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Methodenartikel

Knockdown von FAM83A zum Nachweis seiner Rolle beim Zellwachstum von Gebärmutterhalskrebs und der Sensitivität von Cisplatin

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DOI:

10.3791/65667

⸱

9. Februar 2024

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Jingzhou Hospital, Yangtze University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Gong An County People's Hospital, 3Department of Ultrasound, Zhijiang People's Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier zeigen wir die Verfahren für den FAM83A-Knockdown ; die Assays zum Nachweis seiner Auswirkungen auf die Proliferation, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen; und die Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber Cisplatin. Diese Studie liefert ein vielversprechendes Zielgen für Gebärmutterhalskrebs und eine Referenz für die weitere Medikamentenforschung.

Zusammenfassung

Die Erforschung von Tumorzielgenen ist für die Prävention und Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von größter Bedeutung. In dieser Studie skizzieren wir die Schritte zur Identifizierung eines Tumor-Zielgens FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs. Zunächst wurde der Datensatz des Cancer Genome Atlas verwendet, um die Expression und prognostische Bedeutung von FAM83A bei Frauen zu validieren. Eine kleine interferierende RNA (siRNA) wurde für den Knockdown des FAM83A-Gens in HeLa- und C33a-Zellen verwendet. Als nächstes wurde eine 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU)-Färbung durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Proliferationsfähigkeit der Tumorzellen zu bestimmen. Wundheilungs- und poröse Membraninsert-Assays wurden durchgeführt, um die Migration und Invasionsfähigkeit von Tumorzellen zu bewerten.

Western Blot wurde verwendet, um Apoptose-assoziierte Proteinspiegel zu quantifizieren. Die JC-1-Färbung wurde verwendet, um Veränderungen der mitochondrialen Funktion zu bewerten. Darüber hinaus wurde die Intervention mit Cisplatin (Diamindichlorplatin, DDP) eingesetzt, um das therapeutische Potenzial des Zielgens zu bewerten. Durchflusszytometrie und Koloniebildungsassays wurden durchgeführt, um die krebshemmenden Eigenschaften des Gens weiter zu validieren. Infolgedessen wurde gezeigt, dass der FAM83A-Knockdown die Proliferation, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen hemmt und diese Zellen für Cisplatin sensibilisiert. Diese umfassenden Methoden validieren FAM83A als tumorassoziiertes Zielgen, das als potenzielles therapeutisches Ziel in der Prävention und Behandlung von Gebärmutterhalskrebs vielversprechend ist.

Einleitung

Gebärmutterhalskrebs ist ein globales Problem, da es eine der weltweit führenden Arten von gynäkologischen Malignomen ist und die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle bei Frauen ist1. Radikale Operationen und Radiochemotherapie sind mit hohen Heilungsraten im Primärstadium verbunden. Die Behandlungsergebnisse für Patientinnen im fortgeschrittenen Stadium des Gebärmutterhalskrebses, die eine metastasierende Erkrankung entwickeln, sind jedoch sehr ungünstig2. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die biologischen Mechanismen, die der Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen zugrunde liegen, besser zu verstehen und potenzielle therapeutische Ziele für die Vorbeugung und Behandlung dieser Krankheit zu identifizieren.

Die Identifizierung von Zielgenen, die an der Krebsprogression beteiligt sind, und die Suche nach Wegen, ihre Expression oder Wirkung zu hemmen, stellen vielversprechende Behandlungsoptionen dar. In dieser Studie identifizierten wir FAM83 als krebserregendes Gen und untersuchten seine hemmende Wirkung auf C33a- und HeLa-Zellen. Onkogene der FAM83-Familie (FAM83A-H) sind bei Krebserkrankungen beim Menschen weit verbreitet 3,4. Kürzlich wurde berichtet, dass FAM83A bei Lungenkrebs5,Brustkrebs 6, Eierstockkrebs7 und Bauchspeicheldrüsenkrebs8 hochreguliert ist, was darauf hindeutet, dass FAM83A eine wichtige Rolle bei der Krebsprogression spielt, indem es die Proliferation, Invasion, stammzellähnliche Merkmale und Arzneimittelresistenz in den Tumorzellen fördert. Wichtig ist, dass FAM83A als eines der neuen Kandidatengene identifiziert wurde, die mit der Progression zervikaler Läsionen und der Karzinogenese assoziiertsind 9. Trotz der Bestätigung einer erhöhten FAM83A-Expression in menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen sind die spezifischen Auswirkungen und die zugrunde liegenden Mechanismen von FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs nach wie vor unklar.

