Polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie zur markierungsfreien Amyloid-Strukturcharakterisierung

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird beschrieben, wie polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie angewendet werden kann, um die lokale Organisation in markierungsfreien Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu charakterisieren. Außerdem wird beschrieben, wie die Probe vorbereitet und gemessen, der erforderliche Aufbau zusammengestellt und die Daten analysiert werden, um Informationen über die lokale Organisation von Amyloidfibrillen zu erhalten.

Zusammenfassung

Im Vergleich zu ihrem Ein-Photonen-Gegenstück ist die Zwei-Photonen-Anregung für Bioimaging-Experimente von Vorteil, da sie eine geringere Phototoxizität, ein tieferes Eindringen in das Gewebe, einen effizienten Betrieb in dicht gepackten Systemen und eine reduzierte Winkelphotoselektion von Fluorophoren bietet. Die Einführung der Polarisationsanalyse in der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie (2PFM) ermöglicht somit eine präzisere Bestimmung der molekularen Organisation in einer Probe im Vergleich zu Standard-Bildgebungsverfahren, die auf linearen optischen Verfahren basieren. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf polarisationsempfindliches 2PFM (ps-2PFM) und seine Anwendung bei der Bestimmung der molekularen Ordnung in komplexen Biostrukturen-Amyloid-Sphäroliten. Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson werden häufig durch den Nachweis von Amyloid-Protein-Aggregaten diagnostiziert, die aufgrund eines gestörten Proteinfehlfaltungsprozesses gebildet werden. Die Erforschung ihrer Struktur führt zu einem besseren Verständnis ihres Entstehungsweges und folglich zur Entwicklung empfindlicherer diagnostischer Methoden. In dieser Arbeit wird das ps-2PFM vorgestellt, das für die Bestimmung der lokalen Fibrillenordnung in den bovinen Insulinsphäroliten und sphärischen amyloidogenen Proteinaggregaten geeignet ist. Darüber hinaus zeigen wir, dass die vorgeschlagene Technik die dreidimensionale Organisation von Fibrillen im Inneren des Sphäruliths auflösen kann.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten wurden zwar zahlreiche fluoreszenzmikroskopische Techniken für die Biobildgebung von Proteinen und ihren Aggregaten^entwickelt 1, aber nur wenige wurden verwendet, um ihre lokale Ordnung innerhalb der Probe aufzulösen ^2,3. Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie⁴ wurde verwendet, um die intrinsische strukturelle Heterogenität von Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu untersuchen. Darüber hinaus konnte die quantitative Bestimmung der lokalen Ordnung in komplexen und dicht gepackten Biostrukturen wie Sphäroliten mit polarisationssensitiven Methoden^{aufgelöst werden 3}. Standard-Fluoreszenztechniken mit oberflächlicher Gewebepenetration sind jedoch begrenzt, da die Verwendung von UV-VIS-Wellenlängen zur Anregung von Fluorophoren in vivo zu einer hohen Gewebelichtstreuung führt⁵. Darüber hinaus erfordert eine solche Bildgebung häufig die Entwicklung und Bindung spezifischer Fluoreszenzsonden an ein Zielbiomolekül, wodurch die Kosten und der Arbeitsaufwand für die Durchführung der Bildgebung erhöht werden.

Um diese Probleme anzugehen, hat unser Team kürzlich die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (ps-2PFM) für die markierungsfreie Abbildung biologischer Strukturen angepasst ^6,7. Ps-2PFM ermöglicht die Messung der Abhängigkeit der Zwei-Photonen-Fluoreszenzintensität von der Richtung der linearen Polarisation des Anregungsstrahls und die Analyse der Polarisation der emittierten Fluoreszenz⁸. Die Implementierung dieser Technik erfordert die Ergänzung des Standard-Multiphotonenmikroskop-Anregungspfads (Abbildung 1) um eine Halbwellenplatte zur Steuerung der Lichtpolarisationsebene. Dann werden Polargraphen, die die Abhängigkeit der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzintensität von der Polarisation des Anregungslaserstrahls darstellen, aus Signalen erstellt, die von zwei Avalanche-Photodioden gesammelt werden, und so die beiden zueinander senkrechten Komponenten der Fluoreszenzpolarisation sammeln.

