Methodenartikel

Anwendung der durchflusszytometrischen Analyse zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in 3D-Hirnorganoiden

DOI:

10.3791/65621

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4. August 2023

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1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 4Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 5Department of Neurology, Haukeland University Hospital, 6National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll berichtet über eine einzigartige Methode zur Verwendung eines Strömungszytometers und mehrerer Antikörper zur gleichzeitigen Bewertung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter, einschließlich Veränderungen des mitochondrialen Volumens, der Mengen der Untereinheiten des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes (MRC) und der Replikation der mitochondrialen DNA (mtDNA).

Zusammenfassung

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Mitochondriale Dysfunktion ist ein häufiger primärer oder sekundärer Faktor für viele Arten von Neurodegeneration, und Veränderungen der mitochondrialen Masse, der mitochondrialen Atmungskette (MRC) und der Kopienzahl der mitochondrialen DNA (mtDNA) sind häufig an diesen Prozessen beteiligt. Organoide des menschlichen Gehirns, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen werden, rekapitulieren die dreidimensionale (3D) zytoarchitektonische Anordnung des Gehirns und bieten die Möglichkeit, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und neue Therapeutika in einem komplexen menschlichen System zu screenen. Hier berichten wir über einen einzigartigen, auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in iPSC-abgeleiteten kortikalen Organoiden. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll für die Generierung kortikaler Hirnorganoide aus iPSCs, die Einzelzelldissoziation der erzeugten Organoide, die Fixierung, Färbung und die anschließende durchflusszytometrische Analyse zur Beurteilung mehrerer mitochondrialer Parameter. Die Doppelfärbung mit Antikörpern gegen die MRC-Komplex-Untereinheit NADH: Ubichinon-Oxidoreduktase Untereinheit B10 (NDUFB10) oder mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM) zusammen mit dem spannungsabhängigen anionenselektiven Kanal 1 (VDAC 1) ermöglicht die Bestimmung der Menge dieser Proteine pro Mitochondrium. Da die Menge an TFAM der Menge an mtDNA entspricht, liefert sie eine indirekte Schätzung der Anzahl der mtDNA-Kopien pro mitochondrialem Gehalt. Dieser gesamte Vorgang kann innerhalb einer Zeitspanne von 2-3 Stunden abgeschlossen werden. Entscheidend ist, dass es die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer mitochondrialer Parameter ermöglicht, einschließlich sowohl der Gesamt- als auch der spezifischen Spiegel relativ zur mitochondrialen Masse.

Einleitung

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Mitochondrien sind essentielle Zellorganellen und der Hauptort der Produktion von Adenosintriphosphat (ATP). Mitochondrien liefern nicht nur Energie für die Zellen, sondern sind auch an mehreren zellulären Prozessen beteiligt, einschließlich der Übertragung von Zellinformationen, der Zelldifferenzierung und der Apoptose, und haben die Fähigkeit, das Zellwachstum und den Zellzyklus zu regulieren. Veränderungen der mitochondrialen Funktion wurden bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen festgestellt, darunter die Parkinson-Krankheit (PD)1,2, die Alzheimer-Krankheit (AD)....

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Protokoll

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1. Differenzierung von iPSCs in kortikale Organoide

  1. Vorbereitung von matrixbeschichteten Platten
    1. Tauen Sie das Fläschchen mit der handelsüblichen Basalmembranmatrix über Nacht auf Eis auf. In kaltem Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 auf 1:100 verdünnen (1% Endkonzentration). Stellen Sie Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C (siehe Materialtabelle).
    2. Tauen Sie die Membranmatrixlösung bei 4 °C auf (halten Sie sie kalt) und beschichten Sie die erforderliche Anzahl von Vertiefungen (1 mL für eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Bei 37 °....

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Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Differenzierungsprozesses und der für die durchflusszytometrische Analyse verwendeten Strategien. Humane iPSCs wurden in nicht-adhärenten 96-Well-Platten kultiviert, um EBs zu bilden, und dann auf nicht-adhärente 6-Well-Platten übertragen, um ausgewachsene kortikale Organoide zu erhalten. Die zelluläre Zusammensetzung von Organoiden wurde mittels konfokaler Mikroskopie nach Immunfärbung mit neuronalen16 und glialen M.......

