Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für ein automatisiertes Zellkultursystem vor. Dieses automatisierte Kultursystem reduziert den Arbeitsaufwand und kommt den Anwendern zugute, einschließlich Forschern, die mit dem Umgang mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) nicht vertraut sind, von der Wartung von iPS-Zellen bis hin zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen.

Zusammenfassung

Es wird erwartet, dass humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) mit unendlicher Selbstproliferationsfähigkeit in zahlreichen Bereichen Anwendung finden, darunter die Aufklärung seltener Krankheiten, die Entwicklung neuer Medikamente und die regenerative Medizin zur Wiederherstellung geschädigter Organe. Trotzdem ist die gesellschaftliche Umsetzung von hiPSCs noch begrenzt. Dies liegt zum Teil daran, dass es schwierig ist, die Differenzierung in der Kultur zu reproduzieren, selbst mit fortgeschrittenem Wissen und ausgefeilten technischen Fähigkeiten, was auf die hohe Empfindlichkeit von iPS-Zellen gegenüber winzigen Umweltveränderungen zurückzuführen ist. Die Anwendung eines automatisierten Kultursystems kann dieses Problem lösen. Experimente mit hoher Reproduzierbarkeit, unabhängig von den Fähigkeiten eines Forschers, können nach einem gemeinsamen Verfahren über verschiedene Institute hinweg erwartet werden. Obwohl bereits mehrere automatisierte Kultursysteme entwickelt wurden, die iPSC-Kulturen aufrechterhalten und eine Differenzierung induzieren können, sind diese Systeme schwer, groß und kostspielig, da sie humanisierte, mehrgliedrige Roboterarme verwenden. Um die oben genannten Probleme zu verbessern, haben wir ein neues System entwickelt, das ein einfaches G-Y-Z-Achsen-Gleitschienensystem verwendet, das es kompakter, leichter und kostengünstiger macht. Darüber hinaus kann der Benutzer Parameter im neuen System einfach ändern, um neue Handhabungsaufgaben zu entwickeln. Sobald eine Aufgabe eingerichtet ist, muss der Benutzer nur noch den iPSC vorbereiten, die für die gewünschte Aufgabe benötigten Reagenzien und Verbrauchsmaterialien im Voraus bereitstellen, die Aufgabennummer auswählen und die Uhrzeit angeben. Wir bestätigten, dass das System iPS-Zellen über mehrere Passagen ohne Feederzellen in einem undifferenzierten Zustand halten und sich in verschiedene Zelltypen differenzieren kann, darunter Kardiomyozyten, Hepatozyten, neurale Vorläuferzellen und Keratinozyten. Das System wird hochgradig reproduzierbare Experimente zwischen Institutionen ermöglichen, ohne dass qualifizierte Forscher erforderlich sind, und es wird die soziale Implementierung von hiPSCs in einem breiteren Spektrum von Forschungsfeldern erleichtern, indem es die Hindernisse für neue Markteintritte verringert.

Einleitung

Dieser Artikel zielt darauf ab, aktuelle und detaillierte Handhabungsverfahren für ein automatisiertes Kultursystem für humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC), das wir in Zusammenarbeit mit einem Unternehmen hergestellt haben, vorzustellen und repräsentative Ergebnisse zu zeigen.

Seit der Veröffentlichung des Artikels im Jahr 2007 erregt iPSC weltweit Aufmerksamkeit¹. Aufgrund seiner größten Eigenschaft, sich in jede Art von Körperzellen differenzieren zu können, wird erwartet, dass es in verschiedenen Bereichen wie der regenerativen Medizin, der Aufklärung der Ursachen hartnäckiger Krankheiten und der Entwicklung neuer therapeutischer Medikamente eingesetzt wird ^2,3. Darüber hinaus könnte die Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten somatischen Zellen Tierversuche reduzieren, die erheblichen ethischen Einschränkungen unterliegen. Obwohl ständig zahlreiche homogene iPS-Zellen benötigt werden, um neue Methoden mit iPS-Zellen zu erforschen, ist es zu aufwendig, diese zu verwalten. Darüber hinaus ist die Handhabung von iPSC aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, selbst gegenüber subtilen kulturellen und umweltbedingten Veränderungen, schwierig.

