (v/v)	Life Technologies	35050
β- Mercaptoethanol 100 & Mikro; M	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 & micro; M	Tocris	1614
XAV939 2 & Mikro; M	Sigma-Aldrich	X3004
Store at 4° C für bis zu 10 Tage
Neutralisationsmedium
IMDM	Lebenstechnologien	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
Sonstige Reagenzien
DPBS (Ca2+/Mg2+-frei)	Thermo Fisher Scientific	14190250
Rinderserum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000
Accutase	Life Technologien	A11105-01
Geltrex	Life Technologien	A1413302
EDTA	Life Technologien	15575038
Advanced DMEM / F12	Life Technologien	12634010
Nervengewebe Dissoziationskit	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 Dihydrochlorid Gesteinsinhibitor	Biotechne Tocris	1254
Fluoromount-G™ Eindeckmedium	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908