Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird die Anwendung einer niederfrequenten Nachweismethode vorgestellt, die auf der Sanger-Sequenzierung beim angioimmunoblastischen Lymphom basiert. Schaffen Sie eine Grundlage für die Anwendung dieser Methode auf andere Krankheiten.

Zusammenfassung

Bei der Überwachung der minimalen Resterkrankung (MRD) nach Tumorbehandlung bestehen höhere Anforderungen an die untere Nachweisgrenze als bei der Erkennung von Arzneimittelresistenzmutationen und zirkulierenden Tumorzellmutationen während der Therapie. Die traditionelle Sanger-Sequenzierung weist einen Wildtyp-Mutationsnachweis von 5 % bis 20 % auf, so dass die Nachweisgrenze die entsprechenden Anforderungen nicht erfüllen kann. Zu den Wildtyp-Blockierungstechnologien, von denen berichtet wurde, dass sie dieses Problem überwinden, gehören die Blocker-Verdrängungsamplifikation (BDA), die nicht erweiterbare gesperrte Nukleinsäure (LNA), Hot-Spot-spezifische Sonden (HSSP) usw. Diese Technologien verwenden spezifische Oligonukleotidsequenzen, um Wildtyp-Amplifikationen zu blockieren oder zu erkennen, und kombinieren dies dann mit anderen Methoden, um die Wildtyp-Amplifikation zu verhindern und die Mutantenamplifikation zu verstärken, was zu Eigenschaften wie hoher Empfindlichkeit, Flexibilität und Bequemlichkeit führt. Dieses Protokoll verwendet BDA, eine Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung, um den Nachweis von niederfrequenten somatischen RHOA G17V-Mutationen zu optimieren, und die Nachweisempfindlichkeit kann 0,5 % erreichen, was eine Grundlage für die MRD-Überwachung des angioimmunoblastischen T-Zell-Lymphoms bilden kann.

Einleitung

Unter der minimalen Resterkrankung (MRD) versteht man die geringe Anzahl von Krebszellen, die nach der Behandlung noch im Körper vorhanden sind. Aufgrund ihrer geringen Anzahl führen sie zu keinen körperlichen Anzeichen oder Symptomen. Sie werden mit herkömmlichen Methoden, wie z. B. der mikroskopischen Visualisierung und/oder der Verfolgung abnormaler Serumproteine im Blut, oft nicht entdeckt. Ein positives MRD-Testergebnis weist auf das Vorhandensein von erkrankten Restzellen hin. Ein negatives Ergebnis bedeutet, dass verbleibende kranke Zellen nicht vorhanden sind. Nach der Krebsbehandlung können die verbleibenden Krebszellen im Körper aktiv werden und sich zu vermehren beginnen, was zu einem Rückfall der Krankheit führt. Der Nachweis einer MRD ist ein Hinweis darauf, dass die Behandlung entweder nicht vollständig wirksam war oder dass die Behandlung unvollständig war. Ein weiterer Grund für MRD-positive Ergebnisse nach der Behandlung könnte sein, dass nicht alle Krebszellen auf die Therapie ansprachen oder dass die Krebszellen resistent gegen die eingesetzten Medikamente wurden¹.

