Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein hochauflösendes Respirometrie-Protokoll zur Analyse der Bioenergetik in PINK1 B9-Null-mutierten Fruchtfliegen vor. Die Methode verwendet das SUIT-Protokoll (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Abstract

Neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit (PD), und zelluläre Störungen wie Krebs sind einige der Erkrankungen, die den Energiestoffwechsel stören und die mitochondrialen Funktionen beeinträchtigen. Mitochondrien sind Organellen, die sowohl den Energiestoffwechsel als auch zelluläre Prozesse steuern, die am Überleben und Tod von Zellen beteiligt sind. Aus diesem Grund können Ansätze zur Bewertung der mitochondrialen Funktion wichtige Erkenntnisse über zelluläre Zustände in pathologischen und physiologischen Prozessen liefern. In diesem Zusammenhang ermöglichen hochauflösende Respirometrie-Protokolle (HRR) die Bewertung der gesamten mitochondrialen Atmungskettenfunktion oder der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe. Darüber hinaus erfordert die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie und Bioenergetik genetisch und experimentell handhabbare Modelle wie Drosophila melanogaster.

Dieses Modell bietet mehrere Vorteile, wie z. B. seine Ähnlichkeit mit der menschlichen Physiologie, seinen schnellen Lebenszyklus, seine einfache Wartung, seine Kosteneffizienz, seine hohe Durchsatzleistung und eine minimierte Anzahl ethischer Bedenken. Diese Eigenschaften machen es zu einem unschätzbaren Werkzeug zur Analyse komplexer zellulärer Prozesse. In der vorliegenden Arbeit wird erläutert, wie die Funktion der Mitochondrien mit Hilfe der Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-Mutante analysiert werden kann. Das pink1-Gen ist für die Kodierung der PTEN-induzierten putativen Kinase 1 verantwortlich, und zwar durch einen Prozess, der als Mitophagie bezeichnet wird und für die Entfernung dysfunktionaler Mitochondrien aus dem mitochondrialen Netzwerk entscheidend ist. Mutationen in diesem Gen wurden mit einer autosomal-rezessiven, früh einsetzenden familiären Form der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Dieses Modell kann verwendet werden, um die mitochondriale Dysfunktion zu untersuchen, die an der Pathophysiologie der Parkinson-Krankheit beteiligt ist.

Introduction

Mitochondrien sind zelluläre Organellen, die wichtige Funktionen steuern, darunter die apoptotische Regulation, die Kalziumhomöostase und die Beteiligung an Biosynthesewegen. Durch den Besitz von autonomem Erbgut sind sie in der Lage, zu zellulären Erhaltungs- und Reparaturprozessen beizutragen. Ihre Struktur beherbergt die Elektronentransportkette und die oxidative Phosphorylierung, die beide für die zelluläre Energie entscheidend sind ^1,2,3. Insbesondere wird die Energiekontrolle durch die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS)² erreicht. Eine Störung des Energiestoffwechsels mit Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen tritt sowohl beim Überleben als auch beim Tod der Zellen auf ^4,5 und ist häufig mit einer Vielzahl von menschlichen Pathologien wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit (PD) ^verbunden3,6.

Parkinson ist eine chronische, fortschreitende und neurologische Erkrankung. Die Hauptursache für diese Krankheit ist das Absterben von Gehirnzellen, insbesondere in der Substantia nigra, die für die Produktion des Neurotransmitters Dopamin verantwortlich sind, der die Bewegung steuert ^6,7,8. Die früheste Beobachtung, die Parkinsonismus mit mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung brachte, wurde 1988 in experimentellen Modellen gemacht, in denen Toxine verwendet wurden, die den Atmungskettenkomplex I⁹ hemmen.

Derzeit gibt es mehrere Methoden zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion 10,11,12,1 3; Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen bietet die hochauflösende Respirometrie (HRR) jedoch eine überlegene Sensitivität und Vorteile^13,14. HRR-Protokolle ermöglichen beispielsweise die Bewertung der gesamten mitochondrialen Atmungskettenfunktion oder der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe ^14,15. Mitochondriale Dysfunktionen können in intakten Zellen, isolierten Mitochondrien oder sogar ex vivo beurteilt werden 10,11,13,14.