Der letzte Schritt ist der Datenanalyseprozess, bei dem der Einfluss der optischen Elemente, wie z. B. dichroitische Spiegel oder ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur, auf die Polarisation berücksichtigt wird. Aufgrund der Beschaffenheit des Zwei-Photonen-Prozesses bietet diese Methode sowohl eine reduzierte Winkel-Photoselektion als auch eine verbesserte axiale Auflösung, da die Zwei-Photonen-Anregung von Fluorophoren außerhalb der Fokusebene probabilistisch begrenzt ist. Es konnte auch nachgewiesen werden, dass ähnliche Methoden erfolgreich für die In-vivo-Bildgebung von Nahinfrarot-Sonden (NIR) für die Tiefengewebebildgebung eingesetzt werden können⁹. Ps-2PFM wurde zuvor zur Abbildung von Fluorophoren in Zellmembranen¹⁰ und DNA^11,12 sowie von Nicht-Standard-Fluoreszenzmarkern biologischer Systeme, wie z. B. Goldnanopartikeln¹³, eingesetzt. In all diesen Beispielen wurde die Information über die Organisation von Biomolekülen jedoch indirekt gewonnen und erforderte eine vordefinierte gegenseitige Orientierung zwischen einem Fluorophor und einem Biomolekül.

In einer unserer jüngsten Arbeiten haben wir gezeigt, dass ps-2PFM erfolgreich zur Bestimmung der lokalen Polarisation der Autofluoreszenz von Amyloid-Überstrukturen und der Fluoreszenz von Thioflavin T, einem Amyloid-spezifischen Farbstoff, der an Amyloidfibrillen in Sphäroliten gebunden ist, eingesetzt werden kann⁶. Darüber hinaus haben wir in einer anderen Studie bewiesen, dass ps-2PFM verwendet werden kann, um die Orientierung von Amyloidfibrillen in Amyloid-Sphäroliten in einem Submikrometer-Größenbereich zu detektieren, was durch Korrelation mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt wurde⁷. Das Erreichen dieses Ergebnisses war möglich dank i) der intrinsischen Autofluoreszenz von Sphärolith-Amyloiden, die mit einem oder zwei Photonen angeregt werden, eine intrinsische Autofluoreszenz mit Emissionsmaxima in einem Bereich von 450 bis 500 nm und Zwei-Photonen-Absorptionsquerschnitten aufweisen, die mit Standard-Fluoreszenzfarbstoffen vergleichbar sind¹⁴, ii) mathematische Modelle, die zuvor eingeführt wurden, um zu beschreiben, wie ps-2PEF von Farbstoffen, die biologische Membranen und DNA-Strukturen markieren, angewendet werden könnte Fluoreszenz von Sphäroliten und an sie gebundenen Farbstoffen ^8,11,15. Bevor wir mit der Analyse fortfahren, empfehlen wir daher dringend, die erforderliche Theorie durchzusehen, die sowohl im Haupttext als auch in den unterstützenden Informationen unseres ersten Artikels zu diesem Thema^{beschrieben ist 6}. In dieser Arbeit stellen wir das Protokoll zur Anwendung der ps-2PFM-Technik für eine markierungsfreie Amyloid-Strukturcharakterisierung von bovinen Insulinsphäroliten vor.

Protokoll

1. Präparation der Objektträger mit ausgewachsenen Sphäroliten

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Alle Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser (18,2 MΩ·cm bei 25 °C) hergestellt, das aus dem Wasseraufbereitungssystem gewonnen wurde.

