Methodenartikel

Verbesserung der Zuverlässigkeit von Prostatatumor-Biobanken durch verbesserte Probenahmetechnik und histologische Charakterisierung

DOI:

10.3791/65635

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17. November 2023

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1Department of Pathology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 2Department of Urology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 3Biobanco La Fe, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, 4Department of Medicine, Jaume I University of Castellon, 5Department of Surgery, University of Valencia, 6Department of Pathology, University of Valencia

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erleichterung der Entnahme von Proben aus radikalen Prostatektomieproben. Ziel ist es, Gewebeproben aus den Proben nach anatomisch-pathologischen Kriterien zu kartieren, zu charakterisieren und zu mikro-präparieren, bevor sie in einer Biobank gelagert werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Gewinnung frischer und gut charakterisierter Tumorgewebeproben ist entscheidend für die Durchführung qualitativ hochwertiger "Omics"-Studien. Im Zusammenhang mit Prostatakrebs (PC) kann es jedoch aufgrund der Einzigartigkeit dieses Organs und der hohen Heterogenität, die mit diesem Tumor verbunden ist, eine besondere Herausforderung darstellen. Auf der anderen Seite ist es auch eine faszinierende Herausforderung, Proben vor ihrer Lagerung histopathologisch zu charakterisieren, ohne signifikante Gewebeveränderungen zu verursachen. In diesem Zusammenhang stellen wir eine neue Methode zur Gewinnung, Kartierung, Charakterisierung und Mikrodissektion von reseziertem Prostatagewebe anhand anatomopathologischer Kriterien vor.

Im Gegensatz zu zuvor veröffentlichten Protokollen reduziert diese Methode den Zeitaufwand für die histopathologische Analyse der Prostataprobe, ohne deren Struktur zu beeinträchtigen, was für die Beurteilung der chirurgischen Ränder entscheidend ist. Darüber hinaus ermöglicht es die Abgrenzung und Mikro-Makro-Dissektion von frischen Prostatagewebeproben, wobei der Schwerpunkt auf histologischen Tumorbereichen liegt, die durch pathologische Kriterien wie den Gleason-Score, Präcursorläsionen (hochgradige intraepitheliale Neoplasie der Prostata - PIN) und entzündliche Läsionen (Prostatitis) definiert sind. Diese Proben werden dann in einer Biobank für spätere Forschungsanalysen gelagert.

Einleitung

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Prostatakrebs (PC) ist die 2. häufigste Krebserkrankung bei Männern und die 5. häufigste Todesursache weltweit1. Die Behandlung und Prognose des Patienten hängt vom Staging und der Einstufung (Gleason-Score) des Tumors ab, was sich in den höheren 5-Jahres-Überlebensraten von lokalisierten und niedriggradigen Tumoren (Gleason-Grad 6) (99 %) im Vergleich zu hohen Gleason-Tumoren und metastasierten Tumoren (31 %) zeigt2.

Das PC-Lokalrezidiv und das Versagen der Behandlung wurden mit der charakteristischen hohen genetischen Intratumorheterogenität dieses Tumortyps3 in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wird die PC als multifokale Erkrankung mit mehreren Tumorherden mit unterschiedlichen morphologischen, histologischen und molekularen Merkmalen4 angesehen, die unabhängig voneinander oder von einem gemeinsamen Tumorzell-Vorfahren 5 stammenkönnen. Frühere Studien haben gezeigt, dass sich die Tumorevolution bei Patienten aufgrund spezifischer genetischer Treiber unterscheidet, die die Metastasierung fördern oder die Zelllinie auf die Prostata beschränken können5. Daher ist die molekulare Charakterisierung der verschiedenen Tumorherde nicht nur für eine genauere Diagnose und Prognose von entscheidender Bedeutung, sondern auch für eine maßgeschneiderte und personalisierte Behandlung für den Patienten.

