Pseudotypisierte Viren (PVs) sind replikationsdefekte Virionen, die verwendet werden, um Wirt-Virus-Interaktionen unter sichereren Bedingungen zu untersuchen als mit authentischen Viren. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das zeigt, wie SARS-CoV-2-PVs verwendet werden können, um die neutralisierende Fähigkeit des Serums von Patienten nach einer COVID-19-Impfung zu testen.
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Methodenartikel
Pseudotypisierte Viren als molekulares Werkzeug zur Überwachung humoraler Immunantworten gegen SARS-CoV-2 mittels Neutralisationsassay
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pseudotypisierte Viren (PVs) sind molekulare Werkzeuge, die verwendet werden können, um Wirt-Virus-Interaktionen zu untersuchen und die neutralisierende Fähigkeit von Serumproben zu testen, zusätzlich zu ihrer bekannteren Verwendung in der Gentherapie für die Verabreichung eines Gens von Interesse. PVs sind replikationsfehlerhaft, weil das virale Genom in verschiedene Plasmide unterteilt ist, die nicht in die PVs eingebaut sind. Dieses sichere und vielseitige System ermöglicht den Einsatz von PVs in Laboren der Biosicherheitsstufe 2. Hier stellen wir eine allgemeine Methodik zur Herstellung von lentiviralen PVs vor, die auf drei Plasmiden basiert, wie hier erwähnt: (1) das Rückgratplasmid, das das Reportergen trägt, das zur Überwachung der Infektion benötigt wird; (2) das Verpackungsplasmid, das die Gene für alle Strukturproteine enthält, die zur Erzeugung der PVs benötigt werden; (3) Das Expressionsplasmid der Hülloberfläche, das den Virustropismus bestimmt und den Eintritt des Virus in die Wirtszelle vermittelt. In dieser Arbeit ist SARS-CoV-2 Spike das Hüllglykoprotein, das für die Produktion von nicht-replikativen SARS-CoV-2-pseudotypisierten Lentiviren verwendet wird.
Kurz gesagt, Verpackungszellen (HEK293T) wurden mit den drei verschiedenen Plasmiden unter Verwendung von Standardmethoden co-transfiziert. Nach 48 h wurde der Überstand, der die PVs enthielt, geerntet, filtriert und bei -80 °C gelagert. Die Infektiosität von SARS-CoV-2-PVs wurde getestet, indem die Expression des Reportergens (Luciferase) in einer Zielzelllinie 48 h nach der Infektion untersucht wurde. Je höher der Wert für relative Lumineszenzeinheiten (RLUs) ist, desto höher ist die Infektions-/Transduktionsrate. Darüber hinaus wurden die infektiösen PVs zu den seriell verdünnten Serumproben hinzugefügt, um den Neutralisationsprozess des Eintritts von Pseudoviren in die Zielzellen zu untersuchen, gemessen als Verringerung der RLU-Intensität: niedrigere Werte entsprechen einer hohen neutralisierenden Aktivität.
Einleitung
Pseudotypisierte Viren (PVs) sind molekulare Werkzeuge, die in der Mikrobiologie verwendet werden, um Wirt-Virus- und Pathogen-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen 1,2,3,4. PVs bestehen aus einem inneren Teil, dem viralen Kern, der das virale Genom schützt, und einem äußeren Teil, den Hüllglykoproteinen auf der Oberfläche des Virus, die den Tropismus definieren5. Ein Pseudovirus ist in der Zielzelle replikationsunfähig, da es nicht die gesamte genetische Information enthält, um neue Viruspartikel zu erzeugen. Diese K....
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Protokoll
Das vorliegende Protokoll wurde von der Ethikkommission der Universität Verona genehmigt und folgt den Richtlinien dieser Kommission (Zulassungsprotokoll Nr. 1538). Von den an der Studie teilnehmenden Probanden wurde eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. Vollblutproben wurden von Freiwilligen des Gesundheitspersonals (HCW) gesammelt, die gerade dabei waren, Anti-SARS-CoV-2-Impfstoffe zu erhalten. Diese Proben wurden in Kunststoffröhrchen mit Antikoagulanzien für die anschließende Isolierung von Serum15 gesammelt.
Alle folgenden Prozesse müssen in einer biologischen Haube der Klasse 2 unter sterile....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll beschreibt die Produktion von SARS-CoV-2-PVs und eine nachgelagerte Anwendung dieser PVs zur Analyse der Neutralisationsaktivität von Serum/Plasma von Probanden, die eine Anti-COVID-19-Impfung erhalten17. Darüber hinaus kann dieses Protokoll angewendet werden, um Pseudotypen jeder besorgniserregenden SARS-CoV-2-Variante (VOC) herzustellen, um die Entwicklung der neutralisierenden Reaktion zu testen. Obwohl dieses Protokoll die Untersuchung der humoralen Immunantwort nach einer COV.......
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Diskussion
Obwohl die Verwendung eines Wildtyp-Virus die tatsächliche Infektion simuliert, sind lentivirale PVs eine sicherere Option, um die Mechanismen zu untersuchen, die mit dem Eindringen und der Infektion von Viren verbunden sind, ohne die strengen Sicherheitsanforderungen, die für die Arbeit mit pathogenen Viren erforderlich sind 4,20,21. PVs bestehen aus einem replikationsdefekten Viruskern, der von der Oberflächenhülle eines patho.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Danksagungen
Wir würdigen den Beitrag der freiwilligen Helfer im Gesundheitswesen. Dieses Projekt wurde vom Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italien, unterstützt. AR und DZ wurden durch PRIN2022 (EU-Fördermittel; NextGenerationEU)
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m Filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-Well-Platte | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-Well-Platte | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten | Merck | 10403892 | |
| Schwarz Undurchsichtige 96-Well-Mikroplatte | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Fötales Kälberserum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism Version 7 | Graphpad dotmatics | NA | Im Manuskript ersetzen wir den Handelsnamen durch "Datenanalyseprogramm" |
| HEK293T Zellen | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2-Zellen | ATCC | CRL-3216 | HEK293T wurde transduziert, um ACE2 mit einem lentiviralen Vektor zu überexprimieren. |
| L-Glutamin | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | Im Manuskript ersetzen wir den Handelsnamen durch 'Luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Im Manuskript ersetzen wir den Handelsnamen durch "reduziertes Serummedium" |
| p8.91 Verpackung Plasmid | Di Genova et al., 2021 | Ein freundliches Geschenk von Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW-Reporter Plasmid | Di Genova et al., 2021 | Ein freundliches Geschenk von Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/Streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimin, verzweigt (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | Dieses Plasmid wurde verwendet, um HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike exprimierende Plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| zu erzeugensteadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | Im Manuskript haben wir den Handelsnamen durch "Luciferase-Lesereagenz" |
| ersetztTrypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
Referenzen
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963(2012).
- Pouget, M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