Das angioimmunoblastische T-Zell-Lymphom (AITL) ist ein Subtyp des peripheren T-Zell-Lymphoms (PTCL), das von follikulären T-Helferzellen abgeleitet^{wird 2}; Es ist die häufigste Form des T-Zell-Lymphoms und macht etwa 15 % bis 20 % der PTCL³ aus. Es handelt sich um eine Gruppe verwandter bösartiger Erkrankungen, die das Lymphsystem betreffen. Die Ursprungszelle ist die follikuläre T-Helferzelle. Die WHO-Klassifikation von 2016 kategorisiert es als angioimmunoblastisches T-Zell-Lymphom⁴. Im Jahr 2022 benannte die WHO es zusammen mit dem nodalen T-follikulären Helferzell-Lymphom, angioimmunoblastischem Typ (nTFHL-AI) in nodales T-follikuläres Helferzell-Lymphom, follikulärer Typ (nTFHL-F) und nodales T-follikuläres Helferzell-Lymphom, nicht anderweitig spezifiziert (nTFHL-NOS) um, zusammen als noduläres follikuläres T-Helfer-T-Zell-Lymphom (nTFHL) bezeichnet. Dies geschah, um seine wichtigen klinischen und immunphänotypischen Merkmale und ähnliche Genexpressionssignaturen und -mutanten für T-Follikelhelfer (TFH) zu identifizieren. Genetisch ist nTFHL-AI durch den fortschreitenden Erwerb somatischer Mutationen in frühen hämatopoetischen Stammzellen durch TET2- und DNMT3A-Mutationen gekennzeichnet, während RHOA- und IDH2-Mutationen auch in TFH-Tumorzellen vorhanden sind⁵. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die RHOA G17V-Mutation bei 50%-80% der AITL-Patienten auftritt 6,7,8,9. Das vom RHOA-Gen kodierte RHOA-Protein wird durch die Bindung von Guanosintriphosphat (GTP) aktiviert und durch die Bindung von Guanosindiphosphat (GDP) inaktiviert. Wenn es aktiviert wird, kann es an eine Vielzahl von Effektorproteinen binden und eine Vielzahl biologischer Prozesse regulieren. Physiologisch vermittelt RHOA die Migration und Polarität von T-Zellen, spielt eine Rolle bei der Entwicklung von Thymozyten und vermittelt die Aktivierung der Signalübertragung des Prä-T-Zell-Rezeptors (Prä-TCR)¹⁰. Die RHOA G17V-Mutation ist eine Funktionsverlust-Mutation, die eine treibende Rolle bei der Pathogenese des Lymphoms spielt¹¹. Der Nachweis seiner niederfrequenten Mutation ist hilfreich für das MRD-Monitoring von AITL.

Die Sanger-Sequenzierung wird seit mehr als 40 Jahren als Goldstandard für den Nachweis bekannter und unbekannter Mutationen eingesetzt. Die Nachweisgrenze liegt jedoch nur bei 5 % bis 20 %, was die Anwendung für den Nachweis niederfrequenter Mutationen einschränkt^12,13. Bei der Sanger-Sequenzierung kann die Nachweisempfindlichkeit auf 0,1 % gesenkt werden, indem die traditionelle PCR durch BDA, eine Wildblocking-Technologie, ersetzt wird¹⁴. Die BDA-Technologie fügt bei der Entwicklung herkömmlicher Primer, die mit dem Wildtyp konkurrieren, hauptsächlich einen unpassenden Primer hinzu, der den Mutantentyp ergänzt, um den Zweck der Amplifikation des Mutantentyps zu erreichen. Der Schlüssel zum Primer-Design ist der Mismatch-Primer und die Terminalmodifikation. Gleichzeitig liegt die Differenz zwischen der freien Gibbs-Energie der beiden Primer nach dem Strukturprinzip der DNA zwischen 0,8 kcal/mol und 5 kcal/mol. Ein weiterer wichtiger Schritt in dieser Technik ist die Unterdrückung der Wildtyp-Amplifikation durch Anpassung des Verhältnisses von Wildtyp- und Blocking-Primern^14,15.

