Methodenartikel

Dissektion und Einstufung der Ovarialentwicklung bei weiblichen Wildtyp-Insekten

DOI:

10.3791/65644

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14. Juli 2023

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1Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Protokoll demonstriert eine einfache und leichte Seziermethode, die für wandernde Wildtyp-Insekten geeignet ist, die mit Suchscheinwerferfallen gefangen wurden. Diese Technik kann die gleiche Art signifikant aufklären, indem beide Fortpflanzungsgewebe verglichen werden, nämlich die Paarungssack- und Eierstockentwicklung von Wildtyp-Weibchen.

Zusammenfassung

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Wandernde Schadinsekten stellen weltweit eine ernsthafte Herausforderung für die Nahrungsmittelproduktion und -sicherheit dar. Die wandernden Schädlinge können mit Suchscheinwerferfallen überwacht und eingefangen werden. Eine der wichtigsten Techniken zur Vorhersage wandernder Schädlinge ist die Identifizierung der wandernden Arten. In den meisten Fällen ist es jedoch schwierig, die Informationen nur durch das Aussehen zu erhalten. Daher kann die Nutzung von Wissen, das durch systematische Analyse des weiblichen Fortpflanzungssystems gewonnen wurde, dazu beitragen, die kombinierte anatomische Morphologie des Eierstock-Paarungssacks und die Abstufung der Eierstockentwicklung von Wildtyp-Wanderinsekten zu verstehen, die mit Suchscheinwerferfallen gefangen wurden. Um die Anwendbarkeit dieser Methode zu demonstrieren, wurden der Entwicklungsstatus der Eierstöcke und die Entwicklungsstadien der Eikörner in Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura und Spodoptera exigua direkt für die Anatomie der Eierstöcke untersucht, und die Paarungssäcke der Eierstöcke wurden in Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae und Spodoptera exigua untersucht, um ihre Beziehungen zu erforschen. Diese Arbeit zeigt die spezifische Dissektionsmethode zur Vorhersage von Wildtyp-Wanderinsekten und vergleicht das einzigartige Fortpflanzungssystem verschiedener wandernder Insekten. Dann wurden beide Gewebe, nämlich der Eierstock und die Paarungssäcke, weiter untersucht. Diese Methode hilft dabei, die Dynamik und die strukturelle Entwicklung von Fortpflanzungssystemen bei Wildtyp-Wanderinsekten vorherzusagen.

Einleitung

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Die Migration von Insekten spielt eine wichtige Rolle in der Populationsdynamik der globalen Verbreitung von Insekten wie Helicoverpa armigera - dem Baumwollkapselwurm, Mythimna separate - dem orientalischen Heerwurm, Spodoptera litura - der Taro-Raupe, Spodoptera exigua - dem Rüben-Heerwurm, die in China als ernsthafte Schädlinge gemeldet wurden 1,2,3,4. Die langen Reisedistanzen, die saisonalen Bewegungen, die hohe Fruchtbarkeit der wandernden Schädlinge und die ökologischen Faktoren haben große Schwierigkeiten bei der Vorhersage, Vorhersage und Bekämpfung dieser Schädlinge mit sich gebracht5. Die Überwachung der Schädlingswanderung ist erforderlich, um die Anpassungsfähigkeit und Verhaltensänderungen aufzudecken, die wandernde Schädlinge entsprechend den Klimaveränderungen oder -zyklen begünstigen6. Um ihr Wachstum, ihre Fortpflanzung und ihr Überleben aufrechtzuerhalten, haben Insekten im Laufe der Evolution eine sequentielle Anpassungsfähigkeit erworben. Diese Reihe adaptiven Lebens hat viele Veränderungen im Fortpflanzungssystem hervorgerufen, wie z.B. die Migrationsstrategie, die zur Kontrolle der Entwicklung der Eierstöcke während des langen Migrationsprozesses führt.

Die Entwicklung der Eierstöcke ist bei wandernden Schädlingen weit verbreitet, was sich auf das Wachstum ihrer Population auswirkt7. Daher ist die Entwicklung der Eierstöcke seit langem ein heißes Thema der wandernden Schädlingsforschung. Eine Reihe von Studien hat zu mehreren Indikatoren für die Entwicklung der Eierstöcke und Klassifikationsstrategien geführt. Bisher wurden verschiedene Methoden zur Analyse der Eierstockentwicklung verwendet, z.B. Loxostege sticticalis - die Wiesenmotte - die Eierstockentwicklung, die das anfängliche Befiederstadium, die frühe Laichperiode, die Laichzeit und das Ende der Eiablageumfasst 8. Einige Forscher unterteilen die Eierstockkonzentration auf der Grundlage der Farbentwicklung des Dotters bei wandernden Lepidoptera-Schädlingen, wie z. B. S. exigua - dem Rüben-Heerwurm, Pseudaletia unipuncta - dem echten Heerwurm und Cnaphalocrocis medinalis - dem Reisblattfalter usw.9,10,11,12. In früheren Studien wurden die Entwicklungsstufen der Eierstöcke für Schädlinge wie Baumwollkapselwurm und Reisblattroller in fünf Stadien unterteilt: Dotterablagerungsstadium, Eikornreifestadium, Reife Wartezeit auf die Geburt, Spitzenphase der Ovogenese und Endlaichstadium13,14. Die Entwicklung der Eierstöcke des Maiszünslers wurde in sechs Entwicklungsstadien unterteilt: Dotterablagestadium, Eireifung, Disposition vor den Eiern, Hauptlaichstadium und Endlaichstadium15.