1. Inkubieren Sie die Amyloid-Sphärulite auf der Grundlage des von Krebs et al.¹⁶. beschriebenen Protokolls mit einigen Modifikationen, wie unten beschrieben.
   1. Wiegen Sie 10 mg Insulinpulver in einem 1,5-ml-Röhrchen.
   2. Lösen Sie das Pulver mit einem 1 ml Aliquot der deionisierten_H2O/HCl-Lösung (pH 1,5) auf.
   3. Versiegeln Sie die Probe mit dem Klebeband und geben Sie sie in einen thermischen Mischer, um sie 24 Stunden lang bei 70 °C (0 U/min) zu inkubieren.
      ANMERKUNG: Um die Bildgebung von Amyloiden in ihrer nativen (d. h. hydratisierten) Umgebung durchzuführen und eine Verformung der Probe aufgrund von Dehydrierung zu verhindern, ist es erforderlich, Objektträger gemäß der folgenden Beschreibung vorzubereiten (Schema in Abbildung 2).
2. Waschen Sie den Objektträger gründlich mit Wasser.
3. Tauchen Sie die Objektträger in Methanol und lassen Sie sie unter Umgebungsbedingungen auf einem staubfreien Tuch trocknen.
4. Entnehmen Sie mit einer automatischen Pipette (Schritt 1.1.2) ein 100-μl-Aliquot der Sphärolithlösung aus dem Röhrchen und geben Sie es in die Vertiefung im mittleren Bereich des Objektträgers.
5. Decken Sie die Lösung mit einem Deckglas ab, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
6. Geben Sie das Eindeckmittel mit einer automatischen Pipette entlang der Ränder des Deckglases auf den Objektträger, um die native Lösung der Sphärolithen zu versiegeln.
   HINWEIS: Es ist von großer Bedeutung, Objektträgereindeckmasse sowohl auf dem Deckglas als auch auf der Objektträgeroberfläche zu deponieren. Tun Sie dies unter der Abzugshaube wegen der Toxizität des flüchtigen Lösungsmittels (Xylol). Siehe Einschub in Abbildung 2.
7. Lassen Sie die Mikroskopprobe unter Umgebungsbedingungen, damit das Eindeckmittel aushärten kann.
   HINWEIS: Der Aushärtungsprozess ist temperatur- und feuchtigkeitsabhängig, sollte aber innerhalb von 12 h abgeschlossen sein.
8. Überprüfen Sie, ob Insulinsphärolite korrekt gebildet wurden, indem Sie ein polarisiertes optisches Mikroskop (POM) mit gekreuzten Polarisatoren verwenden. Durchsuchen Sie die Probe und suchen Sie nach einem charakteristischen Muster aus hellen Bereichen, das als Malteserkreuz bezeichnet wird, wie in Abbildung 3 dargestellt.
   ANMERKUNG: Die Amyloid-Sphärolite können als kugelförmige Überstrukturen definiert werden, die durch eine heterogene Morphologie mit einer Kern-Schale-Struktur gekennzeichnet sind. Im Detail bestehen sie aus einem amorphen Kern und radial wachsenden Amyloidfibrillen¹⁶. Aufgrund des anisotropen Charakters von Sphärolithstrukturen können sie deutlich mit polarisiertem Licht wechselwirken (z. B. durch Brechung) und ihre Phase ändern, was unter POM mit gekreuzten Polarisatoren leicht beobachtet werden kann. Diese Methode wurde verwendet, um nur voll entwickelte Sphärolite zu untersuchen, die durch ein modellähnliches Maltase-Kreuzmuster gekennzeichnet sind. Folglich wurden Aggregate oder strukturell verzerrte Sphärulite von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen.

2. Aufbau und Ausrichtung des Systems

HINWEIS: Eine schematische Darstellung eines polarisationsempfindlichen Zwei-Photonen-Mikroskops finden Sie in Abbildung 1.