In dieser Studie skizzieren wir die Protokolle zur Identifizierung von FAM83A als Tumorzielgen bei Gebärmutterhalskrebs und verwenden eine kleine interferierende RNA (siRNA) für den Knockdown des FAM83A-Gens in HeLa- und C33a-Zellen . Eine 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU)-Färbung wurde durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Tumorzellproliferation zu bestimmen, während Wundheilungs- und poröse Membraninsert-Assays dazu beitrugen, die Migration und Invasionsfähigkeit von Tumorzellen zu bewerten.

Western Blot wurde durchgeführt, um die Konzentrationen von Apoptose-verwandten Proteinen zu bestimmen, und JC-1-Färbung wurde verwendet, um mitochondriale Funktionsänderungen zu bewerten. So berichteten wir, dass FAM83A eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation, Metastasierung und Invasion bei Gebärmutterhalskrebs spielt. Durch PI3K/AKT-Signalweg-assoziierte mitochondriale Dysfunktion und Apoptose sensibilisierte FAM83A Gebärmutterhalskrebszellen für Cisplatin (Diamindichlorplatin, DDP). Diese Studie bietet ein neues Ziel für Gebärmutterhalskrebs und möglicherweise andere Krebsarten und eine Referenz für die Entwicklung von Strategien zur Überwindung der Resistenz von Krebszellen gegen bestimmte Chemotherapeutika.

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Protokoll

Die Studie entsprach vollständig den Publikationsrichtlinien der TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Datenquellen- und bioinformatische Analyse

  1. Beziehen Sie RNA-Sequenzierungsdaten aus der Datenbank des Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) für die Clusteranalyse. Verwenden Sie GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), ein webbasiertes Tool zur Neuberechnung von RNA-Seq-Rohdaten von Proben aus TCGA-Projekten, um mit einer Standard-Verarbeitungspipeline nach potenziellen Zielmolekülen für Krebsmedikamente zu suchen.
    HINWEIS: Die GEPIA-Website ist für alle Nutzer frei zugänglich.
  2. Rufen Sie die Homepage der GEPIA-Website auf und klicken Sie auf Krebstypanalyse, wählen Sie die Option Differentielle Genanalyse und stellen Sie die folgenden Parameter ein: Krebsname = CESE (definiert als zervikales Plattenepithelkarzinom und endozervikales Adenokarzinom auf dieser Webseite), |Log2FC| Cutoff = 1, q-Wert Cutoff = 0,01, differentielle Methoden = ANOVA und chromosomale Verteilung = beides. Klicken Sie dann auf Liste, um eine Genliste zu erhalten, die die unterschiedliche Expression zwischen Tumor- und Normalgruppen zeigt.
    HINWEIS: Es erfordert eine umfangreiche Literaturrecherche, um differentiell exprimierte Kandidatengene zu identifizieren. In dieser Studie konzentrieren wir uns unter Berücksichtigung des Hintergrunds der verfügbaren Literatur auf das interessierende Tumorgen FAM83A.
  3. Untersuchen Sie dann die Expression von FAM83A in Gebärmutterhalskrebs und normalem Gewebe mit GATTIA, indem Sie auf der Website zur Option Expression DIY gehen und Boxplot als Diagrammtyp auswählen. Geben Sie FAM83A in das Feld Genparameter ein und stellen Sie die folgenden Parameter ein: |Log2FC| Grenzwert = 1; q-Wert Cutoff = 0,01. Wählen Sie CESE als Krebsnamen und TCGA-Normaldaten abgleichen für das Datenfeld "Übereinstimmende Normale " aus, wobei alle anderen Einstellungen auf den Standardeinstellungen belassen werden. Klicken Sie auf Plot und erlauben Sie der Website, einen Boxplot zu erstellen, der die differentielle Expression des FAM83A-Gens darstellt. Speichern Sie den Boxplot zum späteren Nachschlagen und Analysieren.
  4. Schließlich wird das Gesamtüberleben von Patientinnen mit Tumoren mit unterschiedlicher FAM83A-Expression bei Gebärmutterhalskrebs analysiert. Navigieren Sie auf der Website zur Option Survival Plots, setzen Sie das Gen auf FAM83A und wählen Sie Overall Survival als Analysetyp aus. Fügen Sie den Tumornamen CESE hinzu, wählen Sie Monate für die Achseneinheiten und belassen Sie alle anderen Parameter auf ihren Standardeinstellungen. Klicken Sie auf Plot und lassen Sie die Website ein Überlebenskurvendiagramm erstellen. Speichern Sie dieses Diagramm zum späteren Nachschlagen und Analysieren.
  5. Berücksichtigen Sie sowohl die differentielle Expression von FAM83A in Tumoren als auch seine Korrelation mit der Überlebensanalyse von Patienten, um FAM83A als potenzielles therapeutisches Zielgen bei Gebärmutterhalskrebs zu identifizieren.