Darüber hinaus haben Insekten derselben Gattung unterschiedliche Entwicklungsstadien, wie z. B. das Entwicklungsniveau der Eierstöcke von Spodoptera frugiperda - dem Herbst-Heerwurm - fällt in vier Stufen: Dotterablagerungsstadium, reifes Warten auf die Lieferung, maximale Ei-Positivität und Endlaichstadium16. Auf der anderen Seite hat die Entwicklung der Eierstöcke bei Spodoptera exigua - dem Rübenwickler - fünf Ebenen: transparent, Vitelogenese, Reifung der Eier, Eifreisetzung und späte Eiablage17.

Frühere Studien können die Entwicklung von einzelnen bis zu mehreren Entwicklungsstufen der Eierstöcke nur anhand der Farbreife des Dotters, der Eiablage und der Eizellentwicklung klassifizieren, aber die Klassifizierung kann nicht auf der Grundlage der Anatomie des Fortpflanzungssystems erfolgen. Die Entwicklung eines Eierstocks auf der Grundlage der Morphogenese-Anatomie ist ein weniger untersuchtes Gebiet. Hier wurde die Dissektionsmethode entwickelt, um wandernde Weibchen in der Population anhand von zwei ovariellen Gewebetypen vorherzusagen, ihre Fortpflanzungsdynamik basierend auf der anatomischen Morphogenese des ovariellen Entwicklungsstadiums und des Paarungssacks zu untersuchen und einen direkten Beweis für die Unterscheidung wandernder Wildtyp-Weibchen zu liefern.

Einige Studien haben ergeben, dass wandernde Noctuidae-Insektenarten häufig von Suchscheinwerfern erfasst wurden18. Der Eierstock der meisten wandernden Noctuidae-Insektenarten befindet sich in der Anfangsphase der Migration in einem frühen Entwicklungsstadium und das Niveau der Eierstöcke steigt mit dem Migrationsfortschritt. In dieser Studie wird die Seziermethode für die Entwicklung der Eierstöcke beschrieben, um die beiden Fortpflanzungsgewebe verschiedener weiblicher Populationsschädlinge zu untersuchen, die mit einem Suchscheinwerfer erfasst wurden. Diese Methode bringt nicht nur die Forschung voran, um die Migrationsdynamik zu verstehen, sondern erleichtert auch die Klassifizierung von Insekten, die Untersuchung der Physiologie von Insekten, die Vorhersage von Schädlingen und die Vorhersage weiblicher Schädlingsarten.

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Protokoll

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HINWEIS: Achten Sie auf Sicherheitsmaßnahmen, bevor Sie wandernde Wildinsekten fangen, es wird empfohlen, Sicherheitsausrüstung (Handschuhe, langärmelige Hemden und Schutzbrillen) zu tragen. Schalten Sie den Siphon auch aus, wenn er nicht verwendet wird, um andere Sicherheitsrisiken und eine Überhitzung des Lichts zu vermeiden. Es ist wichtig, vor der Sektion Sicherheitsprotokolle zu befolgen, wie z. B. das Tragen von Handschuhen, Schutzbrillen und Laborkitteln, um eine Exposition gegenüber Körperflüssigkeiten und Chemikalien zu vermeiden.