1. Installieren Sie beispielsweise einen Femtosekundenlaser mit einer Abstimmbarkeit der Ausgangswellenlänge im Bereich von 690-1.080 nm, der mit einem modengekoppelten Ti:Saphir-Laser mit ~100 fs-Pulsen mit einer Wiederholrate von 80 MHz arbeitet.
2. Fügen Sie dem Anregungspfad des Aufbaus eine Halbwellenplatte hinzu, die auf einem Rotationstisch montiert ist, um die Polarisation des einfallenden Lichts in der Probenebene des XY-Mikroskops zu steuern.
3. Montieren Sie den dichroitischen Spiegel, um den Anregungsstrahl von der Detektionsoptik abzuschneiden.
   ANMERKUNG: Die optischen Eigenschaften eines dichroitischen Spiegels sollten es ermöglichen, den Anregungsstrahl (zur Probe) im NIR-Wellenlängenbereich zu reflektieren und gleichzeitig für den Wellenlängenbereich, der der Emission der Proben entspricht, transparent zu sein.
4. Installieren Sie einen piezoelektrischen Scantisch für Rasterscans innerhalb der XY-Ebene für ein ausgewähltes Z.
5. Montieren Sie das Immersionsobjektiv mit hoher NA, z. B. ein apochromatisches Ölimmersionsobjektiv 100x/1,4 NA.
   HINWEIS: Da der gesamte Aufbau in einem Epi-Fluoreszenz-Modus arbeitet, passieren die einfallenden und emittierten Signale dasselbe Objektiv.
6. Fügen Sie im Emissionspfad einen polarisierenden Strahlteiler hinzu, der die mit zwei Photonen angeregte Emission in zwei orthogonal polarisierte Komponenten (I_{, X} und I_{, Y}) aufteilt
7. Installieren Sie zwei photonenzählende Avalanche-Photodioden (APDs) in einer Konfiguration, die es ihnen ermöglicht, das übertragene bzw. reflektierte Licht mit dem Strahlteiler zu sammeln (Abbildung 1).
8. Montieren Sie korrekte wellenlängenabhängige Sperrfilter auf dem Anregungs- und Emissionspfad des Systems, z. B. einen 800-nm-Langpassfilter direkt im Anregungsstrahlengang und einen 700-Kurzpassfilter im Emissionspfad.
   HINWEIS: Analysieren Sie die Emissionsspektren von Sphärolith, so dass ein potenzieller Beitrag von Second Harmonic Generation (SHG) oder Laserlicht mit den richtigen Emissionsfiltern ausgeschlossen werden kann. Es ist auch erwähnenswert, dass dieses System auch Messungen von polarisationsempfindlichem SHG ermöglichen sollte, mit dem die Reihenfolge der Biomoleküle in den Proben aufgelöst werden könnte. Die Datenanalyse des SHG-Signals unterscheidet sich jedoch von der Fluoreszenz, die von Aït-Belkacem et ^al.17 genauer beschrieben wurde.
9. Richten Sie das gesamte System aus (mit dem in vielen Lasern eingebauten Ausrichtungsmodus), bis mit beiden Fotodioden ähnliche Signalintensitäten erfasst werden.
10. Prüfen Sie, ob der Anregungsstrahl, der durch das Objektiv mit hoher NA fokussiert und auf einer Kamera abgebildet wird, eine konzentrische Kreisform aufweist, wie in Abbildung 4A dargestellt.
11. Passen Sie die Scanzeit und die entsprechende Leistung an, um die durch den einfallenden Laser verursachten Schäden an der Probe zu minimieren. Ein beispielhaftes punktförmiges Brennen ist in Abbildung 4B dargestellt. Messen Sie die Nennleistung mit einem digitalen Handleistungsmesser, der an einen Fotodioden-Leistungssensor angeschlossen ist, der sich am Eingang des Mikroskopgehäuses befindet.
    HINWEIS: Biologische Proben können aufgrund der Laserbeleuchtung leicht verbrannt werden. In diesem Fall erwies sich der Leistungsbereich von 100 bis 900 μW (im Brennpunkt der Objektivscheibe) als hervorragender Kompromiss zwischen Probenstabilität und intensiver Emission.
12. Vor der Probenmessung ist die Qualität der Ausrichtung der Optik mit einer isotropen Referenzprobe (z. B. Fluorescein, das im amorphen Polymer enthalten ist) zu testen. Um die Kalibrierungsprüfung durchzuführen, befolgen Sie das in Abschnitt 3 beschriebene Verfahren mit einer isotropen Referenz anstelle einer Amyloidprobe.
    ANMERKUNG: Unter der Annahme, dass der Mikroskopieaufbau ideal auf die Probe mit isotropen Eigenschaften abgestimmt ist, sollten beide mit zwei APDs detektierten 2P-Emissionskomponenten (I_X und I_Y) mit der gleichen Intensität charakterisiert werden (Abbildung 4C).

3. Messung der bovinen Insulinsphärolite

HINWEIS: Um alle beschriebenen ps-2PF-Messungen durchzuführen, wurde eine handgeschriebene Software verwendet, die die Positionen des piezoelektrischen Tisches und der Halbwellenplatte steuert und das Signal von beiden Fotodioden sammelt, was das Plotten der XY-Scans (Rasterscans) aus ausgewählten Bereichen auf Objektträgern sowie Polardiagramme aus bestimmten Probenkoordinaten ermöglicht. Das Protokoll wurde auch um zusätzliche Hinweise erweitert, die es dem Benutzer ermöglichen, die Messung ohne dieses Protokoll durchzuführen, da sowohl der Piezotisch als auch der Rotationstisch, der zum Drehen der Halbwellenplatte verwendet wird, mit eigenen Controllern oder entsprechender Software gesteuert werden können. Dennoch wird dringend empfohlen, einen Algorithmus zu schreiben, der den Drehwinkel einer Halbwellenplatte mit der 2PEF-Intensität kombiniert, die mit beiden Photodioden gesammelt wurde, da diese Korrelation (polare Graphen) entscheidend für eine korrekte Datenanalyse ist, die zu strukturellen Informationen führt.