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Diskussion

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Es wird ein Protokoll zur Erzeugung kortikaler Hirnorganoide aus humanen iPSCs und zur Durchführung der durchflusszytometrischen Analyse mitochondrialer Parameter in einzelnen Zellen, die aus diesen Organoiden isoliert wurden, vorgestellt. Die zelluläre Zusammensetzung der Organoide wurde durch konfokale Mikroskopie mit immunhistochemischer Färbung auf neuronale und gliale Zellmarker verifiziert. Es hat sich gezeigt, dass die auf Durchflusszytometrie basierende Strategie der Co-Färbung m.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Gareth John Sullivan vom Institute of Basic Medical Sciences an der Universität Oslo, Norwegen, für die großzügige Bereitstellung der AG05836 (RRID:CVCL_2B58) Zelllinie. Wir danken dem Molecular Imaging Centre, Flow Cytometry Core Facility an der Universität Bergen in Norwegen. Diese Arbeit wurde durch folgende Fördermittel unterstützt: K.L wurde teilweise unterstützt von der Universität Bergen Meltzers Høyskolefonds (Projektnummer: 103517133) und Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat (Projektnummer: 103816102). L.A.B wurde unterstützt durch den Norwegischen Forschungsrat (Projektnummer: 229652), Ra....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-DUFB10 in
Anti-VDAC1 Alexa Fluor 647Santa Cruz Technologiesc-390996
Anti-TFAM Alexa Fluor 488Abcamab198308
Antikörper, die bei der
anti-Tuj1abcamab78078
anti-SOX2 Abcamab97959
Anti-Alexa Mehl 488Thermo Fisher ScientificA28175
Anti-Alexa Mehl 594Thermo Fisher ScientificA-21442
Commercial cellsAG05836
(RRID:CVCL_2B58)Zur Verfügung gestellt von Gareth John Sullivan vom Institute of Basic Medical Sciences an der Universität Oslo, Norwegen
Essential 8 Medium (iPSC-Kulturmedium)
Essential 8 Basalmedium Thermo Fisher ScientificA1516901
Essential 8 Supplement (50x) 2% (v/v)Thermo Fisher ScientificA1517101
Bei 4 & Grad lagern; C und erwärmen Sie sich vor dem Gebrauch auf RT.
Instruments
Heracell 150i CO2 InkubatorenFisher Scientific, USA
Orbitale Schüttler - SSM1, SSL1Stuart Equipment, UK
CCD Mikroskop Kamera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Deutschland
Wasserbad Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Stipendium InstrumentsGrant Instruments, USA
Flüssigkeitsabsaugsystem BVC-SteuerungVacuubrand, Deutschland
Leica TCS SP8 STED KonfokalmikroskopLeica Microsystems, Deutschland
50 mL Falcon TubeSigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences, USA
Flowjo Sampler AnalyseFlowJo LLC, USA
10 mL PipetteSigma-AldrichSIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL PipetteSigma-Aldrich
40 µ m ZellstarinerSigma-AldrichCLS431750
96-Well-Platte mit extrem geringer BindungS-BIOMS-9096UZ
Countess II automatisierter ZellzählerThermo Fisher Scientific<
strong>Neuronales Differenzierungsmedium  (NDM+)
DMEM/F12Lebenstechnologien11330032
Neurobasales MediumLebenstechnologien2110349
Glutamax-Zuschlag 1% (v/v)Lebenstechnologien35050
N2 Zuschlag 0,5% (v/v)Lebenstechnologien17502-048
B27 Zuschlag 1% (v/v)Leben Technologien17504-044
β-Mercaptoethanol 50 &Mikro; MSigma-aldrichM3148
BDNF 20 ng/mLPeprotech450-02
Ascorbinsäure 200 & Mikro; MSigma-Aldrich A92902
Lagern bei 4> C für bis zu 2 Wochen
Neuronales Differenzierungsmedium minus Viatmin A (NDM-)
DMEM/F12Lebenstechnologien11330032
Neurobasales MediumLebenstechnologien2110349 Glutamax-Ergänzung
1% (v/v)Lebenstechnologien35050
N2 Ergänzung 0,5% (v/ v)Life technologies17502-048
B27 Beilage W/O vit. A 1% (v/v)Life technologies12587010
β-Mercaptoethanol 50 µ MSigma-aldrichM3148
Store at 4° C für bis zu 8 Tage
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12Life Technologies11330032
Knockout Serumersatz 15% (v/v)Life Technologies10828028
Glutamax Supplement 1% (v/v)Life Technologies35050
β- Mercaptoethanol 100 & Mikro; MSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 nMStemgent/Reprocell04-0074
SB431542 10 & micro; MTocris1614
XAV939 2 & Mikro; MSigma-AldrichX3004
Store at 4° C für bis zu 10 Tage
Neutralisationsmedium
IMDMLebenstechnologien21980032
FBS 10%Sigma-Aldrich12103C
Sonstige Reagenzien
DPBS (Ca2+/Mg2+-frei)Thermo Fisher Scientific14190250
Rinderserum AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000
AccutaseLife TechnologienA11105-01
GeltrexLife TechnologienA1413302
EDTALife Technologien15575038
Advanced DMEM / F12Life Technologien12634010
Nervengewebe DissoziationskitMiltenyi biotec130-092-628
Y-27632 Dihydrochlorid GesteinsinhibitorBiotechne Tocris1254
Fluoromount-G™ EindeckmediumSouthernBiotech0100-20
PFAThermo Fisher Scientific28908
Antikörper mit der Durchflusszytometrie Alexa Fluor 405 NOVUS Biologika NBP2-72915AF405 L/D fixierbares Nah-IR-Färbekit für tote Zellen Life Technologies L10119 Immunfluorenzfärbung

Referenzen

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  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 59....

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Schlagwörter

Durchflusszytometrieaus iPSC gewonnene Organoidemitochondriale DysfunktionEinzelzell Dissoziationmitochondriale MasseMRC KomplexeTFAM F rbungmtDNA Kopienzahl
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