1. Fangen von Zuginsekten

  1. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie Insekten mit der Suchlampe fangen. In diesem Protokoll ist die Testinsektenquelle der Bezirk Jiyang, Stadt Jinan, Provinz Shandong, China (36,977088° N, 116,982747° E).
  2. Verwenden Sie den Hauptkörper der Suchlampe, der aus nicht rostendem Stahl besteht, den Kasten, der ein rechteckiges Gehäuse ist, und den Halogenscheinwerfer vom Typ GT75 mit einer Leistung von 1000 W. Platzieren Sie den Scheinwerfer als Lichtquelle in der Mitte.
  3. Platzieren Sie einen trichterförmigen Insektensammelkanal im Inneren und am Boden der Lampe, platzieren Sie eine Schachtel zum Sammeln von Insekten mit einem Durchmesser von 5 cm, gefolgt von einem 60er-Insektensammelnetzbeutel (0,5 m x 0,5 m), der zum Sammeln von Insekten verwendet wird, die durch Licht gefangen werden. Die bekannte Projektion des Lichts befindet sich etwa 500 m über dem Boden.
  4. Dieses Protokoll legt den Schwerpunkt auf die Einwanderungsdynamik von Wildtyp-Weibchen und die Entwicklung der Eierstöcke; Sammeln Sie daher verschiedene Insektenarten (hier wurde von April bis August in den Jahren 2021 bis 2022 gesammelt). Vermeiden Sie es, kleine und verletzte Insekten zu sammeln, wählen Sie für dieses Experiment ähnlich große Schädlinge aus.

2. Zubereitung von Insekten

  1. Alle gesammelten Insekten aus dem Netzbeutel (0,5 m) in den Netzkäfig (30 cm x 30 cm) überführen und dann eine Petrischale mit sterilisierter Lösung aus 10%igem Honigwasser bereitstellen (Fütterung ist optional). Stellen Sie den Käfig bei 27 ± 2 °C, 65 % ± 12 % relativer Luftfeuchtigkeit auf und lassen Sie ihn 8-12 Stunden im Dunkeln.
  2. Wählen Sie Wildtyp-Weibchen aus, die am selben Tag in den Käfig geflogen sind, setzen Sie sie vorsichtig in die einzelnen Fläschchenröhrchen um und verschließen Sie jedes Röhrchen mit einem Baumwolldeckel. Vermeiden Sie direkte Handhabung, die den Schädling durch übermäßigen Druck beschädigen oder verletzen könnte.
    HINWEIS: Alle Wildtyp-Weibchen wurden nachts gefangen und tagsüber präpariert. So wurde jedes Experiment innerhalb eines Tages durchgeführt.

3. Vorbereitung für die Insektenlähmungsmethode (Abbildung 1)

  1. Legen Sie ausgewählte weibliche Schädlinge einzeln in ein Fliegenfläschchenröhrchen in der Mitte und betäuben Sie das Weibchen mit CO2 - Gas, indem Sie die Blaspistolennadel halten, um eine leichte Lähmung zu verursachen. Um zu bestätigen, ob der Schädling gelähmt ist oder nicht, stupsen oder berühren Sie den Schädling vorsichtig mit einer weichen Bürste. Keine Reaktion auf sanfte Reize und Immobilität deutet auf eine erfolgreiche Lähmung hin.
    HINWEIS: Niedrige Temperaturen (-20 °C) können auch als alternative Technik verwendet werden, um Insekten zu lähmen.

4. Sezieren von Insekten

  1. Frisch gelähmtes Weibchen in die Sezier-Petrischale mit absolutem Ethanol (10 ml) legen. Um den Einfluss von Schuppenhaaren und Flügelpuder während der Sektion zu vermeiden, infiltrieren Sie das lebende oder gelähmte Insekt mit absolutem Alkohol und spülen Sie es mit klarem Wasser ab.
  2. Trennen Sie die Rückenflügel mit zwei Pinzetten von der Verbindung von Brust und Bauchkörper.
  3. Übertragen Sie den Bauch in eine neue Einweg-Petrischale, die eine angemessene Menge Wasser enthält (2-5 mm tief), und ziehen Sie das abdominale Exoskelett vorsichtig entlang der dorsalen ventralen Linie vom spitzen Mund bis zum Schwanz mit einer Präparierzange ab. Wiederholen Sie die gleichen Schritte auf der anderen Seite und legen Sie es dann in sauberes Wasser, um das intakte Gewebe zu verteilen.
  4. Ziehen Sie das Fettgewebe der Epidermis vorsichtig mit einer Pinzette ab und ziehen Sie vorsichtig an den Eierstöcken und lassen Sie sie los.
  5. Verwenden Sie eine Präparierzange, um Fettpartikel und andere Organe um die Eierstöcke herum vorsichtig zu entfernen. Im Allgemeinen sind die schädlingsbehafteten Eierstöcke meist auf beiden Seiten des Bauches nach innen gefaltet, versuchen Sie, in einer flüssigen Umgebung zu operieren, während Sie die Eierstöcke entfalten, und ziehen Sie den Paarungssack langsam von der Mitte ab und picken Sie die Fettpartikel heraus, die an den Eierstöcken haften.
  6. Halten Sie den Eierstock und den Paarsack vorsichtig vom vertikalen hinteren Ende aus fest und klappen Sie ihn vorsichtig nach unten auf. Um Beschädigungen während der Entfaltung zu vermeiden, überführen Sie den Eierstock in eine neue oder saubere Petrischale mit Wasser. Halten Sie die Eierstockspitze fest und klappen Sie den Eierstock nach innen; Führen Sie diesen Schritt vorsichtig durch, um eine Beschädigung der Eierstöcke zu vermeiden.