1. Montieren Sie die Probe mit den Sphäruliten auf dem piezoelektrischen Tisch (fixieren Sie den Objektträger mit Klebeband). Achten Sie darauf, dass Sie es so montieren, dass eine dünne Glasseite (Deckglas) dem Objektiv zugewandt ist, da sich hohe numerische Objektive durch relativ kurze Arbeitsabstände auszeichnen.
   HINWEIS: Da die Ölimmersion verwendet wird, sollte ein kleiner Tropfen Mineralöl auf das Objektiv aufgetragen werden, bevor die Probe montiert und fokussiert wird.
2. Durch Ändern der XY- und Z-Positionen mit Hilfe von Mikroskopknöpfen fokussieren Sie das Objektiv auf einen der Sphärolite, die sich in der Lösung befinden, aber beachten Sie, dass Sphärolithdurchmesser in der Regel im Bereich von zehn μm liegen und innerhalb des zentralen Bereichs der gesamten Struktur fokussiert werden sollten. Achten Sie auf schwarze und weiße Halos um den spezifischen Sphärulit als Anzeichen für einen Unter- bzw. Oberfokus. Passen Sie die "Z"-Achse so an, dass sie zwischen diesen Extremen liegt.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine isolierte Probe ohne strukturelle Defekte zu finden. Extrem kleine Sphärolite können aufgrund der Materialspannung, die durch das Objektiv entsteht, abdriften, während die größten Strukturen wahrscheinlich aggregiert oder stark verzerrt sind.
3. Zentrieren Sie den Sphärulit im Sichtfeld der beobachteten mikroskopischen Ebene und bestimmen Sie die Größe des XY-Scans, indem Sie sich ansehen, wie viele Piezotischschritte in X- und Y-Richtung (angezeigt auf dem Piezotisch-Controller oder in seiner Software) erforderlich sind, um die Fläche der gesamten Struktur abzudecken.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, das System so einzustellen, dass sich der Beginn des XY-Scans in der Nähe einer der Ecken des Sphäroliths befindet und mit der Nullposition des Tisches übereinstimmt (X und Y = 0)
4. Passen Sie die folgenden Scanparameter an:
   1. Stellen Sie die Polarisation des Anregungsstrahls ein, und drehen Sie die Halbwellenplatte, um die Polarisation zu erhalten, die der "X"- und "Y"-Achse der Mikroskop-Probenebene entspricht.
      HINWEIS: Dies kann durch Messung der Polarkurven von isotropem fluoreszierendem Medium wie Fluorescein erfolgen. Bei solchen Materialien verläuft die maximale Fluoreszenzintensität parallel zur Polarisation des Anregungsstrahls; Daher wird durch Drehen der Halbwellenplatte die Polarisation mit der X- und Y-Achse auf der Beobachtungsebene eingestellt, die auf polaren Graphen auch als X- und Y-Achse bezeichnet wird, wie in Abbildung 4C. Vollständige Polarkurven konnten gemessen werden, indem die gemessene 2PEF-Intensität an beiden Photodioden für eine 180°-Drehung der Halbwellenplatte (360°-Drehung der Anregungslichtpolarisation) gesammelt und die Intensität mit dem Polarisationswinkel des Anregungslichts korreliert wurde. Dies kann manuell erfolgen, indem die Emissionsintensität für jeden Halbwellenplattenwinkel separat gemessen und dann in einer Datenanalysesoftware oder automatisch mit spezieller oder selbst geschriebener Software zu einem Polardiagramm zusammengesetzt wird.
   2. Passen Sie die Parameter des Piezotisches an: Scangeschwindigkeit, Schritt und Bereich, um den Bereich des gesamten Sphäruliths abzudecken.
      HINWEIS: Der Scanbereich muss größer als der Sphärolithdurchmesser sein, um den gesamten Überbau innerhalb des Rasterscans vollständig einzurahmen. Niedrige Scangeschwindigkeit und -schritt ermöglichen es dem Benutzer, qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Dies kann jedoch dazu führen, dass die Probe verbrannt wird. Daher ist ein Kompromiss in Abhängigkeit von der Sphärolithgröße erforderlich. Diese Parameter können nicht universell angewendet werden. Beispielhafte Parameter in Abbildung 5A: Scanbereich 45 x 45 μm, Scanschritt 1 μm und Scangeschwindigkeit 2 μm/s.
5. Öffnen Sie den Verschluss, schalten Sie die Fotodioden ein und sammeln Sie 2P-Emissionskomponenten für jeden einzelnen Schritt des ausgewählten Scanbereichs - für den Anregungsstrahl, der entsprechend der X- und dann der Y-Achse polarisiert. Beispielhafte Zwei-Photonen-angeregte Autofluoreszenz (2PAF)-Rasterscans von Insulinsphäroliten sind in Abbildung 5A dargestellt.
   HINWEIS: Die Messung von Rasterscans erfordert die Korrelation von Piezo-Tischkoordinaten mit und erfassten Emissionskomponenten, was manuell erfolgen kann, indem die Intensität in jedem einzelnen Punkt des ausgewählten Bereichs gemessen und dann zu einer 2D-Matrix zusammengesetzt wird, oder automatisch über eine selbst geschriebene Software. Raster-Scans können als Summe der Intensität und der Intensität der Emissionskomponenten oder eindeutig für eine bestimmte Emissionskomponente dargestellt werden. Da sie stark strukturabhängig sind, sind strukturelle Verzerrungen innerhalb von Sphäroliten leicht sichtbar. Aufgrund der Bewegung des Mikroskoptisches können jedoch einige Proben aus dem Sichtfeld abweichen. Daher müssen Bilder auf Artefakte untersucht werden. Es ist notwendig, die Position des Sphäroliths vor und nach dem Scan zu überprüfen.
6. Um eine vollständige Polarisationsanalyse von der spezifischen Stelle der Probe aus durchzuführen, schalten Sie den Anregungsstrahl aus.
7. Anschließend werden spezifische Koordinaten des Piezotisches ausgewählt, die der gewählten Stelle auf dem Sphärolith entsprechen, an der die Informationen über die Ausrichtung der Moleküle mit einer Auflösung von weniger als einem μm benötigt werden.
8. Stellen Sie den piezoelektrischen Tisch so ein, dass das Sichtfeld auf dem angezeigten (X, Y) zentriert ist.
9. Schalten Sie den Anregungsstrahl ein und führen Sie eine vollständige Polarisationsanalyse (360°) der Emission durch , indem Sie die Drehung der Halbwellenplatte (180°-Drehung) aktivieren. Die Komponenten 2PF Ix und Iy werden in Form eines polaren Diagramms dargestellt (wie in Abbildung 5B dargestellt).
   Hinweis: Dieser Schritt kann an verschiedenen Stellen in der Stichprobe wiederholt werden, um eine ausreichende Datenmenge zu erfassen.