In diesem Zusammenhang bieten die biomedizinische Forschung und integrative Multi-Omics-Ansätze beispiellose Möglichkeiten, Krebserkrankungen in verschiedene Subtypen zu klassifizieren, diagnostische und prognostische Biomarker zu identifizieren und Marker zu entdecken, die mit dem Ansprechen auf die Behandlung zusammenhängen. Darüber hinaus tragen diese Ansätze zu einem besseren Verständnis der Biologie dieser Erkrankung bei 6,7. Biologische Proben, ob Gewebe oder Bioflüssigkeiten, können mit verschiedenen Multi-Omics-Plattformen (Genomik, Transkriptomik, Proteomik, Metabolomik usw.) analysiert werden, um die biologischen Merkmale aufzudecken, die der Pathophysiologie von Krebs zugrunde liegen, und damit die derzeitigen Einschränkungen im Zusammenhang mit genetischer und phänotypischer Heterogenität zu beheben6. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die Qualität der aus Omics-Studien abgeleiteten Daten von der Qualität der von Tumoren entnommenen Proben, ihrer genauen Charakterisierung und der anschließenden Verarbeitung und Lagerung abhängt8.

In diesem Zusammenhang stellt die Gewinnung von frischem PC-Gewebe für die Forschung eine methodische Herausforderung dar, da eine erfolgreiche Tumorprobenahmeschwierig ist 9. Bisherige Methoden beinhalteten Zufallsstichproben nach radikaler Prostatektomie, die zu schlechten Ergebnissen führten10. Neuere Ansätze beinhalten jedoch gezielte Protokolle, die sowohl auf Magnetresonanztomographie (MRT) als auch auf Biopsiedaten basieren, was zu einer verbesserten Wirksamkeit bei der Entnahme von Tumorproben führt11.

Auf der anderen Seite stellt auch die histopathologische Charakterisierung von Proben vor ihrer Lagerung ohne signifikante Gewebeveränderungen eine interessante Herausforderung dar. Daher wird in vielen Fällen die histopathologische Bestimmung von Proben nach ihrer Analyse durchgeführt (z. B. HR 1H NMR-Metabolomanalyse)12. Diese Praxis führt zu unnötigen Kosten, Zeitaufwand und dem Verlust einer erheblichen Anzahl von Proben, die schließlich von der Analyse ausgeschlossen werden (z. B. Proben, die sich nach der histopathologischen Analyse als keine Tumorproben herausstellen). In anderen Fällen erfolgt die histopathologische Charakterisierung der Proben vor ihrer Analyse. In der Tat haben einige frühere Studien versucht, Methoden zur Bereitstellung repräsentativer, qualitativ hochwertiger Forschungsproben aus radikalen Prostatektomieproben für die Genomik und Metabolomik zu standardisieren13,14. Nichtsdestotrotz ist die Probenahmeeffizienz signifikant höher, wenn sie aus bereits histologisch bestätigten Schnitten (88 %) durchgeführt wird, die das Gewebe stören, verglichen mit unbestätigten Schnitten (45 %)1.

Hier wird eine neue Methodik vorgestellt, um diese Einschränkungen zu überwinden, die darauf abzielt, frische und gut charakterisierte PC-Proben vor der Lagerung in der Biobank zu erhalten. Diese Methode wurde in Zusammenarbeit zwischen verschiedenen klinischen Diensten (Urologie, Pathologie und Biobank des Krankenhauses La Fe) entwickelt. Es ist wichtig hervorzuheben, dass Biobanken eine wesentliche Rolle bei der Entnahme, Verarbeitung, Konservierung und Lagerung biologischer Proben spielen und gleichzeitig die hohe Qualität der Proben und Daten sowie die Einhaltung ethischer und rechtlicher Anforderungen gewährleisten 8,15,16.

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Protokoll

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Diese Methode wurde in Zusammenarbeit mit verschiedenen klinischen Diensten (Urologie, Pathologie und Biobank des Krankenhauses La Fe) entwickelt. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und von der Ethikkommission für biomedizinische Forschung am Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valencia, Spanien) genehmigt. Alle Proben wurden in der Biobank des Krankenhauses La Fe (PT13/0010/0026) gelagert. Das Gesamtverfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

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Abbildung 1: Gesamtschema des Verfahrens. Schematische Darstellung des schrittweisen Verfahrens, das im Abschnitt Protokoll beschrieben wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Tumor-Targeting