Um dieses Problem zu lösen, wird erwartet, dass automatisierte Kultursysteme anstelle von Menschen Aufgaben übernehmen. Einige Gruppen haben einige automatisierte humane pluripotente Stammzellkultursysteme für die Zellerhaltung und -differenzierung entwickelt und ihre Ergebnisse veröffentlicht ^4,5,6. Diese Systeme sind mit mehrgelenkigen Roboterarmen ausgestattet. Roboterarme haben nicht nur den Vorteil, dass sie die Bewegungen des menschlichen Arms in hohem Maße nachahmen, sondern auch den Vorteil, dass sie höhere Kosten für die Arme, eine größere und schwerere Systemverpackung und zeitaufwändige Schulungsanstrengungen durch die Ingenieure erfordern, um die gezielten Bewegungen zu erhalten ^7,8. Um die Einführung des Apparats in mehr Forschungseinrichtungen an den Punkten des wirtschaftlichen, räumlichen und personellen Verbrauchs zu erleichtern, haben wir ein neuartiges automatisiertes Kultursystem für die Aufrechterhaltung und Differenzierung von iPSC in verschiedene Zelltypen entwickelt⁹.

Unsere Begründung für das neue System war die Verwendung eines X-Y-Z-Achsen-Schienensystems anstelle von Roboterarmen mit mehreren Gelenken⁹. Um die komplexen handähnlichen Funktionen von Roboterarmen zu ersetzen, haben wir eine neue Idee auf dieses System angewendet, das automatisch drei Arten von spezifischen funktionalen Armspitzen wechseln kann. Hier zeigen wir auch, wie Benutzer Aufgabenpläne mit einfachen Aufträgen in der Software erstellen können, da während des gesamten Prozesses keine Anforderungen an die Beiträge der Ingenieure gestellt werden müssen.

Eines der Roboterkultursysteme hat die Herstellung von Embryoidkörpern unter Verwendung von 96-Well-Platten als 3D-Zellaggregate zur Differenzierung demonstriert⁴. Das hier beschriebene System kann keine 96-Well-Platten verarbeiten. Eine davon erreichte die derzeitige Qualität der guten Herstellungspraxis (cGMP) unter Verwendung einer Zelllinie, obwohl es sich nicht um eine humane pluripotente Stammzelle handelte⁵. Das hier beschriebene automatisierte Kultursystem wurde nun speziell mit dem Ziel entwickelt, Laborexperimente zu unterstützen (Abbildung 1). Es verfügt jedoch über genügend Systeme, um saubere Werte zu halten, die einer Sicherheitswerkbank der Stufe IV entsprechen.

Protokoll

Die Ethikkommission der Kansai Medical University genehmigte die Generierung und Verwendung der gesunden iPS-Zellen aus Freiwilligen mit dem Namen KMUR001 (Zulassung Nr. 2020197). Der Spender, der offen rekrutiert wurde, gab eine formelle Einverständniserklärung ab und stimmte der wissenschaftlichen Verwendung der Zellen zu.

HINWEIS: Die aktuelle Benutzeroberfläche (die spezielle Software mit dem Namen "ccssHMI", die unter dem Betriebssystem Windows XP läuft) ist der grundlegende Bedienbildschirm. Unter der oben genannten Schnittstelle sind eine Reihe von Registerkarten angeordnet, mit denen Benutzer verschiedene Vorgänge einleiten können.

1. Ladevorgänge

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf dem oberen Bildschirm der Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ladevorbereitung starten .
2. Stellen Sie die Schale(n) oder Platte(n), die in das Gerät eingegeben werden soll(en) in Position im Gerät ist/stellen.
   HINWEIS: Die notwendigen Informationen zur Identifizierung des Gerichts sollten auf jedem Deckel angegeben werden.
3. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste.
4. Wählen Sie in der Software die Art und Menge der Gerichte oder Teller aus.
5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ladevorbereitung abgeschlossen . Klicken Sie auf die Schaltfläche Ladestart .
6. Nachdem eine Schale in das System hochgeladen wurde, wählen Sie die Informationen auf der Schüssel, z. B. mit iPS-Zellen oder ohne iPS-Zellen, in der Software aus. Registrieren Sie Notizen zu jedem Gericht in der Software.
7. Klicken Sie am Ende auf die Schaltfläche Registrierung , um den Ladevorgang abzuschließen.