4. Bestimmung der lokalen Fibrillenordnung in den bovinen Insulinsphäroliten

HINWEIS: Alle numerischen Berechnungen, die mit der Datenanalyse verbunden sind, wurden mit der Programmiersprache Python durchgeführt und basieren auf den Funktionen, die in den Bibliotheken NumPy und SciPy verfügbar sind. Zum Plotten der Daten ist die Matplotlib-Bibliothek erforderlich. Alle Berechnungen basieren auf Formeln, die in einer der Arbeiten von Obstarczyk et ^al.6 in unterstützenden Informationen dargestellt sind.

1. Simulieren der Intensität von Zwei-Photonen-Fluoreszenz, die für die spezifizierte Verteilung von Molekülen mit einer ausgewählten Richtung der einfallenden Lichtpolarisation angeregt wird (bezeichnet durch α)
   ANMERKUNG: Die vorgestellten Formeln basieren auf der Annahme paralleler Absorptions- und Emissionsdipolmomente eines Fluorophors. Für eine Diskussion anderer Fälle (z.B. unterschiedliche Richtungen der Absorptions- und Emissionsdipolmomente, Energietransfer zwischen den Fluorophoren) siehe die Arbeit von Le Floc'h et al.⁸.
   1. Finde die Parameter, die die Variation des elektrischen Feldes durch Polarisationsmischung und Depolarisationseffekte berücksichtigen, die durch den dichroitischen Spiegel verursacht werden, der in einem Aufbau montiert ist:
      1. γ stellt den Amplitudenfaktor zwischen dem Reflexionsvermögen und dem polarisierten Licht eines dichroitischen Spiegels dar.
      2. δ stellt die Phasenverschiebung (Elliptizität) zwischen polarisiertem und polarisiertem Licht dar.
         ANMERKUNG: Die korrekte Definition dieser beiden Parameter ist für eine erfolgreiche strukturelle Charakterisierung von entscheidender Bedeutung, da sie einen starken Einfluss auf die Form der gemessenen polaren Graphen^{haben 11,18}. Im Falle des vorgestellten Systems wurden beide Parameter durch ellipsometrische Messungen eines dichroitischen Spiegels bestimmt, der in einem System angelegt wurde.
   2. Berechnen Sie die einfallenden elektrischen Feldvektoren, die sich in der X- und Y-Achse jedes während der ps-TPFM-Messung gemessenen Winkels ausbreiten, unter Verwendung der Gleichungen (1-5).
      (1)
      (2)
      (3)
      (4)
      (5)
      HINWEIS Wenn die Intensität über die gesamten 360° mit Schritt 1° gemessen wird, berechnen Sie die elektrischen Feldvektoren für alle 360°. Alle Winkel sollten im Bogenmaß angegeben werden. ρ-Parameter ist mit der optischen Frequenz ω des simulierten elektrischen Feldes verbunden (ρ=ω·t) und verwendet integriert von 0 bis 2π während der Berechnung der einfallenden elektrischen Feldvektoren, die sich in der X- und Y-Achse ausbreiten, für jeden Winkel, den α während der ps-TPFM-Messung gemessen wird.
   3. Definieren Sie die Funktionen für Übergangsdipolmomente in Richtungen dreier Achsen eines kartesischen Systems nach den Gleichungen (6-8):
      (6)
      (7)
      (8)
      HINWEIS: φ ist der Ausrichtungswinkel der Längsachse der Amyloidfibrille im XY-Probenrahmen. θ- und φ-Winkel sind die polaren und azimutalen Winkel, die verwendet werden, um die Orientierung des Übergangsdipolmoments eines Fluorophors zu definieren.
   4. Verwenden Sie die in Schritt 4.1.3 definierten Funktionen. Funktionen für J_x (Φ,θ,φ) und J_Y(Φ,θ,φ) zu definieren, die den Beitrag der Englichtfokussierung mit Objektiv mit hoher numerischer Apertur zur Fluoreszenzpolarisationsdetektion in X- und Y-Richtung unter Verwendung der Gleichungen (9, 10) erklären.
      (9)
      (10)