  1. Verwenden Sie vor der Operation eine multiparametrische oder biparametrische Magnetresonanztomographie (mpMRT oder bpMRT)17,18, um den Tumor zu lokalisieren und seine Position innerhalb der Prostata zu kartieren. Kombinieren Sie die Informationen aus der MRT mit den Befunden aus dem transrektalen Ultraschall oder der rektalen Untersuchung, wenn letztere zu widersprüchlichen Ergebnissen führt.
  2. Um die Tumorlokalisation zu verbessern, überprüfen Sie die Ergebnisse präoperativer ultraschallgesteuerter und MRT-gesteuerter transrektaler Prostatabiopsien.
    HINWEIS: Bei der Diagnostik des Prostatakarzinoms werden Biopsien direkt aus der Prostata über einen transrektalen Zugang entnommen. Diese Biopsien umfassen systematische Proben aus der Prostata (mit Zylindern, die über die gesamte Drüse verteilt sind) und Zylindern, die direkt auf verdächtige Befunde im MRT abzielen. Um diese Proben gezielt zu gewinnen, wird transrektaler Ultraschall eingesetzt, der kognitiv ("kognitive Fusion") oder gegebenenfalls mit "echter MRT-Ultraschall-Fusionssoftware" mit MRT-Befunden kombiniert wird.

2. Radikale Prostatektomie und Prostataentnahme

  1. Führen Sie eine standardisierte robotergestützte radikale Prostatektomie durch einen transperitonealen Zugang durch, indem Sie den von Huynh et al.19 beschriebenen Schritten folgen.
    1. Beginnen Sie mit dem Bauchzugang, der Insufflation und der Platzierung der Kameraanschlüsse (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die restlichen fünf Anschlüsse unter direkte Sicht. Pneumoperitoneum auf 12 mm einstellen.
    2. Lösen Sie die Blase, indem Sie das Peritoneum einschneiden und den perirektalen Raum präparieren.
    3. Öffne die Beckenfaszie auf jeder Seite.
    4. Führen Sie eine vollständige Dissektion der vorderen und lateralen Aspekte der Prostata und der Blase durch.
    5. Führen Sie die Öffnung des Blasenhalses durch, identifizieren und durchtrennen Sie die proximale Harnröhre, um Zugang zu den hinteren Aspekten der Prostata und der Blase zu erhalten.
    6. Präparieren Sie die Samenbläschen und den Rektumraum19.
    7. Präparieren Sie die lateralen Aspekte der Prostata und schonen Sie dabei die neurovaskulären Bündel.
    8. Sicherstellung der Blutstillung der Gefäße im retropubischen Raum.
    9. Präparieren Sie die Spitze und schneiden Sie die distale Harnröhre.
    10. Schließen Sie die vesikourethrale Anastomose ab.
    11. Die Prostata wird extrahiert und der Schnitt wird verschlossen19.
  2. Sammeln Sie die frische Prostata in einem trockenen Behälter. Es ist wichtig, die Probenprobe nicht zu fixieren oder in Paraffin einzubetten.
  3. Transportieren Sie die frische chirurgische Probe, die die gesamte Prostata umfasst, zur Probenaufbereitung in die Biobank.