2. Entladevorgang

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Entladen auf dem oberen Bildschirm der Software. Wählen Sie die zu entfernende(n) Schüssel(n) in der Software aus.
2. Nachdem Sie das/die Gericht(e) ausgewählt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Start der Entladevorbereitung . Klicken Sie auf die Schaltfläche Entladestart .
3. Nachdem die Schale(n) vom Inkubator auf die Werkbank im System übertragen wurde(n), drücken Sie die Taste Dish Removal .
4. Öffnen Sie manuell das vordere Schiebefenster und nehmen Sie die Schale(n) heraus. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste.

3. Ergänzung von Verbrauchsmaterialien: Pipetten, Röhrchen und Medium

1. Um Verbrauchsmaterialien wie Pipetten, Röhrchen und Medium aufzufüllen, klicken Sie auf dem oberen Bildschirm der Software auf die Schaltfläche Verbrauchsmaterialien und wählen Sie dann den Artikel aus, der aufgefüllt werden soll.
   1. Pipetten
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Pipette . Wählen Sie die Schaltfläche Auffüllen aus .
      2. Wählen Sie in der Software ein Rack aus, das der Benutzer auffüllen möchte. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start auffüllen .
      3. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass der Deckel des Pipettenlagerbereichs auf der Werkbank geöffnet ist, öffnen Sie manuell das vordere Schiebefenster und füllen Sie die Pipetten nach Bedarf nach.
      4. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abgeschlossen auffüllen .
      5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auffüllung einrichten und geben Sie die Informationen für die Auffüllung ein, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Registrierung .
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abgeschlossen auffüllen .
   2. Rohre
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Tube . Wählen Sie die Schaltfläche Auffüllen aus .
      2. Wählen Sie in der Software ein Rack aus, das der Benutzer auffüllen möchte. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start auffüllen .
      3. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass das Gestell nach oben verschoben wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Röhrchen auffüllen .
      4. Öffnen Sie das vordere Schiebefenster manuell und füllen Sie die Rohre nach Bedarf auf.
      5. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste.
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abgeschlossen auffüllen .
      7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auffüllung einrichten und geben Sie die Informationen für die Auffüllung ein, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Registrierung . Klicken Sie auf die Schaltfläche Schließen .
   3. Mittel
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Mittel . Wählen Sie die Schaltfläche Auffüllen in der Software aus.
      2. Wählen Sie eines von drei Racks aus, die die Benutzer auffüllen möchten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start auffüllen .
      3. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass der Deckel des Medium-Lagerbereichs geöffnet wurde, öffnen Sie manuell das vordere Schiebefenster und füllen Sie das Medium nach.
      4. Schließen Sie das vordere Schiebefenster manuell und drücken Sie die mechanische Sicherheitsbestätigungstaste.
      5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abgeschlossen auffüllen .
      6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auffüllen und geben Sie die Informationen für das Medium ein, einschließlich des Namens und der Menge des Mediums. Geben Sie bei Bedarf zusätzliche Kommentare ein.
      7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Registrierung .
      8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Schließen .

4. Auswahl der Aufgabe

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Task auf dem oberen Bildschirm der Software.
2. Wählen Sie die Schaltfläche Aufgabeneinstellung aus. Wählen Sie die gewünschte Aufgabe aus der Aufgabenliste aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Nächster Schritt .
3. Geben Sie das Datum und die Uhrzeit zum Ausführen der Aufgabe an, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Registrierung . Wählen Sie ein Gericht oder einen Teller aus, um die Aufgabe auszuführen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Registrierung .
4. Nachdem Sie die ausgewählte Aufgabe erneut bestätigt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Registrierung . Vergewissern Sie sich, dass die Aufgabe auf dem nächsten Bildschirm registriert wurde.
5. Legen Sie bei Bedarf die nächste Aufgabe auf die gleiche Weise fest.
6. Klicken Sie am Ende auf die Schaltfläche Start . Dann wird die Aufgabe automatisch zum angegebenen Datum und zur angegebenen Uhrzeit gestartet.
   HINWEIS: Unmittelbar nach Beendigung jeder Aufgabe schalten sich die UV-Lampen (an zwei Seiten der Haube) automatisch ein und werden nach 5-30 Minuten gemäß der Zusatzeinstellung ausgeschaltet, um die Haube in aseptischem Zustand zu halten. Zum Beenden können Benutzer auf die Schaltfläche Start klicken.
7. Wenn Benutzer eine geplante Aufgabe im Voraus abbrechen möchten, klicken Sie auf die Schaltfläche Beenden .
8. Nachdem Sie die Aufgabe ausgewählt haben, die abgebrochen werden soll, klicken Sie auf die Schaltfläche Aufgabe bearbeiten .
9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufgabe abbrechen . Bestätigen Sie auf dem nächsten Bildschirm, dass die Aufgabe gelöscht wurde.