Mitochondriale Dysfunktionen sind eng mit vielen pathologischen und physiologischen Prozessen verbunden. Daher ist es wichtig, die mitochondriale Physiologie und Bioenergetik mit Hilfe genetisch und experimentell behandelbarer Modellsysteme zu untersuchen. In dieser Hinsicht hat die Forschung an Drosophila melanogaster, der Fruchtfliege, mehrere Vorteile. Dieses Modell teilt grundlegende zelluläre Eigenschaften und Prozesse mit dem Menschen, einschließlich der Verwendung von DNA als genetischem Material, gemeinsamen Organellen und konservierten molekularen Signalwegen, die an der Entwicklung, der Immunität und der Zellsignalisierung beteiligt sind. Darüber hinaus haben Fruchtfliegen einen schnellen Lebenszyklus, eine einfache Wartung, niedrige Kosten, einen hohen Durchsatz und weniger ethische Bedenken, was sie zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Analyse komplexer zellulärer Prozesse macht 16,17,18,19,20.

Darüber hinaus wird ein Homolog des PTEN-induzierten putativen Kinase-1-Gens (pink1) in D. melanogaster exprimiert. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Entfernung beschädigter Mitochondrien durch den Prozess der Mitophagie⁸. Beim Menschen prädisponieren Mutationen in diesem Gen Personen für eine autosomal-rezessive familiäre Form der Parkinson-Erkrankung, die mit einer mitochondrialen Dysfunktion assoziiert^ist 8,21,22,23. Folglich ist die Fruchtfliege ein leistungsfähiges Tiermodell für Studien zur Pathophysiologie von Parkinson und zum Screening von Wirkstoffkandidaten mit Schwerpunkt auf mitochondrialer Dysfunktion und Bioenergetik. Daher wird in der vorliegenden Arbeit erläutert, wie die mitochondriale Funktion in einem Modell der Parkinson-Krankheit von D. melanogaster unter Verwendung der HRR-Technik im OROBOROS mit dem Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT)-Protokoll analysiert werden kann.

Protocol

Wir verwendeten die Sorten w¹¹¹⁸ (weiß) und w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (bezeichnet als Pink1^B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) aus dem Bloomington Drosophila Stock Center (ID-Nummer: 34749). In dieser Studie werden männliche D. melanogaster PINK1 B9-null-Mutanten mit männlichen D. melanogaster aus dem Stamm w¹¹¹⁸ verglichen, der als Kontrollgruppe verwendet wird (genetischer Hintergrund). Andere Parameter müssen gleichzeitig mit den Respirometrie-Experimenten analysiert werden, um sicherzustellen, dass die Fliegen den richtigen Genotyp (Pink1^B9/Y) haben, wie z. B. Thoraxdeformitäten und Fortbewegungsprobleme, die für pink1^B9-mutierte Fliegen gut beschrieben sind 24,25,26.

1. Tiere und Unterbringung

1. Halten Sie die Fliegen in Glasflaschen mit 10 ml Standardfutter (Hefe 1,73 %, Sojamehl 0,9 %, Maismehl 7,3 %, Agar 0,5 %, Maissirup 7,6 % und Propionsäure 0,48 %) bei konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit (25 °C bzw. 60 %) mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h:12 h.
2. Verwenden Sie für jedes Experiment zwei Fliegen, die 1-3 Tage nach der Exlosion gealtert sind.
   ANMERKUNG: Die PINK1^B9-null mutierten jungfräulichen weiblichen Fliegen wurden mit w¹¹¹⁸ Männchen gekreuzt, um die F1-Männchen mit dem Genotyp Pink1^B9/Y zu erhalten.

2. Probenvorbereitung

1. Bereiten Sie den MiR05-Puffer wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
2. Betäuben Sie die Fliegen auf Eis und geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen (zwei Fliegen pro Röhrchen) um.
3. In jedes Röhrchen 200 μl gekühlten MiR05-Puffer geben und die Fliegen homogenisieren. Homogenisieren Sie manuell und üben Sie sanften Druck aus (ca. 4-6 Stößel), um den Zerfall der Mitochondrien zu verhindern.

3. Hochauflösende respirometrische Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren

HINWEIS: Die OROBOROS-Kammern haben ein Gesamtvolumen von ca. 2 ml. Eine Kalibrierung ist erforderlich, um sicherzustellen, dass der Sauerstofffluss nahe 0 pmol liegt, um den Assay zu starten.

