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Methodenartikel

In-vivo-Charakterisierung endokriner chemischer Wirkungen mittels Schilddrüsenhormon-Indikatormaus

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DOI:

10.3791/65657

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6. Oktober 2023

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Cell Metabolism, Institute of Experimental Medicine, 2János Szentágothai PhD School of Neurosciences, Semmelweis University, 3Laboratory of Integrative Neuroendocrinology, Institute of Experimental Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Mausmodell des Thyroid Hormone Action Indicator wurde entwickelt, um eine gewebespezifische Quantifizierung der lokalen Schilddrüsenhormonwirkung mit Hilfe seiner endogenen Regulationsmaschinerie zu ermöglichen. Kürzlich wurde gezeigt, dass das Modell für die Charakterisierung endokriner Disruptoren geeignet ist, die mit der Schilddrüsenhormonökonomie interagieren, sowohl durch ex vivo - als auch durch in-vivo-Methoden .

Zusammenfassung

Schilddrüsenhormone (TH) spielen eine entscheidende Rolle im Zellstoffwechsel und in der Gewebefunktion. Die TH-Wirtschaft ist anfällig für endokrin wirksame Chemikalien (EDCs), die die Hormonproduktion oder -wirkung stören können. Viele Umweltschadstoffe sind EDCs und stellen eine neue Bedrohung sowohl für die menschliche Gesundheit als auch für die landwirtschaftliche Produktion dar. Dies hat zu einer erhöhten Nachfrage nach geeigneten Testsystemen geführt, um die Auswirkungen potenzieller EDCs zu untersuchen. Die derzeitigen Methoden stehen jedoch vor Herausforderungen. Die meisten Testsysteme verwenden endogene Marker, die durch mehrere, oft komplexe regulatorische Prozesse reguliert werden, was es schwierig macht, direkte und indirekte Effekte zu unterscheiden. Darüber hinaus fehlt es In-vitro-Testsystemen an der physiologischen Komplexität des EDC-Stoffwechsels und der Pharmakokinetik bei Säugetieren. Darüber hinaus beinhaltet die Exposition gegenüber Umwelt-EDCs in der Regel eine Mischung aus mehreren Verbindungen, einschließlich in vivo erzeugter Metaboliten, so dass die Möglichkeit von Wechselwirkungen nicht ignoriert werden kann. Diese Komplexität erschwert die EDC-Charakterisierung. Die Thyroid Hormone Action Indicator (THAI)-Maus ist ein transgenes Modell, das ein TH-responsives Luciferase-Reportersystem trägt, das die Beurteilung der gewebespezifischen TH-Wirkung ermöglicht. Man kann die gewebespezifischen Auswirkungen von Chemikalien auf die lokale TH-Wirkung bewerten, indem man die Luciferase-Reporterexpression in Gewebeproben quantifiziert. Darüber hinaus ermöglicht das THAI-Mausmodell mit In-vivo-Bildgebung Längsschnittstudien zu den Auswirkungen potenzieller EDCs bei lebenden Tieren. Dieser Ansatz bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zum Testen der Langzeitexposition, komplexer Behandlungsstrukturen oder des Entzugs, da er die Bewertung von Veränderungen der lokalen TH-Wirkung im Laufe der Zeit bei demselben Tier ermöglicht. Dieser Bericht beschreibt den Prozess der In-vivo-Bildgebungsmessungen an Thai-Mäusen. Das hier besprochene Protokoll konzentriert sich auf die Entwicklung und Bildgebung von Mäusen mit Hyper- und Hypothyreose, die als Kontrollen dienen können. Forscher können die vorgestellten Behandlungen an ihre spezifischen Bedürfnisse anpassen oder erweitern und so einen grundlegenden Ansatz für weitere Untersuchungen bieten.

Einleitung

Die Signalübertragung des Schilddrüsenhormons (TH) ist ein grundlegender Regulator des Zellstoffwechsels, der für eine normale Entwicklung und eine optimale Gewebefunktion im Erwachsenenalter unerlässlichist 1. Innerhalb von Geweben wird die TH-Wirkung durch eine komplexe molekulare Maschinerie fein gesteuert, die eine gewebespezifische Aufrechterhaltung des lokalen TH-Spiegels ermöglicht. Diese Autonomie verschiedener Gewebe von zirkulierenden TH-Spiegeln ist von großer Bedeutung 2,3,4.