5. Überprüfen Sie die Zellenbilder

1. Jede Aufgabe beinhaltet mikroskopische Beobachtungen (Fotografieren) vor und nach der Aufgabenarbeit. Beobachten Sie den Fortschritt der Zellkultur fotografisch, indem Sie vor oder nach jeder Aufgabe eine mikroskopische Fotoaufgabe einbauen.
2. Wählen Sie voreingestellte Aufgabenprogramme aus, einschließlich der Auswahl mehrerer spezifischer Positionen der Schale oder der Well-Platte im Voraus für die Festpunktbeobachtung, um dieselbe Position im Laufe der Zeit zu überwachen.

6. Passage und Differenzierung

1. Befolgen Sie die Schritte in den Abschnitten 1-5 und stellen Sie das automatisierte Zellkultursystem so ein, dass es eine Passage und Differenzierung durchführt. Die Geräteeinstellungen für die Passage, die Kardiomyozytendifferenzierung, die Hepatozytendifferenzierung, die Differenzierung der neuralen Vorläuferzellen und die Keratinozytendifferenzierung sind in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4 bzw. Tabelle 5 dargestellt.

Ergebnisse

Erhaltung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen
Wir haben drei hPSC-Linien (RIKEN-2F, 253G1 und KMUR001) verwendet. Wir haben das Wartungsprotokoll durch täglich manuell durchgeführte Experimente optimiert und die detaillierten Programme durch die sieben Vorversuche, die das System durchführt, weiter optimiert. Zum Beispiel sind die Scherspannungen, die durch die Flüssigkeitsgeschwindigkeiten des Spießflusses von verschiedenen Pipetten verursacht werden, die von Menschen und dem System gehandhabt werden, sehr unterschiedlich. Daher haben wir die Zeitdauer des enzymatischen Aufschlusses und die Anzahl der Pipettierungen für die Zelldispersion durch das System optimiert.