Zu den derzeit üblichen niederfrequenten Techniken zum Nachweis somatischer Mutationen gehören die PCR-basierte allelspezifische PCR (Allel-spezifische Polymerase-Kettenreaktion, ASPCR), die amplifikationsrefraktäre Mutationssystem-PCR (amplifikationsrefraktäres Mutationssystem-PCR, ARMS-PCR), die für die Genotypisierung von SNP mit Hilfe von refraktären Primern verwendet wird. Das Design von Primern für die mutierten und normalen Allele ermöglicht die selektive Amplifikation und die digitale PCR (Droplet Digital PCR, ddPCR), ein Verfahren zur Durchführung der digitalen PCR, das auf der Wasser-Öl-Emulsions-Tröpfchentechnologie¹⁶ basiert. Eine Probe wird in 20.000 Tröpfchen fraktioniert, und für jedes Tröpfchen wird eine PCR-Amplifikation der ^{Template-Moleküle} mit einer Sensitivität von 1 x 10-5 durchgeführt; Die Blocker-Displacement-Amplifikation (BDA) ist ebenfalls eine PCR-basierte Methode zur Anreicherung seltener Allele, die für den genauen Nachweis und die Quantifizierung von SNVs und Indels bis zu 0,01 % VAF in einer stark multiplexierten Umgebung verwendet wird. Die Locked-Nukleinsäure-Technologie (Non-Extendable Locked Nucleic Acid, LNA) ist eine Klasse von hochaffinen RNA-Analoga, bei denen der Ribose-Ring in der idealen Konformation für die Watson-Crick-Bindung eingeschlossen ist. Hotspot-spezifische Sonden (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), überlappen die Ziel-Primersequenz, enthalten eine einzelne Mutation und sind mit einem C3-Spacer am C3^'-Ende modifiziert, um eine Amplifikation durch qPCR 14,16,17,18 zu verhindern. Wenn eine Mutation in der Sequenz vorhanden ist, bindet der HSSP kompetitiv an die Zielmutation und verhindert, dass der Primer an die Zielmutantensequenz bindet, wodurch die Sequenzamplifikation gestoppt wird. NGS (Next-Generation-Sequencing) - basierte Immunglobulin-Hochdurchsatz-Sequenzierung (igHTS) Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing (CAAP-seq), es handelt sich um eine auf Next-Generation-Sequencing basierende Methode zur Quantifizierung zirkulierender DNA in Krebszellen (Sensitivität beträgt 1 x ^10-4); etc. Unter ihnen basieren die meisten Methoden auf PCR und können nur eine kleine Anzahl von Mutationsstellen nachweisen, und die NGS-basierten Methoden können mehrere Stellen nachweisen, aber die Kosten sind hoch und der Prozess ist kompliziert ^14,16,17,18. Es gibt Berichte über den Nachweis von niederfrequenten RHOA G17V-Mutationen auf der Grundlage der qPCR, aber die Nachweisgrenze kann nur etwa 2 % ^erreichen19. Es gibt keinen Bericht über den Nachweis von RHOA G17V niederfrequenten Mutationen auf der Grundlage der Sanger-Sequenzierung. Hier zeigen wir die Erhöhung der Sensitivität, die durch BDA, eine Wildtyp-Block-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung, erreicht wird, um den Nachweis von niederfrequenten somatischen RHOA G17V-Mutationen zu optimieren, und die Nachweisempfindlichkeit kann 0,5% erreichen. Zusätzliche Daten für IDH2 und JAK1 werden ebenfalls bereitgestellt.

Dieser Artikel bietet ein detailliertes Protokoll des RHOA G17V Niederfrequenz-Detektionsschemas durch Sanger-Sequenzierung und bietet eine Referenz für die Entwicklung eines niederfrequenteren Mutationsnachweises auf der Grundlage der Sanger-Sequenzierungsplattform. Mit dieser Methode können mögliche Resistenzmutationen und minimale Rückstände in Tumoren erkannt und überwacht werden.

Protokoll

Diese Studie wurde von der medizinischen Ethikkommission des Zentralkrankenhauses von Yongzhou genehmigt (Zulassungsnummer: 2024022601). Die Teilnehmer gaben eine Einverständniserklärung.

1. Design der Grundierung

1. Konventionelles Primerdesign: Primer nach den berichteten Primer Design Rules²⁰ auslegen, Primerdesign durch NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Für die Mutationsstelle von RHOA G17V sind alle Referenzsequenzen für das Design konventioneller Primer die mutierte Basensequenz. Stellen Sie sicher, dass die entworfenen Reverse-Amplification-Primer die Sequenz der Mutationsstelle enthalten und die Annealing-Temperatur der Primer etwa 60 °C beträgt.
2. Design der BDA-Grundierung
   1. Entwerfen Sie den wilden Blockierungsprimer mit einer Länge von etwa 20-30 Basenpaaren (bp), der 2-4 modifizierte Basen enthält, und die modifizierten Basen, die aus A und T bestehen. Stellen Sie sicher, dass der Blockierungsprimer eine Überlappung von 6-14 bp mit dem Mutationsamplifikationsprimer aufweist, der verwendet wird, um mit dem Mutationsamplifikationsprimer zu konkurrieren.
   2. Entwerfen Sie den Primer mit einer Annealing-Temperatur für die endgültig entworfenen Mutantenamplifikations-Primer und Wildblocking-Primer, die auf etwa 60 °C eingestellt ist, und der Differenz der freien Gibbs-Energie zwischen 0,8 und 5 kcal/mol. Detaillierte Berechnungsregeln finden Sie in der Literatur¹⁵.
      HINWEIS: Wenn die vorgesehenen Grundierungen die oben genannten Bedingungen nicht erfüllen, können die Basen zur Anpassung manuell hinzugefügt oder subtrahiert werden. Die endgültige Liste der Grundierungen ist in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt.

