Polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie zur markierungsfreien Amyloid-Strukturcharakterisierung

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird beschrieben, wie polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie angewendet werden kann, um die lokale Organisation in markierungsfreien Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu charakterisieren. Außerdem wird beschrieben, wie die Probe vorbereitet und gemessen, der erforderliche Aufbau zusammengestellt und die Daten analysiert werden, um Informationen über die lokale Organisation von Amyloidfibrillen zu erhalten.

Zusammenfassung

Im Vergleich zu ihrem Ein-Photonen-Gegenstück ist die Zwei-Photonen-Anregung für Bioimaging-Experimente von Vorteil, da sie eine geringere Phototoxizität, ein tieferes Eindringen in das Gewebe, einen effizienten Betrieb in dicht gepackten Systemen und eine reduzierte Winkelphotoselektion von Fluorophoren bietet. Die Einführung der Polarisationsanalyse in der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie (2PFM) ermöglicht somit eine präzisere Bestimmung der molekularen Organisation in einer Probe im Vergleich zu Standard-Bildgebungsverfahren, die auf linearen optischen Verfahren basieren. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf polarisationsempfindliches 2PFM (ps-2PFM) und seine Anwendung bei der Bestimmung der molekularen Ordnung in komplexen Biostrukturen-Amyloid-Sphäroliten. Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson werden häufig durch den Nachweis von Amyloid-Protein-Aggregaten diagnostiziert, die aufgrund eines gestörten Proteinfehlfaltungsprozesses gebildet werden. Die Erforschung ihrer Struktur führt zu einem besseren Verständnis ihres Entstehungsweges und folglich zur Entwicklung empfindlicherer diagnostischer Methoden. In dieser Arbeit wird das ps-2PFM vorgestellt, das für die Bestimmung der lokalen Fibrillenordnung in den bovinen Insulinsphäroliten und sphärischen amyloidogenen Proteinaggregaten geeignet ist. Darüber hinaus zeigen wir, dass die vorgeschlagene Technik die dreidimensionale Organisation von Fibrillen im Inneren des Sphäruliths auflösen kann.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten wurden zwar zahlreiche fluoreszenzmikroskopische Techniken für die Biobildgebung von Proteinen und ihren Aggregaten^entwickelt 1, aber nur wenige wurden verwendet, um ihre lokale Ordnung innerhalb der Probe aufzulösen ^2,3. Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie⁴ wurde verwendet, um die intrinsische strukturelle Heterogenität von Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu untersuchen. Darüber hinaus konnte die quantitative Bestimmung der lokalen Ordnung in komplexen und dicht gepackten Biostrukturen wie Sphäroliten mit polarisation....

Protokoll

1. Präparation der Objektträger mit ausgewachsenen Sphäroliten

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Alle Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser (18,2 MΩ·cm bei 25 °C) hergestellt, das aus dem Wasseraufbereitungssystem gewonnen wurde.

1. Inkubieren Sie die Amyloid-Sphärulite auf der Grundlage des von Krebs et al.¹⁶. beschriebenen Protokolls mit einigen Modifikationen, wie unten beschrieben.
   1. Wiegen Sie 10 mg Insulinpulver in einem 1,5-ml-Röhrchen.
   2. Lö....

Ergebnisse

Das vorgestellte Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung durch die Vorbereitung von Amyloid-Suprastrukturen für Tests mit ps-2PFM, den Aufbau des mikroskopischen Systems und die Messungen der richtigen Probe. Vor den endgültigen Messungen ist es jedoch wichtig, die APDs richtig auf eine isotrope Referenz auszurichten, was dazu führen sollte, dass auf beiden Detektoren ein symmetrisches Signal ähnlicher Form und Intensität gesammelt wird (Abbildung 4C). Selbst minimale Unterschied.......

Diskussion

Die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der lokalen Anordnung von Fibrillen innerhalb der Amyloid-Überstrukturen, das nur kleine Modifikationen des Standard-Multiphotonen-Aufbaus erfordert. Da sie mit nichtlinearen optischen Phänomenen arbeitet, können im Vergleich zu Methoden der einphotonenangeregten Fluoreszenzmikroskopie eine reduzierte Winkelphotoselektion und eine verbesserte axiale Auflösung erreicht werden. Darüber hinaus führt es zu einer geringeren Li.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Probenvorbereitung
Deckgläser, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX Eindeckmittel für die Histologie	Sigma-Aldrich	6522	Eindeckmittel
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen, 1,5 mL, Polypropylen	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer  C	Eppendorf		Wird für die Sphärolith-Inkubation
verwendet HLP 5UV Wasseraufbereitungssystem	Hydrolab		Quelle von dionisiertem Wasser, das bei der Probenvorbereitung verwendet
wird Salzsäure (≥ 37%, APHA &e; 10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulinpulver aus der Bauchspeicheldrüse des Rindes (≥ 25 Einheiten/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	270474
Objektträger mit einem konkaven, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Polarisiertes optisches Mikroskop von	Olympus
PTFE-Gewindedichtungsband, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 g2	Chemland	VIT131097
Mikroskop ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Kohärentes
FELH0800 - Ø 25,0 mm Langpassfilter	Thorlabs
FESH0700 - Ø 25,0 mm Kurzpassfilter	Thorlabs
IDQ100 photonenzählende Avalanche-Photodioden	ID Quantique
Multiphoton Kurzpass-Emissionsfilter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
Piezo 3D Tisch	Piezosystem Jena
Polarisationsstrahlteiler	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib-Bibliothek			Version 3.3.2
NumPy-Bibliothek			Version 1.19.2
SciPy-Bibliothek			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5