3. Prostataaufbereitung und Probenentnahme

  1. Wählen Sie gezielte Prostatazonen für die Probenahme auf der Grundlage von Informationen zur Tumorlokalisation aus, die aus der präoperativen mpMRT, den präoperativen Biopsieergebnissen und der direkten Palpation von Prostatektomieproben gewonnen wurden. Notieren Sie diese Informationen auf einem Formular, das Patientenidentifikationsdaten, die schließlich entnommenen Prostatabereiche und die Anzahl der entnommenen Proben enthält.
    HINWEIS: Wenn MRT-Befunde, präoperative Biopsieergebnisse und direkte Palpation der Prostatektomieprobe übereinstimmen, richten Sie alle Proben auf diese oder jene Stellen (zwischen 4 und 6 Zylindern). Wenn es Diskordanzen gibt, erhöhen Sie die Anzahl der Zylinder und zielen Sie separat auf alle Zonen ab, bei denen der Verdacht besteht, dass sie von einer dieser Methoden betroffen sind.
  2. Verwenden Sie eine automatische Einwegnadel (Chirurg), um zylindrische Proben aus den ausgewählten Bereichen zu entnehmen (Schritt 1.1). Identifizieren Sie dann (Pathologe) die äußere Zone des Zylinders, klemmen Sie den Zylinder mit einer Gewebezange ein, legen Sie ihn auf einen Objektträger und markieren Sie die äußere Zone mit Gewebetinte. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen entnommenen Zylindern.
  3. Legen Sie die gesammelten Zylinder horizontal auf eine mit Kryostat-Einbettmedium gefüllte Probenhalterscheibe (siehe Materialtabelle) und überführen Sie sie zum Schneiden auf die Mikrotom-Kühlplatte.
  4. Nach dem Aufsetzen auf die Platte befestigen Sie die Probenhalterscheibe am Probenfutter und schneiden Sie sie mit vorsichtigen Bewegungen der Scheibe nach den nächsten Schritten:
    1. Verwenden Sie die optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT-Verbindung, siehe Materialtabelle), um die Gewebeprobe vor dem Gefrierschnitt auf einem Mikrotom-Kryostaten einzubetten.
    2. Anschließend wird die Probe mit einem Kryostat-Mikrotom bei -25 °C geschnitten. Sammeln Sie dünne zylinderförmige Gewebeschnitte (10 μm) auf behandelten Objektträgern. Stellen Sie sicher, dass nur wenige Mikrometer Gewebe entnommen werden, um eine ausreichende Menge an intaktem Tumorgewebe für die Lagerung in der Biobank zu gewährleisten.
    3. Entnehmen Sie zwei oder drei dünne Schnitte pro Objektträger und färben Sie sie manuell, um die endgültige Färbung zu kontrollieren. Das Auge des Technikers sorgt für eine optimale Färbung, und bei Bedarf kann eine erneute Färbung vorgenommen werden. Gehen Sie folgendermaßen vor
      1. Fixieren Sie die Objektträger in 96%igem Ethanol, hydratisieren Sie sie in destilliertem Wasser und färben Sie sie 1 Minute lang mit Harris Hämatoxylin (siehe Materialtabelle), um die Zellkerne zu färben. Entfernen Sie überschüssiges Hämatoxylin, indem Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser abspülen.
      2. Behandeln Sie Objektträger mit 30% Ammoniumhydroxid, um das Hämatoxylin blau zu färben. Entfernen Sie überschüssige Lösung mit Spülungen mit destilliertem Wasser.
      3. Diebenen mit Eosin (siehe Materialtabelle) 30 s lang beizen.
      4. Anschließend werden die Objektträger mit zunehmender Titration von Alkohol dehydriert, mit Xylol (100 %) geklärt und mit DPX (einer Mischung aus Distyren, einem Weichmacher, und Xylol, das als Kunstharzeinbettmedium verwendet wird, das Xylol-Balsam ersetzt, siehe Materialtabelle) einbetten. Tauchen Sie während dieser Schritte die Objektträger in das Glas mit der Coplin-Lösung und nehmen Sie sie heraus.
      5. Legen Sie abschließend ein Deckglas auf das gefärbte Gewebe und verwenden Sie ein Medium mit einem geeigneten Brechungsindex (siehe Materialtabelle) für die Betrachtung unter einem Mikroskop.

4. Charakterisierung der Probe

  1. Analysieren Sie die Probe unter einem Lichtmikroskop (Pathologe), unterscheiden Sie die Bereiche des Karzinoms und bestimmen Sie den Gleason-Score des Tumors. Dokumentieren Sie all diese Daten und markieren Sie die genauen Tumorzonen auf den Objektträgern.
  2. Während dieses Schritts beschriften Sie den Objektträger mit der genauen Position des Tumors und dem entsprechenden Gleason-Score20. Markieren Sie auch die Position der PIN (Intraepitheliales Neoplasma der Prostata) basierend auf der morphologischen Identifizierung.

5. Mikro-Makro-Dissektion und Lagerung der Probe

  1. Markieren Sie verschiedene histologische Komponenten eindeutig mit unterschiedlichen Markern auf dem Objektträger (Pathologe) und korrelieren Sie diese direkt mit gefrorenem Gewebe auf der Bandscheibe.
  2. Anschließend wird mit einer chirurgischen Klinge die auf dem Objektträger markierten Bereiche der Probe innerhalb der OCT-Scheibe präpariert und in tumorales, peritumorales, PIN- und normales Prostatagewebe unterteilt.
  3. Wenn das Einbettungsmedium aufzutauen beginnt, fassen Sie das Gewebe mit einer Pinzette an und legen Sie es in korrekt beschriftete Kryoröhrchen.
    HINWEIS: Bewahren Sie jedes präparierte Fragment nach der histologischen Diagnose der Kryoschnitte sorgfältig im entsprechenden Röhrchen auf.
  4. Lagern Sie die markierten Kryoröhrchen mit vollständig charakterisierten histologischen Proben in der Biobank bei -80 °C für die spätere Verwendung in Forschungsstudien.
    HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Schritte können von einem geschulten Techniker unter Aufsicht des Pathologen durchgeführt werden. Die chirurgische Probe sollte so schnell wie möglich in die Biobank transportiert werden, um einen Abbau von Gewebe und Nukleinsäuren zu verhindern. Gemäß den Referenzleitfäden müssen Anstrengungen unternommen werden, um eine verlängerte Ischämiezeit (>30 min)21 zu vermeiden. Die Proben können auf unbestimmte Zeit in der Biobank aufbewahrt werden, solange die Grundsätze der Probenqualität eingehalten werden.