2. Probenvorbereitung und DNA-Extraktion

HINWEIS: Experimentelle Verifizierungsproben stammen alle aus peripheren Blut-, Knochenmark- oder soliden Tumorproben von Patienten mit humanem Lymphom. Es gab 10 positive Proben: 3 waren solide Tumorproben, 4 waren Knochenmarkproben und 3 waren periphere Blutproben. Es gibt 30 negative Proben von gesunden Menschen.

1. Entnahme von Knochenmark- und peripheren Blutproben
   1. 400 μl Knochenmark- oder periphere Blutprobe und Reagenzien je nach Anforderung in die entsprechenden Röhrchen geben und gemäß dem Extraktionsverfahren des Herstellers extrahieren.
   2. Bereiten Sie neue Probenröhrchen und 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Nummerieren Sie die Probenröhrchen von 1-24. Markieren Sie die Abdeckungen der 1,5-ml-Röhrchen mit dem Namen der Probe und dem Entnahmedatum in der Reihenfolge der Namen auf den entsprechenden Blutentnahmeröhrchen. Markieren Sie 1-24 an der Seite des Mikrozentrifugenröhrchens für eine Eins-zu-Eins-Korrespondenzprüfung.
   3. Geben Sie 40 μl Proteinase-K-Lösung in das Probenröhrchen und fügen Sie 400 μl Vollblutprobe hinzu (für Volumina unter 400 μl auf 400 μl mit PBS füllen).
   4. Setzen Sie das Probenröhrchen (1-24), die Pipettenspitze (einschließlich Pipettenabdeckung) und das Entnahmeröhrchen in die entsprechenden Positionen ein. Extrahieren Sie DNA gemäß dem Verfahren des Herstellers.
2. Extraktion von Formalin-fixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Proben
   1. Geben Sie die Proben und Reagenzien entsprechend den Anforderungen in die entsprechenden Röhrchen und extrahieren Sie nach dem Extraktionsverfahren des Herstellers.
   2. Geben Sie 1,1 ml Proteinase-K-Speicherpuffer (PK-Lösung) in das Proteinase-K-Trockenpulver, den Vortex und mischen Sie gut, um eine Proteinase-K-Lösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml zu erhalten. Bei -20 °C lagern.
   3. Nehmen Sie die Proteinase-K-Lösung heraus und schmelzen Sie sie vollständig bei Raumtemperatur. Lassen Sie das Trockenthermostat laufen und stellen Sie die Temperatur auf 55 °C ein.
   4. Nehmen Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und schreiben Sie den Namen der Probe darauf. Nehmen Sie weniger als 30 mg Gewebe und geben Sie es in das Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie dann 500 μl Deparaffinpuffer und 20 μl Proteinase K-Lösung in das Röhrchen.
   5. Nachdem Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mindestens 10 s lang vortext gemischt haben, stellen Sie es in ein trockenes Thermostat und halten Sie es 90 min lang bei 55 °C warm.
   6. Stellen Sie sicher, dass die Schleudersäule in das Filterrohr passt. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, überführen Sie die Probe, einschließlich Flüssigkeit und Gewebe, in die Spin-Säule. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 16.500 x g , um die gesamte Flüssigkeit in das Filterrohr zu zentrifugieren.
   7. Nehmen Sie 1 Probenröhrchen (ohne Kappe), das im Lieferumfang des Kits enthalten ist, und schreiben Sie den Namen der Probe darauf. Übertragen Sie die Flüssigkeit aus dem 400 μL Filterröhrchen in das Probenröhrchen.
   8. Nachdem die Probenvorbehandlung und -vorbereitung abgeschlossen ist, platzieren Sie die entsprechenden Verbrauchsmaterialien und Reagenzien an den entsprechenden Positionen und führen Sie die DNA-Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
3. DNA-Qualitätskontrolle
   1. Messen Sie die Konzentration und Reinheit der extrahierten DNA und stellen Sie sicher, dass die DNA-Konzentration ≥ 25 ng/μl beträgt. Zeichnen Sie die DNA-Konzentration jeder Probe auf und verwenden Sie sie sofort für den anschließenden Nachweis oder frieren Sie sie bei -20 °C ein.
      HINWEIS: OD260/OD280-Werte werden im Allgemeinen verwendet, um die Reinheit von DNA-Proben zu testen. Der normale OD260/OD280-Wert liegt bei etwa 1,7-1,9, was darauf hinweist, dass die DNA-Reinheit gut ist; wenn der OD260/OD280-Wert ≤1,7 beträgt, deutet dies darauf hin, dass möglicherweise eine Proteinkontamination vorliegt. Wenn der OD260/OD280-Wert ≥2,0 beträgt, deutet dies darauf hin, dass möglicherweise eine RNA-Kontamination vorliegt oder die DNA abgebaut wurde.

