Bestimmung der gerinnungsfördernden Aktivität extrazellulärer Vesikel (EV) mittels EV-aktivierter Gerinnungszeit (EV-ACT)

Zusammenfassung

Dieses Protokoll untersucht die Verwendung von extrazellulärem Vesikel (EV)-reichem Plasma als Indikator für die Gerinnungsfähigkeit von EV. EV-reiches Plasma wird durch einen Prozess der Differenzzentrifugation und anschließenden Rekalkifizierung gewonnen.

Zusammenfassung

Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EV) bei verschiedenen Erkrankungen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, insbesondere aufgrund ihrer starken gerinnungsfördernden Wirkung. Es besteht jedoch ein dringender Bedarf an einem Test am Krankenbett, um die gerinnungsfördernde Aktivität von EV im klinischen Umfeld zu bewerten. In dieser Studie wird die Verwendung der Thrombinaktivierungszeit von EV-reichem Plasma als Maß für die prokoagulanziale Aktivität von EV vorgeschlagen. Standardisierte Verfahren wurden verwendet, um Natriumcitrat-Vollblut zu erhalten, gefolgt von einer Differenzzentrifugation, um EV-reiches Plasma zu erhalten. Das EV-reiche Plasma und Calciumchlorid wurden in den Testbecher gegeben, und die Änderungen der Viskoelastizität wurden in Echtzeit mit einem Analysator überwacht. Die natürliche Gerinnungszeit von EV-reichem Plasma, bezeichnet als EV-ACT, wurde bestimmt. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg des EV-ACT, wenn EV aus dem Plasma gesunder Freiwilliger entfernt wurde, während es signifikant abnahm, wenn EV angereichert wurde. Darüber hinaus war EV-ACT in humanen Proben von Präeklampsie, Hüftfrakturen und Lungenkrebs erheblich verkürzt, was auf erhöhte Plasma-EV-Spiegel und die Förderung der Bluthyperkoagulation hindeutet. Mit seinem einfachen und schnellen Verfahren ist der EV-ACT ein vielversprechender Test am Krankenbett zur Beurteilung der Gerinnungsfunktion bei Patienten mit hohen EV-Plasmaspiegeln.

Einleitung

Thrombosen, die durch Hyperkoagulabilität verursacht werden, spielen eine bedeutende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, darunter Hirntrauma¹, Präeklampsie², Tumore³ und Frakturpatienten⁴. Der Mechanismus, der der Hyperkoagulabilität zugrunde liegt, ist komplex, und in jüngster Zeit wurde der Schwerpunkt auf die Rolle extrazellulärer Vesikel (EV) bei Gerinnungsstörungen gelegt. EVs sind vesikelartige Körper mit einer Doppelschichtstruktur, die sich von der Zellmembran lösen und einen Durchmesser von 10 nm bis 1000 nm haben. Sie sind mit einer Vielzahl von Krankheitsprozes....

Protokoll

Die Entnahme menschlicher Proben wurde von der medizinischen Ethikkommission des Allgemeinen Krankenhauses der Medizinischen Universität Tianjin genehmigt. Die Entnahme von menschlichem venösem Blut folgte streng der von der Nationalen Gesundheitskommission Chinas herausgegebenen Richtlinie, nämlich WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. Kurz gesagt, Blut wurde von gesunden Personen mit informierter Zustimmung aus der vorderen Armvene entnommen, und die Proben wurden mit 3,2% Natriumcitrat-Antikoagulans in einem Verhältnis von 1:9 gemischt. Als nur Proben von Natriumcitrat-Antikoagulanzien gesammelt wurden, wurde das erste Sammelgefäß verwor....

Ergebnisse

Die Thrombinaktivierungszeit von EV-reichem Plasma wurde mit einem viskoelastischen Methodenanalysator zur Messung der Plasmakoagulationszeit gemessen. Die Maschine besteht aus vier Hauptkomponenten: einem elektronischen Signalwandler, einer Sonde, einem Detektionsbehälter und einem Heizelement (Abbildung 1A,B). Die Sonde nutzt hochfrequente Schwingungen mit geringer Amplitude, um Änderungen der Plasmaviskosität zu erkennen. Die tägliche Qualitätskontrolle umfasst in erster .......

Diskussion

In dieser Studie wurde die Herstellung von EV-reichem Plasma beschrieben und die Rationalität der Methode mittels Durchflusszytometrie überprüft. Anschließend wurden die rekalzifizierten Plasmaproben für die ACT-Zeit unter Verwendung eines Gerinnselanalysators analysiert, der auf Viskoelastizitätsprinzipien²⁴ basiert. Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurde festgestellt, dass die Konzentration von EVs, die durch Ultrazentrifugation erhalten wurden, die EV-ACT-Zeit verkürzt.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AccuCount Ultra Rainbow Fluoreszierende Partikel	3,8 Mikrom; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		Für den quantitativen Nachweis von MP
Calciumchlorid	Werfen (China)	0020006800	20 mM
Century Gerinnselanalysator	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		Das Prinzip besteht darin, die Plasmaviskosität durch viskoelastische Methode zu messen
Einwegsonde und Testbecher	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa Durchflusszytometer	BD, USA		Wird zum Nachweis von MP
Megamix Polystyrolkügelchen	verwendet Biocytex, Marseille, Frankreich	7801	Das Megamix besteht aus einer Mischung von Mikrokügelchen mit ausgewählten Durchmessern: 0,5 &; Mikro; m, 0,9 µ m und 3 µm.