1. Beginnen Sie mit der Kalibrierung und geben Sie 2 ml MiR05 in die Kammer. Decken Sie die Kammer mit dem Stopfen ab, so dass keine Luftblasen entstehen. Ziehen Sie dann vorsichtig am Stopfen, um eine einzelne Luftblase zu bilden.
2. Öffnen Sie die OROBOROS Dat.Lab Software. Geben Sie eine Temperatur von 25 °C in das Feld Blocktemperatur ein und klicken Sie auf Mit Oxygraph-2k verbinden (Abbildung 1A).
3. Klicken Sie auf und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Kalibrierung gespeichert werden soll, und klicken Sie auf Speichern.
4. Wenn sich ein neues Fenster öffnet, benennen Sie das Experiment und die Proben (bei einer Kalibrierung einfach den Namen Kalibrierung eingeben) und klicken Sie auf Speichern.
5. Gehen Sie zum Menü Layout und wählen Sie die erste Option: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp wie in Abbildung 1B gezeigt.
6. Warten Sie, bis das Programm zum Kalibrierungslayout umgeleitet wird, warten Sie, bis die rote Linie eine gerade Standardlinie mit Punkten um 0 pmol zeigt. Wählen Sie dann zwei Punkte aus: einen für Kammer A und den anderen für Kammer B (Abbildung 1C), wenn die rote Linie genau bei Null liegt.
   HINWEIS: Die ausgewählten Punkte müssen einen Sauerstofffluss (rote Linie) um 0 aufweisen.
   1. Um die Punkte beider Kammern zu markieren, wählen Sie auf der rechten Seite des Bildschirms O_{2-Konzentration}, wählen Sie den markierten Punkt aus und kopieren Sie sowohl die Temperatur- als auch die Luftdruckwerte relativ zum Punkt. Fügen Sie diese Werte in die Felder unten ein und klicken Sie auf Kalibrieren und in Zwischenablage kopieren in der unteren rechten Ecke des Bildschirms, wie in Abbildung 2 dargestellt.
   2. Führen Sie diesen Vorgang für beide Kammern (A und B) durch, gehen Sie dann zum Menü Datei und wählen Sie Speichern und trennen.
      HINWEIS: Nach dem Kalibrierungsvorgang leitet das Programm den Benutzer zum Startbildschirm weiter, damit die Software bereit ist, den HRR-Test zu starten. Für diesen Test verwenden wir das SUIT-Protokoll.