2. Zellbasierte Experimente

  1. Zellkultur
    1. Kultivierung humaner Tumorzelllinien im modifizierten Medium bei 37 °C in einer befeuchteten 5%igenCO2-Atmosphäre .
      HINWEIS: Informationen zu Zelllinien und Komponenten des Kulturmediums finden Sie in der Materialtabelle .
  2. Transfektion von Zellen
    1. Verwenden Sie siRNA, um die FAM83A-Expression in den Zellen zu unterbinden.
      HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die spezifische siRNA-Sequenz.
    2. Die Samenzellen werden in 6-Well-Platten abgefüllt und mit der Mischung aus 50 nM si-FAM83A oder siRNA-NC und 8 μl Transfektionsmittel oder nur 8 μl Transfektionsmittel für 4-6 h inkubiert, nachdem eine Konfluenz von 50 % bis 70 % erreicht wurde. Geben Sie nur serumfreies DMEM in die Negativkontrolle.
    3. Ersetzen Sie nach der Inkubation das Medium, das das Transfektionsmittel enthält, durch DMEM + 10% fetales Kälberserum. Behandeln Sie 48 Stunden nach der Transfektion wie vorgesehen 24 Stunden lang mit 5 μM Cisplatin (DDP) und ernten Sie alle Zellen für die Gesamt-RNA-Extraktion und die qRT-PCR-Analyse.

3. EdU-Nachweis für den Zellproliferationsassay

HINWEIS: Verwenden Sie das EdU Cell Proliferation Kit, um die Zellproliferation in vitro gemäß den Anweisungen des Herstellers zu beurteilen.

  1. Die Zellen werden in 6-Well-Platten ausgesät und 2 h lang mit 10 μM EdU-Lösung inkubiert. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) und permeabilisieren Sie mit 0,3 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei RT.
  2. Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer und fügen Sie 500 μl 1x Reaktionslösung hinzu. Dann 30 Minuten lang bei RT im Dunkeln inkubieren, um die Kernfärbung zu gewährleisten.
  3. Färben Sie Zellen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und visualisieren Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Färben Sie die Zellkerne der proliferierenden Zellen mit EdU und untersuchen Sie sie auf rote Fluoreszenz.
  4. Verwenden Sie schließlich eine Software, um die Ergebnisse zu quantifizieren, indem Sie mindestens 10 zufällige Felder zählen und die Proliferationsraten anhand des Verhältnisses der fluoreszenzpositiven Zellen zur Gesamtzahl der Zellen berechnen.

4. Wundheilungs-Assay

  1. Samenzellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Well.
  2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, verwenden Sie eine sterile 10-μl-Mikropipettenspitze, um vorsichtig einen linearen Kratzer in der Zellmonoschicht zu erzeugen. Spülen Sie die Vertiefungen vorsichtig mit sterilem PBS, um alle abgelösten Zellen und Ablagerungen zu entfernen, die durch Kratzen verursacht wurden.
  3. Anschließend werden die Zellen in einem Medium mit 1 % FBS inkubiert. Beobachten und fotografieren Sie dann mit dem invertierten Mikroskop die Heilung der verwundeten Region um 12, 24 und 48 Uhr.