5. Analyse von Daten für die Anatomie des Eierstockgewebes

  1. Beurteilen Sie in diesem Schritt die Entwicklung der Eier für jedes Insekt anhand der Farbe und Größe der Eier, um seine Reife zu beurteilen. Beurteilen Sie dann den Grad der Eierstöcke entsprechend der Entwicklung der Eizelle.
    HINWEIS: Die Einteilung der verschiedenen Entwicklungsstufen der Eierstöcke ist hauptsächlich unterteilt, entweder vor der Eiablage oder vor der Eientwicklung mit dem Dotterausfällungsniveau. Die Entwicklung der Eierkörner von Insekten wird zur besseren Übersichtlichkeit weiter in Stadien unterteilt, wie z. B. das Stadium des Auftretens des Dotters, das Stadium der Dotterreife und das Stadium des Absterbens des Dotters. Die Reife von Eikörnern hängt von der Fülle, Farbe und Größe des Eies ab, um seine Reife zu beurteilen.
  2. Stellen Sie nach der Sektion sicher, dass Sie das Gewebe der weiblichen Paarungssäcke von den intakten Eierstöcken trennen, und beobachten Sie die Morphologie, um die Arten zu unterscheiden, da die Anatomie der meisten Paarungssäcke von Art zu Art variiert. Verwenden Sie daher Paarungssäcke, um zwischen den Arten zu unterscheiden.
  3. Bewerten Sie in diesem Schritt die Anatomie der Eierstöcke und analysieren Sie die Bewertung der Eierstockentwicklung. Unterteilen Sie das Eierstockgewebe in fünf Grade (Grad 1 bis Grad 5).
    1. Achten Sie auf die folgenden Veränderungen und die Struktur, um das Gewebe zu organisieren: erster Grad (1) ist ein frühes Entwicklungsstadium (milchig transparent), voller Bauch, weicher, fetter Körper flauschig, helle Farbe, schwer zu schälen. Der zweite Grad (2) ist das Stadium der Dotterablagerung und sortiert die Eierstöcke bei Bedarf separat nach der Beobachtung des längeren und dickeren Eierstockkanals. Der dritte Grad (3) hat weniger Fettkörper und nur wenige Körnchen, die am Eierstock haften. Der vierte Grad (4) scheint weniger elastisch und leicht zu brechen, und einige Eizellen können in der Mitte des Gebärmutterschlauchs vorhanden sein. Die fünfte Klasse (5) ist leicht zu erkennen, mit weniger oder keinen Fettkörpern, atrophischen und brüchigen Eierstöcken.
  4. Nehmen Sie Bilder mit einer Digitalkamera auf, je nach experimentellem Bedarf.

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Ergebnisse

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Entwicklung der Eizellen
Das obige Protokoll wurde angewendet, um die Entwicklung von Eizellen im Eierstock zu analysieren. Zu diesem Zweck wurden die Eier zunächst allgemein in vier Stadien eingeteilt, um das frühe und das reife Stadium der Eientwicklung bei allen Arten zu unterscheiden, z. B. Kapselwurm, Heerwurm, Taroraupe und Rübenmotte. Hier wurde das frühe Stadium der Befiederung (milchig-weißes, transparentes Stadium) beobachtet. Abbildung 2A zeigt, dass sich die E...

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Diskussion

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Ovarielle Analysemethoden werden routinemäßig im Pflanzenschutz eingesetzt, um die Bewegung des Insektenflugs und der Population für die Vorhersage von 19,20,21 aufzuklären und die physiologischen Variationen bei Insekten zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass die einzigartige Migration und die schnelle Ausbreitungsfähigkeit gängiger landwirtschaftlicher Schädlinge wie Kapselwurm, Heerwurm, Taroraupe und Rübenmotte die Vorh...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Danksagungen

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Diese Studie wurde durch das große wissenschaftliche und technologische Innovationsprojekt (2020CXGC010802) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DigitalkameraCanon ( China ) co., LTDEOS 800D
DropperQingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Ethanol absolut (99.7%)Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD
Pinzetten  Vetus Tools Co., LTDST-14
GT75 Typ Halogen-Scheinwerfer (1000 W)Shanghai Yadeng Industry Co., LTD
Helicoverpa armigera, Mythimna separat, Spodoptera litura, Spodoptera exiguaJiyang Bezirk, Jinan Stadt, Provinz Shandong, China
Messzylinder, Becher, FlascheQingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Net Tasche Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD0,5 m 
Netzkäfige Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD30 cm x 30 cm
PetrischalenQingdao jindian biochemical equipment co., LTD  60 mm Durchmesser

Referenzen

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