4. SUIT-Protokoll

1. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Stopfen und öffnen Sie die Kammern.
2. Waschen Sie die Stopfen (mit der Spitze, die die Probe nicht berührt) und die Kammern mit 100 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge.
   HINWEIS: Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Probenwechsel.
3. Homogenisieren Sie die Fliegen in 200 μl Puffer, geben Sie den gesamten Probeninhalt mit einer Mikropipette in die Kammer und platzieren Sie den Stopfen in der Kammer, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Luftblasen entstehen.
   HINWEIS: Wenn sich Luftblasen bilden, entfernen Sie den Stopfen vorsichtig und fügen Sie 100 μl MIR05-Puffer hinzu.
4. Klicken Sie auf das Menü Layout , und wählen Sie die Option 05 Durchfluss nach korrigiertem Volumen , wie in Abbildung 1B dargestellt.
5. Warten Sie, bis Sie zu einem neuen Fenster weitergeleitet werden. Klicken Sie auf Speichern , um den Ordner auszuwählen, in dem das Experiment gespeichert werden soll.
6. Warten Sie, bis sich ein weiteres neues Fenster öffnet. Nennen Sie das Experiment im Bereich Experimental Code. Benennen Sie dann jede Probe in der jeweiligen Kammer im Feld Probe mit A und B und setzen Sie das Feld Einheit auf Einheit.
   HINWEIS: Es können auch andere Einheiten gewählt werden, z. B. Millionen von Zellen oder mg.
7. In Anbetracht der Tatsache, dass in diesem Protokoll zwei Fliegen (2 Einheiten) verwendet werden und das Kammervolumen 2 ml beträgt, definieren Sie im Feld Konzentration 1 pro ml (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Hier wurde die Probenmenge durch die Anzahl der Fliegen normalisiert; Diese Normalisierung kann jedoch durch den Proteingehalt der Probe, die Quantifizierung der mitochondrialen DNA oder die Aktivität der Citratsynthase erfolgen.
8. Wenn das Sauerstoffflusssignal (rote Linie) stabil auf dem positiven Wert liegt, beginnen Sie das HRR-Protokoll mit der Titration von Substraten, Inhibitoren und Entkopplern (Abbildung 3). Alle nachfolgenden Reagenzien und Geräte sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   1. Fügen Sie Digitonin (5 μg/ml) hinzu, um die Mitochondrienmembran zu permeabilisieren.
   2. Fügen Sie Pyruvat (5 mM), Malat (2 mM) und Prolin (10 mM) hinzu und warten Sie, bis der Sauerstofffluss zunimmt und sich stabilisiert. Um das Ereignis für jede Reagenzzugabe zu markieren, drücken Sie die Taste F4 auf der Tastatur und geben Sie den Namen jedes Reagenzes ein.
   3. Fügen Sie ADP (5 mM) hinzu, um die mitochondriale Atmungskette zu koppeln, und warten Sie auf die Erhöhung und Stabilisierung des Sauerstoffflusses.
   4. Fügen Sie Succinat (10 mM) hinzu und warten Sie, bis sich der Sauerstofffluss erhöht und stabilisiert hat.
   5. Fügen Sie Oligomycin (2,5 μM) hinzu, um die ATP-Synthase zu hemmen, und suchen Sie nach einer Abnahme des Sauerstoffflusses.
   6. Warten Sie, bis sich die rote Linie stabilisiert hat, und entkoppeln Sie den mitochondrialen Elektronentransfer mit Carbonyl-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazoncyanid (FCCP) mit Titern von 0,25 μM, bis der maximale Sauerstoffverbrauch erreicht ist, was durch den Anstieg der roten Linie demonstriert wird. Nach der Stabilisierung des Sauerstoffflusses beginnen Sie mit der Zugabe der Inhibitoren jedes Komplexes, einen nach dem anderen.
   7. Fügen Sie Rotenon (0,5 μM) hinzu, einen Komplex-I-Inhibitor. Warten Sie, bis der Sauerstofffluss abgenommen und stabilisiert ist, um den nächsten Inhibitor hinzuzufügen.
   8. Fügen Sie Malonat (5 mM), einen Komplex-II-Hemmer, hinzu. Warten Sie, bis der Sauerstofffluss abgenommen und stabilisiert ist, um den nächsten Inhibitor hinzuzufügen.
   9. Zum Schluss wird Antimycin (2,5 μM), ein Komplex-III-Hemmer, hinzugefügt. Warten Sie auf die Abnahme, gefolgt von der Erhöhung und Stabilisierung des Sauerstoffflusses.
      HINWEIS: Der Sauerstofffluss sollte sich bei einem positiven Wert, aber unter dem Wert für die letzte Hemmung der mitochondrialen Proteinkomplexe stabilisieren.
9. Am Ende der Analyse wird der gesamte Inhalt der Kammern mit einer Mikropipette entfernt. Bei -20 °C lagern, um bei Bedarf Analysen durchführen zu können.

5. Datenanalyse

1. Verwenden Sie ein geeignetes Statistik-Softwarepaket für die Datenanalyse.
2. Führen Sie t-Tests durch, um die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu bewerten. Verwenden Sie in Situationen, in denen mehrere Behandlungen erforderlich sind, die Varianzanalyse (ANOVA) als statistischen Test ²⁷.
3. Extrahieren Sie die_{O2-Flusswerte} aus dem von der Software generierten Diagramm. OXPHOS CI bezieht sich auf den Wert des_{O2-Flussmittels} nach Zugabe von ADP. OXPHOS CII erhält man durch Subtraktion von OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII ist der Wert des_{O2-Flussmittels} , das nach Zugabe von Succinat extrahiert wird. ETS CI&CII ist der_O2-Flusswert nach Zugabe von FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenon und ETS CII = Rotenon - Malonat.
4. Berechnen Sie die ATP-Synthese als Differenz zwischen OXPHOS (P) und LEAK (L) (P - L⁾²⁸.
5. Bestimmen Sie das Respiratory Control Ratio (RCR) durch Berechnung des Verhältnisses OXPHOS/LEAK, wobei RCR = P/^L.11

Results

Hier zeigen wir, dass der_O2-Fluss in den Zuständen OXPHOS CI (P = 0,0341) und OXPHOS CI&II (P = 0,0392) in PINK1^B9 Nullfliegen im Vergleich zu Kontrollfliegen reduziert ist (Abbildung 4). Dieses Ergebnis wurde auch in früheren Befunden aus unserer Gruppe^29,30 beobachtet.