Humane induzierte pluripotente Stammzellen wurden auf einer 10-cm-Schale gehalten, die mit einer 0,5 μg/cm2-Zellkulturmatrix mit hiPSC-Kulturmedium (z. B. Neutristem oder StemFit AK02N) beschichtet war. Für die Passage wurde das System so programmiert, dass es hiPSC dreimal mit 5 ml Phosphatpuffersalzlösung ohne Kalzium (PBS[-]) wäscht und dann mit 3 ml TrypLE-Express-Enzym, ergänzt mit 10 μM des Rho-Kinase-Inhibitors (Y-27632), 15 Minuten lang bei 37 °C behandelt. Danach gab das System 9 ml PBS(-) mit 0,15 % Rinderserumalbuminfraktion V (BSA) auf die Platte und führte zwei Bewegungssätze durch, die 10 ml zellhaltige Flüssigkeit ansaugten und die Flüssigkeit von der Pipettenspitze in einer Zick-Zack-Bewegung über die Oberseite der Platte abgaben, die um 20° näher an die Plattenoberfläche geneigt war. und wiederholte die obige Abfolge von Vorgängen, wobei die Platte um 20° auf der gegenüberliegenden Seite geneigt war. Dann sammelte das System das zellhaltige Medium in einem 15-ml-Röhrchen und verschloss es, woraufhin es 5 Minuten lang bei 115 x g zentrifugiert wurde, um die Zellen abzuscheiden. Danach saugte das System den Überstand an und dispergierte das Zellpellet in Einzelzellen unter Verwendung von 10 ml Kulturmedium mit 10 μM Y-27632 durch 10-maliges Pipettieren. Das System überführte 1 ml Trypanblaulösung in ein neues 15-ml-Röhrchen, fügte dann 1 ml der Zellsuspension hinzu und mischte sie durch fünfmaliges Pipettieren. Danach wurden 100 μl der mit Trypanblau gefärbten Zelllösung abgesaugt und in das Einlassfenster des Einweg-Hämozytometers im Halter abgegeben. Das System bewegte den Hämozytometerhalter in den mikroskopischen Beobachtungsbereich und nahm ein Foto auf, das sofort von der Software analysiert wurde, und die erhaltene Zellkonzentration wurde auf den nächsten Schritt angewendet. Für die iPSC-Aufrechterhaltung säte das System die Zellen mit einer Zelldichte von 15.000 Zellen/^cm2 in neue Kunststoffplatten mit einem Durchmesser von 10 cm, die mit einer Zellkulturmatrix von 0,5 μg/^cm2 beschichtet waren. Für Differenzierungsexperimente säte das System die Zellen mit der erforderlichen Zelldichte in das für jeden somatischen Zelltyp vorbereitete Medium in 6-Well-Platten, die mit einer auf 1/100 verdünnten Zellkulturmatrix beschichtet waren. Schließlich führte das System fünfmal eine Kreuzverriegelung durch, bevor die Platten in den Inkubator überführt wurden. Drei neue 10-cm-Platten mit iPS-Zellen und drei vorbeschichtete Zellkultur-Matrix-Platten wurden in das System geladen, und andere notwendige Elemente wurden ebenfalls gemäß den oben genannten Verfahren vorbereitet. Ein Zyklus der Erhaltungskultur besteht aus einer Passage-Aufgabe an Tag 1, gefolgt von einem Nährmedienwechsel einmal täglich für 3 Tage. Während des gesamten Experiments war dieser Zyklus auf fünf Zyklen ausgelegt. Darüber hinaus wurden wiederum Verbrauchsmaterialien aufgefüllt.