5. Assay für poröse Membraneinsätze

  1. Es wird eine Zellsuspension in Zellkulturmedium in der gewünschten Zellkonzentration (mit 4 × 104 Zellen) hergestellt, einschließlich transfizierter oder kontrollierter C33a-Zellen und HeLa. Geben Sie die Zellsuspension in die obere Kammer der Membraneinsätze und sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung. Füllen Sie das komplette Medium in die untere Kammer.
  2. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden werden Methylalkohol und 0,1 % Kristallviolett für die Fixierung bzw. Färbung der in die unteren Kammern wandernden Zellen verwendet.
  3. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um Bilder aufzunehmen, und analysieren Sie dann die Anzahl der wandernden Zellen, indem Sie mindestens 10 zufällige Felder mit ImageJ zählen.
    1. Für die Zahlenanalyse mit ImageJ öffnen Sie das Bild in der ImageJ-Software, gehen Sie im Werkzeugmenü auf die Registerkarte Bild , wählen Sie Anpassen und klicken Sie dann auf Schwellenwert. Passen Sie die Schwellenwerteinstellungen bei Bedarf an, bis nur noch die Zellen vor weißem Hintergrund sichtbar sind.
    2. Klicken Sie im Fenster Schwellenwert auf Anwenden, um diese Einstellungen auf das Bild anzuwenden. Wählen Sie nun das Werkzeug Zauberstab (Nachzeichnen) in der Symbolleiste (oben im Fenster) aus.
    3. Klicken Sie auf den Bereich des Bildes, in dem sich die Zellen befinden, um alle Zellen im Bild mit Schwellenwert auszuwählen. Nachdem die Zellen markiert wurden, gehen Sie im Menü "Werkzeug" zu "Analysieren" und klicken Sie dann auf "Partikel analysieren". Geben Sie im Fenster "Partikel analysieren" die gewünschten Werte für die Größe (z. B. 0 - unendlich) und die Zirkularität (z. B. 0,00 - 1,00) gemäß den experimentellen Anforderungen ein, um alle Zellen in die Zählung einzubeziehen.
    4. Klicken Sie auf OK und warten Sie, bis die Software die Zellen gezählt hat und ein neues Fenster mit den Analyseergebnissen angezeigt wird.

6. Assay der Koloniebildung

  1. 2 × 105 Zellen Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen pro Well in eine 6-Well-Platte mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung für 24 h bringen.
  2. Nach einer 24-stündigen medikamentösen Behandlung werden die Zellen mit 0,25 % Trypsin abgetrennt und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % FBS resuspendiert. Die resuspendierten Zellen werden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 103 Zellen pro Well ausgesät und dann in einem 5%igen CO2 -Inkubator bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert.
  3. Nach der Inkubation für ~7-10 Tage, wenn die Kolonien sichtbar sind, fixieren Sie die Zellen mit 4% Polyoxymethylen und färben Sie sie 20 Minuten lang mit Giemsa-Färbelösung.
  4. Waschen Sie die Zellen leicht und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen. Machen Sie Bilder der Koloniecluster mit dem Mikroskop und zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die mehr als 50 Zellen enthalten.

7. Analyse der mitochondrialen Membrandepolarisation (MMP) mit dem Farbstoff JC-1

  1. 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
  2. Inkubieren Sie mit 1x JC-1-Färbelösung für 15-20 Minuten unter 5 % CO2 bei 37 °C unter Verwendung eines mitochondrialen Membranpotential-Assay-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Waschen Sie die Zellen und untersuchen Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung unter Verwendung von Anregungs- und Emissionswellenlängen für JC-1 bei ~490 nm bzw. 590 nm. Um die JC-1-Fluoreszenz sichtbar zu machen, verwenden Sie geeignete Filter, wie z. B. einen blauen Anregungsfilter (450-490 nm) und einen roten Emissionsfilter (Langpass > 590 nm), um das emittierte Fluoreszenzsignal selektiv einzufangen.