      HINWEIS: Die Faktoren K₁, K₂ und K₃ beziehen sich auf das Mikroskopobjektiv, das während der ps-TPFM-Messung verwendet wird. In diesen Experimenten wurde ein apochromatisches Ölimmersionsobjektiv 100x/1,4 NA verwendet und die_K1-, K2_- und _K3-Faktoren betrugen 2,945, 0,069 bzw. 1,016.
   5. Definieren Sie eine Funktion für f(Ω), die eine molekulare Winkelverteilung ist, abhängig von der halben Apertur eines Fluorophorkegels Ψ, mit einer variablen Dicke ΔΨ; Gleichung (11) verwenden. Die grafische Darstellung aller drei Blickwinkel auf die Amyloidfibrille ist in Abbildung 6 dargestellt.
      (11)
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Exponenten schreiben - die Potenz von 2 wirkt auf das Funktionsargument, nicht auf die gesamte Funktion!
   6. Definieren Sie alle f_{WWIJKL-Faktoren} wie in den Gleichungen (12-21) gezeigt.
      (12)
      (13)
      (14)
      (15 Stück)
      (16)
      (17 Stück)
      (18 Stück)
      (19)
      (20)
      (21)
   7. Die Intensitäten der angeregten Zwei-Photonen-Fluoreszenz werden für jeden gemessenen Winkel (ähnlich wie in Nummer 4.1.2) unter Verwendung der Gleichungen (22, 23) berechnet.
      = (22)
      = (23)
   8. Überprüfen Sie anhand der folgenden Variablenwerte (in der Legende zu Abbildung 7), ob die Simulation ordnungsgemäß funktioniert, und vergleichen Sie die erhaltenen Ergebnisse mit Abbildung 7A-C.
      HINWEIS: Alle Grade sollten im Bogenmaß geschrieben werden.
2. Passen Sie die simulierten Intensitäten an die Intensität der Zwei-Photonen-angeregten Autofluoreszenz von bovinen Insulinsphäroliten an, die während ps-2PFM-Messungen gesammelt wurden.
   HINWEIS: Die Auflösung der Sphärolithstruktur auf der Grundlage von ps-2PFM-Messungen erfordert die Verwendung der im Protokoll geschriebenen Gleichungen, um die theoretische Intensität der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz zu simulieren und alle Parameter anzupassen, die mit der Ordnung des molekularen Fluorophors verbunden sind. Es erfordert mehrere Iterationen über die verschiedenen Werte von Φ, einem Winkel, der die Drehung der Fibrille in der XY-Mikroskopprobe beschreibt, und ΔΨ, Aberrationen der konischen Verteilung des Emissionsdipols Ψ aufgrund der molekularen Rotationen in Filamenten für festes Ψ , bis der höchstmögliche^{R2-Koeffizient} zwischen normalisierter Zwei-Photonen-angeregter Fluoreszenzsignalintensität, die während der Messung gesammelt wird, und normalisierten Intensitäten, die gemäß Schritt 4.1 des Protokolls.
   1. Bestimmen Sie den Ψ-Halbwinkel .
      HINWEIS: Für bovine Insulinsphärolite sollte sie gleich Ψ = 29°⁶ sein.
   2. Arbeitsablauf bei der Anprobe:
      1. Wählen Sie den Wert von Φ von 0° bis 180° (in Abbildung 8A und 8B Φ = 16° bzw. 127°).
      2. Wählen Sie den Wert von ΔΨ von 0° bis 90° (in Abbildung 8A, B, ΔΨ = 24° bzw. 1°).
      3. Berechnen Sie (Gleichung 22) und (Gleichung 23) für den gesamten gemessenen Bereich der θ-Winkel mit den gewählten Werten von Φ und ΔΨ.
      4. Vergleichen Sie die während der Simulationen berechneten Intensitäten (beide normiert auf den Maximalwert von
      5. Berechnen ) mit normierten Intensitäten von
      6. Berechnen und (beide normiert auf den Maximalwert von ) gemessen während der ps-2PFM-Messung.
         HINWEIS: In den vorgestellten Experimenten wurden die Pearson-Produkt-Moment-Korrelationskoeffizienten mit der Funktion "corrcoef" aus der NumPy-Python-Bibliothek berechnet.
   3. Wählen Sie am Ende die Werte von Φ und ΔΨ , die zu den höchsten Korrelationskoeffizienten und Konvergenz zwischen den simulierten Intensitäten und dem gemessenen Signal führen, ähnlich wie in Abbildung 8 gezeigt.