CI und CII sind Schlüsselkomponenten des Elektronentransportsystems (ETS), in dem CI ...

Discussion

HRR ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung und des Energiestoffwechsels in D. melanogaster und anderen Organismen. Es bietet eine detaillierte und quantitative Bewertung der mitochondrialen Funktion, die es den Forschern ermöglicht, Einblicke in die Bioenergetik der Zellen zu gewinnen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Bewertung der Funktion der mitochondrialen Atmungskette und der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe unter Verwendung des SUIT-Protoko...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich	A5285	Adenosin-5′-diphosphat sodium sal (CAS-Nummer 72696-48-1); ≥ 95%; Molekulargewicht = 501,31 g/mol.
&Aakut; gar	Kasv	K25-1800	Zur bakteriologischen Anwendung
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A aus Streptomyces sp. (CAS-Nummer 1397-94-0); Molekulargewicht & nbsp; 540 g/mol;
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Rinderserumalbumin (CAS-Nummer 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software	Oroboros Instruments, Innsbruck, Österreich	20700	Software zur Datenerfassung und -analyse
Digitonin	Sigma-Aldrich	D 5628	CAS-Nummer 11024-24-1
Destilliertes Wasser
Drosophila melanogaster Stamm w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3			Gewonnen aus Bloomington Drosophila
StammcenterDrosophila melanogaster Stamm  w1118			Erhalten  von der Federal University of Santa Maria
EGTA	Sigma-Aldrich	E8145	Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (CAS-Nummer 13638-13-3); ≥ 97%; Molekulargewicht = 468,28 g/mol
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920	Carbonylcyanid 4- (trifluormethoxy)phenylhydrazon  (CAS-Nummer 370-86-5); ≥ 98% (TLC), Pulver
GraphPad Prism Version 8.0.1.			Software zur Datenerfassung und -analyse
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (CAS-Nummer 7365-45-9); ≥ 99,5% (Titration), zellkultiviert getestet; Molekulargewicht = 238,30 g/mol
Hochauflösendes Respirometer Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Österreich	10022-02	Startup O2K Respirometer Kit
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Monokaliumphosphat (CAS-Nummer 7778-77-0); Reagenz Plus, molekulares Gewicht = 136,09 g/mol
KOH	Sigma-Aldrich	211473	Kaliumhydroxid (CAS-Nummer 1310-58-3); ACS-Reagenz, ≥ 85%, Pellets
Malat	Sigma-Aldrich	M1296	Malonsäure (CAS-Nummer 141-82-2); 99%, Molekulargewicht = 104,06 g/mol). Eine Lösung wird auf einen pH-Wert von ca. 7,0 eingestellt.
Apfelsäure	Sigma-Aldrich	M1000	(S)-(−)-2-Hydroxybernsteinsäure (CAS-Nummer 97-67-6); ≥ 95% ; Molekulargewicht = 134,09 g/mol
MES	Sigma-Aldrich	M3671	2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (CAS-Nummer 4432-31-9); ≥ 99% (Titration); Molekulargewicht = 195,24 g/mol
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Magnesiumchlorid (CAS-Nummer 7786-30-3); wasserfrei, ≥ 98%, Molekulargewicht = 95,21 g/mol
Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf
O2K-Titration Set	Oroboros Instruments, Innsbruck, Österreich	20820-03	Hamilton Spritzen mit unterschiedlichen Volumina
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O 4876	Oligomycin aus  Streptomyces diastatochromogenes (CAS-Nummer  1404-19-9); ≥ 90 % Gesamt-Oligomycin-Basis (HPLC)
Stempel zur Homogenisierung
Prolin	Sigma-Aldrich	P0380	L-Prolin (CAS-Nummer 147-85-3); Pulver; 99 %; Molekulargewicht = 115,13 g/mol
Pyruvat	Sigma-Aldrich	P2256	Natriumpyruvat (CAS-Nummer 113-24-6), ≥ 99%; Molekulargewicht = 110,04 g/mol
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875	Roteton (CAS-Nummer 83-79-4); ≥ 95%, Molekulargewicht 394,42 g/mol
Succinat	Sigma-Aldrich	S 2378	Natriumsuccinat zweibasisches Hexahydrat (CAS-Nummer 6106-21-4); ≥ 99%
Saccharose	Merck	107.651.000	Saccharose für die Mikrobiologie (CAS-Nummer 57-50-1)
Taurin	Sigma-Aldrich	T0625	CAS-Nummer 107-35-7