3. PCR-Amplifikation

1. Vorbereitung von Grundierungen
   1. Herstellung der Grundierungslösung
      1. Nehmen Sie die Grundierung, das trockene Pulver heraus und zentrifugieren Sie sie bei 5400-8400 x g für 2-3 min. Überprüfen Sie den nmol-Wert des Primers und öffnen Sie langsam den Deckel. Geben Sie es mit einer Pipette mit dem entsprechenden Volumen an doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O), das dem 10-fachen des nM-Wertes entspricht, langsam entlang der Wand des Primerrohrs hinzu.
      2. Bereiten Sie Primer mit 0,1 nM/μl oder 100 μM Stammlösung vor (z. B. beträgt der nM-Wert 21,1; entsprechend beträgt das hinzuzufügende Wasser 211 μL). Vortex-Mischen Sie gründlich und zentrifugieren Sie dann kurz, um sicherzustellen, dass die Lösung den Boden jeder Vertiefung erreicht. Schreiben Sie den Namen des Primers, die Konfigurationsdaten und die Konfigurationsperson auf die Tubenkappe. Setzen Sie es auf den entsprechenden Lagerplatz der Stammlösung.
   2. Vorbereitung der Arbeitslösung für die Grundierung
      1. 5 μl Forward-Primer, 5 μl Reverse-Primer, 50 μl Wildtyp-Primer-Stammlösung und 40 μl ddH₂O in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Wiederholtes Pipettieren 2x-3x, Vortex zum Mischen und sofort losdrehen.
      2. Schreiben Sie den Namen des Primers, das Datum der Konfiguration und die Person, die ihn konfiguriert hat, auf den Tubendeckel und legen Sie ihn an den entsprechenden Aufbewahrungsort der Arbeitslösung.
2. Verfahren zur PCR-Amplifikation
   1. Fügen Sie für jede Reaktion 5 μl PCR-Amplifikations-Enzym-Mastermix, 1 μl Primer-Arbeitslösung und 1 μl DNA-Template hinzu (die Template-Eingabemenge muss 400 ng erreichen, wenn die DNA-Konzentration nicht ausreicht; erhöhen Sie das DNA-Volumen und reduzieren Sie das Volumen von ddH₂O hinzugefügt) und 3 μl ddH₂O. Vortex, um sich sofort zu mischen und abzudrehen.
   2. Legen Sie das PCR-Reaktionsröhrchen für die PCR-Amplifikation auf das voreingestellte PCR-Instrument. Stellen Sie das thermische Zyklusprogramm des PCR-Instruments wie folgt ein und führen Sie Folgendes aus:
      95 °C für 3 min; 20 Zyklen von 95 °C für 30 s, 68 °C für 15 s (Abnahme um 0,5 °C pro Zyklus), 72 °C für 1 min; 16 Zyklen von 95 °C für 30 s, 58 °C für 15 s, 72 °C für 1 min; und 72 °C für 10 min.
3. Führen Sie eine Gelelektrophorese am PCR-Produkt mit 2 % Agarose durch, um zu überprüfen, ob das Zielfragment amplifiziert ist.
4. Aufreinigung von PCR-Produkten
   1. Bringen Sie purificase I und purificase II auf Raumtemperatur und drehen Sie sofort los. Bereiten Sie die Aufreinigungsreaktion des PCR-Produkts wie folgt vor: 1 μl Purificase I, 0,5 μl Purificase II, 3 μl PCR-Produkt und 3,5 μl ddH₂O.
   2. Legen Sie das PCR-Reaktionsröhrchen für die PCR-Amplifikation auf das voreingestellte PCR-Instrument. Stellen Sie das Programm für den thermischen Zyklus des PCR-Instruments wie folgt ein und lassen Sie die Maschine laufen:
      37 °C für 30 min, 95 °C für 15 min.