Ergebnisse

Das vorgestellte Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung durch die Vorbereitung von Amyloid-Suprastrukturen für Tests mit ps-2PFM, den Aufbau des mikroskopischen Systems und die Messungen der richtigen Probe. Vor den endgültigen Messungen ist es jedoch wichtig, die APDs richtig auf eine isotrope Referenz auszurichten, was dazu führen sollte, dass auf beiden Detektoren ein symmetrisches Signal ähnlicher Form und Intensität gesammelt wird (Abbildung 4C). Selbst minimale Unterschied...

Diskussion

Die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der lokalen Anordnung von Fibrillen innerhalb der Amyloid-Überstrukturen, das nur kleine Modifikationen des Standard-Multiphotonen-Aufbaus erfordert. Da sie mit nichtlinearen optischen Phänomenen arbeitet, können im Vergleich zu Methoden der einphotonenangeregten Fluoreszenzmikroskopie eine reduzierte Winkelphotoselektion und eine verbesserte axiale Auflösung erreicht werden. Darüber hinaus führt es zu einer geringeren Li...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Probenvorbereitung
Deckgläser, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX Eindeckmittel für die Histologie	Sigma-Aldrich	6522	Eindeckmittel
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen, 1,5 mL, Polypropylen	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer  C	Eppendorf		Wird für die Sphärolith-Inkubation
verwendet HLP 5UV Wasseraufbereitungssystem	Hydrolab		Quelle von dionisiertem Wasser, das bei der Probenvorbereitung verwendet
wird Salzsäure (≥ 37%, APHA &e; 10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulinpulver aus der Bauchspeicheldrüse des Rindes (≥ 25 Einheiten/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC-Qualität)	Sigma-Aldrich	270474
Objektträger mit einem konkaven, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Polarisiertes optisches Mikroskop von	Olympus
PTFE-Gewindedichtungsband, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 g2	Chemland	VIT131097
Mikroskop ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Kohärentes
FELH0800 - Ø 25,0 mm Langpassfilter	Thorlabs
FESH0700 - Ø 25,0 mm Kurzpassfilter	Thorlabs
IDQ100 photonenzählende Avalanche-Photodioden	ID Quantique
Multiphoton Kurzpass-Emissionsfilter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
Piezo 3D Tisch	Piezosystem Jena
Polarisationsstrahlteiler	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib-Bibliothek			Version 3.3.2
NumPy-Bibliothek			Version 1.19.2
SciPy-Bibliothek			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5