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Ergebnisse

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Die Ergebnisse zeigen, dass diese Technik in 61% der untersuchten Fälle (25 von 41 Fällen) die Gewinnung von Tumormaterial ermöglicht hat (Tabelle 1).

Tabelle 1: Histopathologische Daten von Studienstichproben. Zusammenfassung der histopathologischen Daten für die in der Studie verwendeten Proben. Der Diagnosezylinder bezieht sich auf die Prostatabiopsieprobe, die zu diagnostischen Zwecken entnommen wurde, während der verarbeitete Zylinder dem Zylinder entspri...

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Diskussion

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In jeder Forschungsstudie ist die Gewinnung von Qualitätsproben eine wesentliche Voraussetzung, um systematische Verzerrungen zu reduzieren und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten22. Daher muss die Kontrolle präanalytischer Variablen wie die Temperatur, bei der Proben verarbeitet und gelagert werden, die von der Probenentnahme bis zur Lagerung verstrichene Zeit, die Verwendung sterilisierter Materialien oder die Auswirkungen, die der Zusatz von Konservierungsmitteln oder anderen Zusatzstoffen auf ...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.L. bestätigt einen Postdoktorandenvertrag von "Margarita Salas" (Nummer 21-076) und MAM-T einen Forschungsvertrag von "Maria Zambrano" (Nummer MAZ/2021/03 UP2021-021). Beide Verträge wurden im Rahmen der Europäischen Union (Next Generation EU) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cadiere PinzetteIntuitivePN1052082-US 10/2021Teilenummer: 471049. 18 Anwendungen.
Konventionelle ObjektträgerKnittel Glass2021Gemahlenes/ mattiertes Ende
Kryostat MikrotomThermo Fisher Scientific---Criostato CryoStar NX50
KryoröhrchenGreiner Bio-One GmbHRef.: 122280.CRYO S. PP, mit Schraubverschluss, steril.
Da Vinci ChirurgiesystemIntuitivePN1052082-US 10/2021Modell XI
SezierinstrumenteBayer ---Zwei Pinzetten und eine chirurgische Klinge 
DPX Eukitt Medizin- und Labortechnik GmbH6.00.01.0001.06.01.01
EosinAgilent157252
Fenestierte bipolare PinzetteIntuitivePN1052082-US 10/2021Teilenummer: 471205. 14 Leben.
Force bipolarIntuitivePN1052082-US 10/2021Teilenummer: 471405. 12 Anwendungen.
GefrierschränkeThermo ScientificMODELL 907. -80 º C
HämatoxylinAgilent157251
Inmunohistochemie ObjektträgerAgilent-DakoK802021-2
Großer NadeltreiberIntuitivPN1052082-US 10/2021Teilenummer: 471006. 15 Anwendungen.
Maryland bipolare PinzetteIntuitivePN1052082-US 10/2021Teilenummer: 471172. 14 Anwendungen.
MikroskopOlympus---Olympus cx40
MikrotomklingenPFM Medicala35
Monopolar gebogene SchereIntuitivePN1052082-US 10/2021Teilenummer: 470179. 10 Anwendungen.
OCT CompoundNEG-50LOT.117340
PlusSpeed S Einmal-Biopsiegerät mit abgeschrägter SpitzePeter Pflugbeil GmbH PSS-1825-S
ProGasp PinzetteIntuitivePN1052082-US 10/2021Teilenummer: 471093. 18 Anwendungen.
Probenhalter DiscDavidson Cryo Chuck. BradleyProdukte30 mm 
Tissue-TintePelikan2021Tinte 4001 brillantschwarz (301168)
XylolQuimipurRef. 169

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Schlagwörter

Prostate Cancer TissueTumor SamplingMolecular CharacterizationBiobank StorageGleason ScoreIntratumoral HeterogeneityMicrodissection TechniquePersonalized Medicine

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