4. Sequenzierung von PCR-Produkten nach der Aufreinigung

1. Sequenzierung
   1. Bringen Sie den Mastermix, den Puffer und ddH₂O des Sequenzierungsamplifikationsenzyms auf Raumtemperatur. Nachdem sich das Reagenz verflüssigt hat, drehen Sie es sofort ab.
   2. Bereiten Sie das Sequenzierungsreaktionssystem wie folgt vor: 1,8 μl Sequenzierungspuffer, 0,4 μl Sequenzierungsamplifikationsenzym-Mastermix, 1 μl Sequenzierungsprimer, 0,8 μl gereinigtes PCR-Produkt und 6 μl ddH₂O.
   3. Legen Sie das PCR-Reaktionsröhrchen für die PCR-Amplifikation auf das voreingestellte PCR-Instrument. Stellen Sie das Temperaturzyklusprogramm des PCR-Instruments wie folgt ein und führen Sie es aus: 96 °C für 3 Minuten; 28 Zyklen von 96 °C für 25 s, 56 °C für 15 s, 60 °C für 4 min.
   4. Nachdem die Sequenzierungsreaktion abgeschlossen ist, nehmen Sie das Produkt aus dem PCR-Instrument. Bewahren Sie Reaktionsprodukte lichtgeschützt im Kühlschrank auf.
2. Aufreinigung von Sequenzierprodukten
   1. Wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen gründlich ein. Geben Sie 10 μl magnetische Kügelchen und 40 μl 80 % Alkohol auf die 96-Well-Platte und verschließen Sie die Platte mit einer Folie.
   2. Legen Sie die 96-Well-Platte mit Magnetkügelchen und Alkohol für 10 s auf den Vortex-Shaker, um die Magnetkügelchen vollständig zu suspendieren und zu mischen (achten Sie darauf, ob sich am Boden eine magnetische Kügelchenfällung befindet, und achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit nicht auf die Versiegelungsfolie gelangt). Setzen Sie es auf einen horizontalen Oszillator und binden Sie es mit einem Gummiband zusammen, um 3-5 Minuten lang zu vibrieren (maximaler Gang).
   3. Legen Sie die PCR-Platte nach dem Oszillieren auf den Magnetständer und achten Sie darauf, sie fest zu drücken. Halten Sie den Ständer für die statische Adsorption 3 Minuten lang bei 4 °C, und nachdem alle magnetischen Kügelchen an der Wand adsorbiert sind, entfernen Sie die Dichtungsfolie und gießen Sie die Abfallflüssigkeit aus.
   4. Geben Sie 40 μl 80%igen Alkohol auf die PCR-Platte, spülen Sie die Kügelchen ab und gießen Sie die Abfallflüssigkeit ab. Legen Sie die Platte auf saugfähiges Papier und klopfen Sie sie vorsichtig ab (lassen Sie die PCR-Platte nicht von der Scheibe trennen). 1x wiederholen.
   5. Legen Sie das saugfähige Papier zusammen mit der Magnetplatte für eine kurze Drehung bei 120 x g kopfüber in die Zentrifuge.
   6. Legen Sie die PCR-Platte mit den magnetischen Kügelchen nach dem Entfernen des Alkohols für 3-5 min bei 60 °C in den Ofen. Trocknen Sie die Kügelchen vollständig ab.
      HINWEIS: Wenn kein Backofen vorhanden ist, stellen Sie die Platte 10 Minuten lang auf Raumtemperatur.
   7. Fügen Sie nach dem Trocknen 40 μl reines Wasser hinzu. Legen Sie die Siegelfolie auf die Platte und schütteln Sie sie auf einem Wirbelschüttler für 3-5 s. Stellen Sie die Platte auf einen horizontalen Shaker, binden Sie sie fest und schütteln Sie sie 3-5 Minuten lang, um das gereinigte Sequenzierungsprodukt aufzulösen.
   8. Schleudern Sie das gelöste Sequenzierprodukt bei 180 x g und verwenden Sie das Produkt für die genomische Analyse mittels Kapillarelektrophorese²¹ (Beachten Sie, dass die Stützscheibe zur Probenplatine hinzugefügt werden muss).
3. Analyse der Sequenzierungsergebnisse
   1. Rufen Sie die Sequenzierungsergebnisse aus der Software ab. Detaillierte Informationen zu den Betriebsverfahren finden Sie im Softwarehandbuch. Verwenden Sie die Referenzsequenz von NCBI.