8. Durchflusszytometrische Analyse von mPTP

  1. 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
  2. Entfernen Sie das Kulturmedium von den Zellen, resuspendieren Sie die Zellen in PBS und fügen Sie jeweils 300 μl (1x Volumen) Calcein-AM-Färbelösung und Fluoreszenzlösch-Arbeitslösung hinzu, um die Zellen gleichmäßig zu bedecken. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer lichtgeschützten Umgebung für 30-45 Minuten und ersetzen Sie das Medium durch frisches, vorgewärmtes Nährmedium bei 37 °C. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer lichtgeschützten Umgebung für weitere 30 Minuten, um eine vollständige Hydrolyse von Calcein AM durch intrazelluläre Esterasen zu gewährleisten, was zur Bildung von intrazellulärem grün fluoreszierendem Calcein führt.
  3. Entfernen Sie das Nährmedium, waschen Sie die Zellen 2-3x mit PBS und fügen Sie Nachweispuffer hinzu. Nachweis von Zell-mPTP mittels Durchflusszytometrie und einer Anregungswellenlänge von 488 nm.

9. Durchflusszytometrie

  1. 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
  2. Nach 24 Stunden medikamentöser Behandlung werden die Zellen in 200 μl Bindungspufferlösung resuspendiert und 10 μl Annexin V-FITC und 5 μl Propidiumiodid (PI) vorsichtig in die Zellsuspension gemischt. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang unter Vermeidung von Licht und geben Sie 300 μl Bindungspufferlösung zu den Zellen. Nachweis der Zellapoptose mittels Durchflusszytometrie bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm.

10. RT-PCR-Analyse

  1. 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
  2. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus den Tumorzellen mit dem RNA-Extraktionsreagenz und wandeln Sie die extrahierte RNA mit dem cDNA-Synthese-Mix in komplementäre DNA (cDNA) um, indem Sie 45 Minuten lang bei 42 °C und dann 5 Minuten lang bei 95 °C inkubieren.
  3. Bereiten Sie die PCR-Reaktionsmischung vor, die DNA-Polymerase, Nukleotide, Puffer und die entworfenen genspezifischen Primer enthält. Die cDNA-Matrize wird für die Real-Time-PCR-Reaktion zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und die PCR auf dem quantitativen Real-Time-PCR-Gerät unter den folgenden Thermocycling-Bedingungen durchgeführt: Denaturierung bei 95 °C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 5 s und 60 °C für 30 s und der Schmelzkurvenstufe bei 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 Minute und 95 °C für 15 s. Quantifizierung der mRNA-Spiegel mit der 2−ΔΔCq-Methode unter Verwendung von GAPDH als interne Kontrolle.
    HINWEIS: Das RT-PCR-Reaktionssystem ist in Tabelle 1 dargestellt, und die Primersequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt.
    1. Um den 2−ΔΔCq− Wert zu berechnen, werden die Cq−Werte für das Zielgen und das Referenzgen (GAPDH) in den Proben gemessen. Berechnen Sie den ΔCq-Wert, indem Sie den Cq-Wert des Referenzgens vom Cq-Wert des Zielgens für jede Probe subtrahieren. Berechnen Sie das ΔΔCq, indem Sie das ΔCq einer Kontrollprobe vom ΔCq jeder experimentellen Probe subtrahieren. Berechnen Sie schließlich den 2−ΔΔCq− Wert, indem Sie 2 hoch zum ΔΔCq−Wert erhöhen.
      HINWEIS: Der Cq-Wert stellt die Zykluszahl dar, bei der das Fluoreszenzsignal den eingestellten Schwellenwert erreicht.

11. Western-Blot-Analyse

  1. 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
  2. Sammeln Sie die kultivierten Zellen und waschen Sie sie mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um alle verbleibenden Wachstumsmedien oder Serumreste zu entfernen. Lysieren Sie die Zellen mit RIPA-Lysepuffer, der Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthält, um die zellulären Proteine freizusetzen. Die Zellen werden einige Minuten lang auf Eis inkubiert, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten, und bei 4 °C 12.000 × g für 15 Minuten zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand, um seine Proteinkonzentration zu bestimmen.
  3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration im Zelllysat mit einem BCA Protein Assay Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Mischen Sie das Zelllysat mit einem Beladungspuffer und erhitzen Sie die Mischung bei 95-100 °C für 5-10 Minuten, um die Proteine zu denaturieren und eine gleichmäßige Trennung auf dem Gel zu gewährleisten.
  4. Von jeder Probe werden 30 μg Gesamtprotein auf ein SDS-PAGE-Gel geladen und das SDS-PAGE unter einer konstanten Spannung von 80 V betrieben. Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn das Bromphenolblau den Boden des Trenngels erreicht.
  5. Die abgetrennten Proteine aus dem Gel werden mit einem Nasstransfersystem in einem Eisbad mit einem Strom von 200 mA für 1,5 h auf eine Polyvinyldifluorid-Membran übertragen.
  6. Blockieren Sie die Membran mit 5 % fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween-20-Puffer (TBST) für 1 Stunde bei RT und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit den entsprechenden Antikörpern, die in der Materialtabelle angegeben sind.
  7. Waschen Sie die Membran mehrmals mit TBST und inkubieren Sie mit den sekundären Antikörpern (Materialtabelle) 1 h bei RT, gefolgt von einem Waschen mit TBST. Visualisieren Sie die Proteinbanden mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Detektionskit und einem Imager-System.