Zahlreiche Chemikalien haben das Potenzial, endokrine Funktionen zu stören und kommen als Schadstoffe in der Umwelt vor. Es ist zunehmend besorgniserregend, dass diese Moleküle über Abwasser und landwirtschaftliche Produktion in die Nahrungskette gelangen und dadurch die Gesundheit von Nutztieren und Menschen beeinträchtigenkönnen 5,6,7.

Eine der größten Herausforderungen bei der Bewältigung dieses Problems ist die schiere Anzahl der beteiligten Verbindungen, darunter sowohl zugelassene als auch bereits verbotene, aber immer noch ständig vorhandene Moleküle. In den letzten Jahren wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Testsysteme für das Screening und die Identifizierung des Störpotenzials verschiedener Chemikalienzu entwickeln 8,9,10,11. Während sich diese Methoden beim Hochdurchsatz-Screening von Tausenden von Verbindungen und der Identifizierung potenzieller Bedrohungen auszeichnen, ist eine detaillierte Analyse der spezifischen In-vivo-Wirkungen dieser Moleküle unerlässlich, um die Gefahren einer Exposition des Menschen zu ermitteln. Daher ist ein facettenreicher Ansatz bei der Untersuchung und Charakterisierung von Chemikalien mit endokriner Wirkung (EDCs) erforderlich.

Im Zusammenhang mit der TH-Regulation erfordert das Verständnis der gewebespezifischen Folgen der EDC-Exposition die Quantifizierung der lokalen TH-Wirkung. Obwohl zu diesem Zweck mehrere In-vivo-Modelle entwickelt wurden, stützen sich die meisten auf endogene Marker als Ausgabemaß. Obwohl diese Marker physiologisch sind, unterliegen sie zahlreichen direkten und indirekten Regulationsmechanismen, was ihre Interpretation schwieriger macht. Daher bleibt die Charakterisierung von EDC-Effekten auf die TH-Regulation auf Gewebeebene eine große Herausforderung12,13.

Um die Herausforderungen bei der Messung der gewebespezifischen TH-Signalübertragung zu bewältigen, wurde kürzlich das Mausmodell Thyroid Hormone Action Indicator (THAI) entwickelt. Dieses Modell ermöglicht eine spezifische Quantifizierung von Änderungen der lokalen TH-Wirkung unter endogenen Bedingungen. In das Genom der Maus wurde ein Luciferase-Transgen eingeführt, das sehr empfindlich auf die Regulation durch die TH-Wirkung14 reagiert. Dieses Modell hat sich als wirksam bei der Beantwortung verschiedener Forschungsfragen erwiesen, die eine Quantifizierung von Veränderungen der lokalen Gewebe-TH-Signalgebung erfordern 14,15,16,17,18.

Die Anerkennung einer möglichen Anwendung des THAI-Modells ist die Charakterisierung gewebespezifischer Effekte von EDCs auf die TH-Signalgebung. Das Modell wurde kürzlich erfolgreich eingesetzt, um die gewebespezifischen Auswirkungen von Tetrabromisphenol A und Diclazuril auf den TH-Signalweg zu untersuchen15. Hier werden Basisprotokolle für die Verwendung von In-vivo-Bildgebungsverfahren am THAI-Modell als Testsystem zur Charakterisierung von EDCs vorgestellt, die die TH-Funktion stören. Diese Methode nutzt die biolumineszierende Natur der Luciferin-Luciferase-Reaktion. Im Wesentlichen katalysiert das transgen exprimierte Luciferase-Enzym die Oxidation von verabreichtem Luciferin und erzeugt Lumineszenzlicht, das proportional zur Menge an Luciferase im Gewebe ist (Abbildung 1). Folglich ist die gemessene biologische Reaktion die Luciferase-Aktivität, die als geeignetes Maß für die lokale TH-Wirkungvalidiert wurde 14. Während das THAI-Modell für die Quantifizierung der TH-Wirkung in praktisch allen Geweben geeignet ist, konzentriert sich die In-vivo-Bildgebung hauptsächlich auf die TH-Wirkung im Dünndarm (ventrale Bildgebung) und im interscapularen braunen Fettgewebe (BAT, dorsale Bildgebung)14.