Ergebnisse

Vergleichen Sie die Sequenz des Prüfmusters mit der Referenzsequenz, um den Mutationsstatus des Prüfmusters zu ermitteln. Die BDA-basierte WBT-PCR-Technologie kann die bekannte RHOA G17V-Mutation und andere niederfrequente Mutationen im Amplifikationsintervall von Upstream- und Downstream-Primern nachweisen. Siehe Abbildung 1. Zwei weitere Gene, nämlich IDH2 und JAK1, wurden ebenfalls mit dieser Methode analysiert, Abbildung 2 bzw. Abbildung 3. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode sehr empfindlich ist, wenn es darum geht, niederfrequente Mutationen zu detektieren.

Abbildung 1: Sequenzierungsergebnis für RHOA. Die Abbildung zeigt von oben nach unten die Basenmutation der RHOA G17-Stelle, die mittels WBT-PCR amplifiziert wurde, und die Sequenzierungsergebnisse nach traditioneller PCR-Amplifikation, die der Wildtyp-RHOA G17 entspricht. Das mittlere Bild zeigt die Sequenzierungsergebnisse der c.50G>T-Mutation nach Amplifikation mit WBT-PCR-Primern bei einer Nachweisempfindlichkeit von 0,5%. Das untere Bild zeigt die Sequenzierungsergebnisse der c.49-50delinsTT-Mutation nach Amplifikation mit WBT-PCR-Primern bei einer Nachweisempfindlichkeit von 0,5%. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Sequenzierungsergebnis für IDH2. Die obige Abbildung zeigt von oben nach unten die Basenmutation der IDH2 R172-Stelle, die mittels WBT-PCR amplifiziert wurde, und die Sequenzierungsergebnisse nach traditioneller PCR-Amplifikation, die der Wildtyp-IDH2 R172 entsprechen. Das obere Bild zeigt die Sequenzierungsergebnisse der c.515G>A-Mutation nach Amplifikation mit WBT-PCR-Primern bei einer Nachweissensitivität von 0,5%. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Sequenzierungsergebnis für JAK1. Die obige Abbildung zeigt von oben nach unten die Basenmutation der JAK1 S703-Stelle, die mittels WBT-PCR amplifiziert wurde, und die Sequenzierungsergebnisse nach traditioneller PCR-Amplifikation, die dem Wildtyp JAK1 S703 entsprechen. Das obere Bild zeigt die Sequenzierungsergebnisse der c.2108G>T-Mutation nach Amplifikation mit WBT-PCR-Primern bei einer Nachweisempfindlichkeit von 0,5%. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Fibel	Sequenz der Grundierung
RHOA-VF	ATAACCTTTTGGTGCCAGGT
RHOA-VR	GCTGAAGACTATGAGCAAGCA
RHOA-WTB	AGCAAGCATGTTTTTCCACAGGCAAAA
Grundierung für die Sequenzierung	ATAACCTTTTGGTGCCAGGT

Tabelle 1: Die endgültig entworfene Primerliste von RHOA.