12. Statistische Analyse

  1. Da alle experimentellen Datenpunkte unabhängig sind, stellen Sie die Daten als Mittelwert ± SD dar. Führen Sie eine statistische Analyse durch.
  2. Verwenden Sie die unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) für Mehrfachvergleiche und den Dunnett-Test, um jede Gruppe mit der Kontrollgruppe zu vergleichen. Verwenden Sie den t-Test des Schülers (ungepaarter zweiseitiger Test), um zwei Gruppen zu vergleichen. P < 0,05 als signifikant erachten.

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Ergebnisse

TCGA-Datenbankanalyse und PCR-Validierung

Ausgehend von der TCGA-Datenbankanalyse führten wir eine vergleichende Analyse der mRNA-Expressionsniveaus in 306 Gebärmutterhalskrebs-Zellproben und 13 normalen Zellproben durch, um die differentielle Expression von FAM83A zu untersuchen. FAM83A war bei Gebärmutterhalskrebs hochreguliert, während seine Expression im normalen Gebärmutterhalsgewebe verna...

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Diskussion

Die Untersuchung von Tumor-Zielgenen ist sowohl für die Prävention als auch für die Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von größter Bedeutung. Das Verständnis der spezifischen Gene, die eine wichtige Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Gebärmutterhalskrebs spielen, bietet wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Krankheit. Darüber hinaus kann die Identifizierung dieser Zielgene zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien und zielgerichteter Therapien führen. In di...

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Offenlegungen

Die Autoren berichten über keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation unterstützt (Nr. 2020HC06).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cells and Medium Formulation
C33aAmerican Type Culture Collection
HelaAmerican Type Culture Collection
Modifiziertes Medium10% fötales Rinderserum und + Antibiotika (100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin)
Informationen zum Antikörper
AKT4691, Cell Signaling Technology Inc." 1:1.000
Bcl2 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc. 1:1.000
Caspase 319677-1-AP, Proteintech Group, Inc. 1:2.000
gespaltene Caspase3ABS132005; Absin Bioscience Inc." 1:1.000
Cytc10993-1-AP; Die Proteintech-Gruppe 1:1.000
GAPDH 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc." 1:8.000
mTOR2983, Cell Signaling Technology Inc." 1:1.000
PI3K4292, Cell Signaling Technology Inc' 1:1.000
p-AKT 4060, Cell Signaling Technology Inc." 1:1.000
p-mTOR (Ser2448)#5536, Cell Signaling Technology Inc." 1:1.000
p-PI3K p85 Untereinheit17366, Cell Signaling Technology Inc." 1:1.000
SekundärantikörperGB23303, Servicebio' 1:2.000
Materialien6-Well-Platte
Corning, NPY
Alexa Fluor 555Beyotime
BCA Protein Assay-Kit Beyotime, China P0011
ChemiDoc XRS Imager-System BioRad
Enhanced Chemilumineszenz-Nachweiskit Servicebio, Inc., ChinaKat.-Nr. G2014
Fluoreszenzmikroskop Olympus Corporation, Tokio, Japan
Hifair II 1. Strang cDNA-Synthese Super Mix 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverses Mikroskop Olympus, Tokio, Japan;
Millicell Transwell-Einsätze Millipore, Bedford, MA, USA
Assay-Kit für das Potenzial der mitochondrialen Membran Beyotime, China
PMSF ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China#ST506
Quantitatives Echtzeit-PCR-Instrument Angewandte Biosysteme, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lyse Puffer Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol-ReagenzInvitrogen15596026
TRIzol-Reagenz Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro  plus 6,0   

Referenzen

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