Ein wesentlicher Vorteil der In-vivo-Bildgebungstechnik besteht darin, dass keine Tiere für Messungen geopfert werden müssen. Dies ermöglicht es den Forschern, Längsschnitt- und Folgeexperimente als selbstkontrollierte Studien zu entwerfen, wodurch die Verzerrung zwischen den Probanden und die Anzahl der verwendeten Tiere reduziert werden. Dieser Aspekt ist besonders wichtig für die EDC-Charakterisierung, und die Stärke und Vielseitigkeit der Methode für diesen Zweck wurde bereits nachgewiesen 14,15.

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Protokoll

Das vorliegende Protokoll wurde vom Tierschutzausschuss des Instituts für Experimentelle Medizin geprüft und genehmigt (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). Die präsentierten Daten stammen von FVB/Ant-Hintergrund14, 3 Monate alten männlichen Thai-Mäusen (n = 3-6/Gruppe). FVB/Ameisenhintergrund Thai-Tiere neigen dazu, hochpigmentierte Flecken auf ihrer Haut zu haben, die die Messungen verfälschen können. Suchen Sie daher nach der Fellentfernung nach Pigmentflecken auf der Haut des abgebildeten Bereichs. Tiere benötigen keine besonderen Haltungsbedingungen, es sei denn, das Experiment erfordert dies ausdrücklich (z. B. eine spezielle Diät).

1. Behandlung der Schilddrüsenüberfunktion

HINWEIS: Ein allgemeines Protokoll zur Induktion von Hyperthyreose bei Mäusen finden Sie hier. Der ATA-Leitfaden19 bietet detaillierte Erläuterungen zu den Hintergründen der Methoden mit genannten Alternativen.

  1. Lösen Sie T3 (3,5,3'-Trijodthyronin, siehe Materialtabelle) in 40 mM NaOH, um eine Stammlösung mit einer Konzentration zwischen 5-10 mg/ml zu erhalten.
  2. Die Stammlösung wird mit Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 0,1 μg/μl verdünnt.
  3. Injizieren Sie die verdünnte T3-Lösung intraperitoneal (i.p.) in einem Volumen von 10 μl pro Gramm Körpergewicht (KG) in wache Tiere. Nach 24 Stunden gelten die Tiere als Schilddrüsenüberfunktion.
    HINWEIS: Die T3-Behandlung kann durch jede andere Art von Behandlung ersetzt werden. Die Behandlung hat keinen Einfluss auf das Protokoll der In-vivo-Bildgebung .

2. Behandlung der Hypothyreose

HINWEIS: Hier wird nur ein allgemeines Protokoll zur Induktion von Hypothyreose bei Mäusen bereitgestellt. Der ATA-Leitfaden19 beschreibt detaillierte Erläuterungen zu den Hintergründen der Methoden mit den genannten Alternativen.

  1. Stellen Sie die Diät auf eine jodfreie Chow-Diät um und geben Sie KClO4 und Methimazol ins Trinkwasser (0,01 % Methimazol, 0,05 % KClO4) (siehe Materialtabelle).
  2. Ersetzen Sie die Trinklösung regelmäßig (alle 2-3 Tage) durch eine frische Trinklösung, da Methimazol lichtempfindlich ist und schnell abgebaut wird.
  3. Halten Sie das Behandlungsschema für mindestens 2 Wochen, nicht länger als 4 Wochen, aufrecht. Tiere verlieren an Gewicht und zeigen Unbehagen. Wenn sich Tiere kaum bewegen, viel von ihren Haaren verloren haben oder kaum bei Bewusstsein sind, verwenden Sie einen humanen Endpunkt und töten Sie sie mit einer beliebigen Methode (nach institutionell genehmigten Protokollen).
  4. Setzen Sie die Behandlung der Hypothyreose in Kombination mit anderen Behandlungen fort, um eine mögliche Genesung von der Hypothyreose zu verhindern.