Grundierung IDH2 R172
Fibel	Sequenz der Grundierung
IDH2-VF	CTGGTTGAAAGATGGCGGCT
IDH2-VR	TACCTGGTCGCCATGGGC
IDH2-WTB	GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT
Grundierung für die Sequenzierung	CTGGTTGAAAGATGGCGGCT
JAK1 Gen-Primer
Fibel	Sequenz der Grundierung
JAK1-VF	ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT
JAK1-VR	CCATTATGGACATCAGGACATTC
JAK1-WTB	GGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA
Grundierung für die Sequenzierung	ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT

Tabelle 2: Die fertig gestaltete Primerliste von IDH2 und JAK1.

Diskussion

Die in diesem Artikel beschriebene WTB-PCR auf Basis der BDA-Technologie führt bei der Entwicklung herkömmlicher Primer einen nicht passenden Primer ein, der den Mutantentyp komplementär zum Mutantentyp darstellt, um mit dem Wildtyp zu konkurrieren, den Wildtyp zu unterdrücken und das mutierte Produkt zu amplifizieren. Anschließend wurden die WTB-PCR-Produkte für die Mutationsanalyse sequenziert. Der Nutzen von WTB-PCR/Sanger liegt in seiner Einfachheit und hohen Empfindlichkeit. Gemäß dem in dieser Arbeit etablierten Nachweisschema können die meisten bestehenden Sanger-basierten Assays mit Suppressorprimern über BDA hinzugefügt werden, wodurch die Nachweisempfindlichkeit erhöht wird. Die in diesem Artikel vorgestellte RHOA G17V-Mutation wurde durch Sanger-Sequenzierung nach WTB-PCR auf Basis der BDA-Technologie sequenziert. Wenn die Eingangsmenge der DNA 400 ng erreicht, kann die Nachweisempfindlichkeit 0,5 % oder sogar 0,1 % erreichen. Die Nachweisempfindlichkeit verschiedener Gene muss durch die Menge des DNA-Inputs, die Gensequenz usw. bestätigt werden.

Der Schlüssel zur WTB-PCR ist das Design von Primern, und diese Technologie kann nur bekannte Mutationen nachweisen. In diesem Artikel wird eine Anwendung dieser Technologie in der Sanger-Sequenzierung beschrieben. Diese Technologie kann auch auf Next-Generation-Sequencing, quantitative PCR usw. angewendet werden, und sie kann auch beim Multiplex-PCR-Nachweis eingesetzt werden. Diese WTB-PCR kann die untere Grenze dieser Nachweismethoden reduzieren und kann besser für das MRD-Monitoring eingesetzt werden. Die meisten Methoden, die auf PCR basieren, können nur eine kleine Anzahl von Mutationsstellen nachweisen, und NGS-basierte Methoden können mehrere Stellen nachweisen, aber die Kosten sind hoch und der Prozess ist kompliziert 14,15,16,17,18. Die WTB-PCR zeichnet sich durch hohe Empfindlichkeit, niedrige Kosten und hohe Flexibilität aus und ist damit die ideale Wahl für den niederfrequenten Mutationsnachweis, wodurch die Nachweisempfindlichkeit der Sanger-Sequenzierung und ihre Anwendung beim MRD-Nachweis erheblich verbessert werden kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Automatischer DNA-Extraktor	9001301	Qiagen
DNA-Nukleinsäuredetektor	Q32854	Thermo Fisher
PCR-Amplifikationskit	P4600	Merck
PCR-Instrument	C1000 Touch	Biorad
Proteinase K-Lösung	D3001-2-A	zymo Forschungsproteinase
K-Speicherpuffer	D3001-2-C	zymo research
Enzymkit zur Sequenzierung von Amplifikationen	P7670-FIN	Qiagen