3. In-vivo-Bildgebung

  1. Starten Sie die Software, die mit dem In-vivo-Bildgebungssystem kompatibel ist (siehe Materialtabelle).
  2. Melden Sie sich an und warten Sie, bis das Fenster "Imaging Wizard" geladen ist. Es ist ein kleineres Panel unten links im Fenster.
  3. Starten Sie im "Imaging-Assistenten" die Kamerakühlung, indem Sie im "Image Wizard"-Panel auf "Initialisieren" klicken. Dadurch führt das Gerät ein Setup-Protokoll aus und wartet, bis es abgeschlossen ist. Das "Imaging Wizard"-Bedienfeld wird blau und ein grünes Licht leuchtet im Bedienfeld auf, wenn die Kameratemperatur niedrig genug ist und das Gerät bereit ist.
  4. Stellen Sie die Temperatur des Heizkissens auf 30-37 °C ein, um die gemessenen Tiere warm zu halten.
    HINWEIS: Fahren Sie mit dem Protokoll fort, während Sie darauf warten, dass die Kameratemperatur optimal ist.
  5. Halten oder behandeln Sie keine Tiere in der Nähe des Geräts. Vermeiden Sie übermäßige Mengen an Haaren, die in der Luft um das Instrument zirkulieren.
  6. Betäuben Sie 1-3 Tiere mit Ketamin-Xylazin-i.p.-Injektion (Ketamin 50 mg/kg Körpergewicht, Xylazin 10 mg/kg Körpergewicht, siehe Materialtabelle). Wenn ein Isofluran-Anästhesiesystem installiert ist, befolgen Sie alternativ die institutionell genehmigten Protokolle zur Verwendung einer Isofluran-Anästhesie, die das Ketamin-Xylazin-Gemisch ersetzt.
    HINWEIS: Mäuse mit Hypothyreose reagieren empfindlicher auf Ketamin-Xylazin; Verwenden Sie die halbe Dosis.
  7. Verwenden Sie während der Anästhesie Augenschutzgel.
  8. Überprüfen Sie den Pedalreflex, indem Sie die Fußpolster einklemmen. Kein Pedalreflex bestätigt den Zustand der Anästhesie des Operationsflugzeugs.
  9. Nachdem die Anästhesie gewirkt hat, entfernen Sie das Fell von den abgebildeten Körperteilen mit der am besten geeigneten Fellentfernungsmethode (Epilierer, Rasur, Creme usw.). Stellen Sie sicher, dass kein Fell auf den abgebildeten Körperteilen zurückbleibt, um die Streuung von Leuchtlicht zu verhindern.
  10. Na-Luciferin (siehe Materialtabelle) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 15 mg/ml lösen. Luciferin ist lichtempfindlich; Vermeiden Sie direkte Lichteinstrahlung. Bewahren Sie die Lösung in braunen Röhrchen auf oder wickeln Sie sie in Alufolie ein.
  11. Behandeln Sie rasierte Tiere mit Luciferin-Lösung 10 μl/KGG i.p.
  12. Legen Sie die Tiere so in das Instrument, dass der Mittelpunkt der Kamera als "+" auf dem Pad markiert ist. Stellen Sie die richtige Platzierung sicher, indem Sie die Gitternetzlinien überprüfen und mit einer einzigen "Foto"-Aufnahme bestätigen, wenn Sie sich nicht sicher sind.
  13. Warten Sie 15 Minuten nach der Substratverabreichung, bevor Sie die erste Messung durchführen. Stellen Sie während dieser Zeit die Bildgebungszeit im Bedienfeld "Bildassistent" auf 3 Minuten für Lumineszenz ein und aktivieren Sie die Kontrollkästchen für Foto und Lumineszenz. Das "Foto" muss mit der Lumineszenz übereinstimmen, um die Quelle des gemessenen Signals zu identifizieren.
    HINWEIS: Für eine optimale Substrataufnahme und Gewebeverteilung sind 15 Minuten erforderlich. Das Lumineszenzsignal erreicht 15-20 Minuten nach der Verabreichung von Luciferin ein Plateau. Das Signal beginnt nach dem Plateau langsam abzunehmen.
  14. Nehmen Sie die erste Messung vor, indem Sie im Bereich "Imaging Wizard" auf Messen klicken.
  15. Wenn sowohl die ventrale als auch die dorsale Bildgebung durchgeführt werden, ordnen Sie die Tiere so an, dass der zweite Körperteil unmittelbar nach Abschluss des ersten abgebildet werden soll.
  16. Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, bringen Sie die Tiere in ihre Käfige zurück und setzen Sie das Experiment mit der nächsten Gruppe von Tieren fort.
  17. Lassen Sie die Tiere sich erholen, was in der Regel höchstens 1-2 Stunden dauert. Legen Sie einen mit warmem Wasser gefüllten Schlauch in die Nähe der Tiere, um die Genesung zu erleichtern, und überwachen Sie Vitalfunktionen wie Atmung und Durchblutung.
  18. Entscheiden Sie über das Schicksal der gemessenen Tiere. In den in diesem Artikel vorgestellten Daten wurden die gemessenen Tiere nach institutionell genehmigten Protokollen für Ex-vivo-Messungen eingeschläfert. Dies ist jedoch nicht notwendig. Überlegen Sie, ob Euthanasie oder Folgeexperimente ethisch vertretbar sind.

4. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Datei "ClickInfo" in der Software. Auf der rechten Seite des Fensters öffnet sich ein Bedienfeld mit dem Namen "Werkzeugpalette" für die Bildanalyse und -bearbeitung.
  2. Konvertieren Sie die Skalierung in Strahlkraft in der oberen linken Ecke des Bildes.
  3. Klicken Sie auf "Bild anpassen".
  4. Entscheiden Sie sich für das optimale Binning und die Farbskala der Bilder. Stellen Sie sicher, dass alle Bilder die gleichen Einstellungen verwenden.
  5. Klicken Sie auf "ROI-Tools" in der "Tool-Palette".
  6. Wählen Sie Interessengebiete aus, indem Sie in den "ROI-Tools" auf "ROI platzieren" klicken. Die Verwendung von ROIs gleicher Größe oder unterschiedlicher Größe kann je nach Versuchsdesign ebenfalls sinnvoll sein.
  7. Klicken Sie auf "ROIs messen". Es öffnet sich ein neues Fenster mit den Daten der platzierten ROIs. Exportieren Sie die Daten mit dem Windows-Befehl strg + c-strg + v in eine Organisations- oder Statistiksoftware Ihrer Wahl.
  8. Die Daten können als Gesamtfluss oder durchschnittliche Strahldichte exportiert werden. Wählen Sie aus, welche Variable in der aktuellen experimentellen Umgebung am relevantesten ist.
  9. Fortsetzung der Datenanalyse gemäß dem Versuchsplan. Eine individuelle Berechnung der (behandelten) Hintergrundwerte als "gemessene Wirkung bei einem Tier" wird empfohlen.

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Ergebnisse

Im Allgemeinen reicht die gemessene Strahldichte von Magnituden von 105 bis 1010 p/s/cm2/sr. Genaue Werte können jedoch zwischen Tieren innerhalb desselben Bildes und zwischen verschiedenen Bildern variieren. Daher kann der Vergleich von Rohdaten irreführend sein. Es ist wichtig, in allen Experimenten Kontroll- und Hintergrundsignale zu etablieren, daher werden selbstgesteuerte Designs dringend empfohlen.

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Diskussion

Die Bedrohungen, die von endokrin wirksamen Chemikalien (EDCs) für die menschliche Gesundheit ausgehen, sind allgemein bekannt. Die Forschung zu EDCs steht jedoch vor gewaltigen Herausforderungen. Diese Herausforderungen sind teilweise eine Folge der Komplexität des endokrinen Systems. Es wurde festgestellt, dass viele EDCs gleichzeitig mehrere endokrine Systeme stören22. Darüber hinaus gibt es im Zusammenhang mit der Schilddrüsenhormonökonomie (TH) eine zusätzliche Komplexitätsebene aufgrund gewe...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Projekt-Nr. RRF-2.3.1-21-2022-00011 mit dem Titel National Laboratory of Translational Neuroscience wurde mit Unterstützung der Aufbau- und Resilienzfazilität der Europäischen Union im Rahmen des Programms Széchenyi Plan Plus umgesetzt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3,5,3'-Trijodthyronin (T3)MerckT2877
TiereTHAI Maus
AugenschutzgelOculotect1000 IE/g
Falcon TubeThermo Fisher Scientific50 mL Volumen
Jodfreie Chow-DiätForschung Diäten benutzerdefinierte
IVIS Lumina II in vivo Bildgebung SystemPerkinElmer-Ketamin
VetcentreE1857
Living Image Software 4.5Perkin Elmer-zurVerfügung gestellt mit dem Gerät
Messzylinder250 mL
MethimazolMerckM8506
Mikrofuge-RöhrchenEppendorfZum Verdünnen von Behandlungsmaterialien
NaClO4Merck71852
Na-Luciferin, SubstratGoldbio103404-75-7
NaOHMerck101052833
Phoshphat Puffer KochsalzlösungChem Cruzsc-362302
PipetteGilsonZum Verdünnen von Behandlungsmaterialien
PipettenspitzenAxygenZum Verdünnen von Behandlungsmaterialien
Rasierschaum/Epilierer/RasiererPersönliche Präferenz
SpritzeB Braun1 mL Volumen
SpritzennadelB Braun0,3 x 12 mm
XylazinVetcentreE1852
, Mäuse

Referenzen

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