Gemäß dem vorgegebenen Zeitplan wurden fünf Zyklen der Wartungskultur wie vom System geplant erfolgreich durchgeführt. Anhand der Zellfotos, die bei jeder Aufgabe automatisch aufgenommen wurden, wurde bestätigt, dass sich die Zellen im Laufe der Zeit reibungslos vermehrten. Die Zellausdehnung (n = 3) wurde berechnet und in Abbildung 2 dargestellt. Um zu bestätigen, ob der undifferenzierte Zustand der iPS-Zellen auch nach der Erhaltungskultur im automatisierten Kultursystem unverändert bleibt, wurde eine immunzytototorische Analyse (Oct3/4 und SSEA4) mit den verbleibenden Proben bei jeder Passage durchgeführt (Abbildung 3A). Darüber hinaus wurden die drei Schalen nach fünf Zyklen aus dem System entladen und eine immunhistochemische Analyse (Oct3/4, SSEA4 und Tra1-81) durchgeführt (Abbildung 3B). Beide Analysen mittels fluoreszierender Immunfärbung zeigten, dass der undifferenzierte Zustand der iPS-Zellen erhalten blieb. Die Karyotypisierung von iPS-Zellen wurde auch vor und nach der Erhaltungskultur in einem automatisierten Kultursystem durchgeführt. Obwohl eine Anomalie in einem Allel des Chromosoms 17 vor Beginn der Erhaltungskultur beobachtet wurde, wurde nach 5 Erhaltungskulturen, einschließlich der Anomalie, keine besondere Veränderung vom System beobachtet (Abbildung 3C). Die Einstellungen, die für die Wartung von iPS-Zellen verwendet werden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Differenzierung
Kardiomyozyten
Das Differenzierungsprotokoll aus einer früheren Veröffentlichung wurde hier befolgt¹⁰. Das System säte undifferenzierte hiPSCs (KMUR001) mit einer Dichte von 30.000 Zellen/^cm2 auf Zellkulturmatrix-beschichteten 6-Well-Platten in hiPSC-Kulturmedium, das mit 10 μM Y-27632 ergänzt wurde. Das System wechselte das Medium nach 3 Tagen (Differenzierungstag 1) mit 6 μM des GSK-3ß-Inhibitors CHIR-99021, 20 ng/ml Activin A und 10 ng/ml BMP4 in humanes pluripotentes Stammzellmedium. Am 3. Tag der Differenzierung wechselte das System zu CDM3-Medium: RPMI 1640, 500 μg/ml rekombinantes humanes Albumin und 213 μg/ml L-Ascorbinsäure-2-phosphat mit 2 μM Wnt-C59. Am 5. Tag der Differenzierung wechselte das System zu frischem CDM3-Medium; Danach wechselte er wiederholt jeden zweiten Tag auf frisches CDM3-Medium. Die Einstellungen, die für die Kardiomyozytendifferenzierung von iPS-Zellen verwendet werden, sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Hepatozyten
Das Differenzierungsprotokoll aus einer früheren Veröffentlichung wurde hier befolgt¹¹. Das System säte undifferenzierte hiPSCs (RIKEN2F) mit einer Dichte von 25.000 Zellen/^cm2 auf Zellkulturmatrix-beschichteten 6-Well-Platten in hiPSC-Kulturmedium, das mit 10 μM Y-27632 ergänzt wurde. Nach 2 Tagen (Differenzierungstag 1) wechselte das System das Medium zu RPMI-1640 plus 2% B27 Minus Insulin (RPMI-B27) mit 100 ng/ml Activin A, 6 μM CHIR-99021 und 1% Glutaminpräparat (z. B. GlutaMAX) für 24 Stunden. Am 2. Tag der Differenzierung wechselten wir das Medium zu RPMI-B27 mit 50 ng/ml Activin A. Am 5. Tag der Differenzierung wechselte das System das Medium zu RPMI-B27, das 1 % Glutaminpräparat und 10 ng/ml BMP-4 enthielt. Am 9. Tag der Differenzierung wechselte das System das Medium zum Hepatozytenreifungsmedium: Leibovitz' L-15-Medium mit 8,3 % Tryptosephosphatbrühe, 10 μM Hydrocortison-21-Hemisuccinat, 50 μg/ml Natrium-L-Ascorbat, 100 nM Dexamethason, 0,58 % Insulintransferrin-Selen, 2 mM Glutaminpräparat, 8,3 % fötales Rinderserum und 100 nM rac-1,2-Dihexadecylglycerin. Danach wechselte das System das Medium wiederholt jeden zweiten Tag auf ein frisches Medium. Die Einstellungen, die für die Hepatozytendifferenzierung von iPS-Zellen verwendet werden, sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Neuronale Vorläuferzellen
Hier wurde das Differenzierungsprotokoll aus einer früheren Veröffentlichung befolgt¹². Das System säte undifferenzierte hiPSCs (RIKEN2F) mit einer Dichte von 25.000 Zellen/^cm2 auf Basalmembranmatrix-beschichteten 6-Well-Platten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12 und neurobasalem Medium (1:1), ergänzt mit 10 % Knockout-Serumersatz, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Glutamin-Supplement mit 10 μM TGF-beta-Rezeptor-Inhibitor (SB431542), 10 μM BMP-Signalinhibitor (Dorsomorphin), und 10 μM Y-27632 (Differenzierungstag 1). Am 5. Tag der Differenzierung wechselte das System das Medium zu DMEM/F12 und Neurobasalmedium 1:1, ergänzt mit 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Glutamin-Ergänzung, 1 % N-2-Ergänzung, 1 % B-27-Ergänzung, 50 μg/ml Ascorbinsäure-2-Phosphat, 10 μM SB431542 und 10 μM Dorsomorphin. Am 9. Tag der Differenzierung wechselte das System das Medium zu DMEM/F12 und neurobasalem Medium 1:1, ergänzt mit 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Glutamin-Ergänzung, 1 % N-2-Ergänzung, 1 % B-27-Ergänzung, 50 μg/ml Ascorbinsäure-2-Phosphat und 1 μM all-trans-Retinsäure. Am Differenzierungstag 13-16 wechselte das System das Medium täglich mit DMEM/F12 und neurobasalem Medium 1:1, ergänzt mit 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Glutamin-Supplement, 1% N-2-Supplement, 1% B-27-Supplement, 50 μg/mL Ascorbinsäure-2-Phosphat und 10 ng/mL bFGF und 10 ng/mL EGF. Die Einstellungen, die für die Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen von iPS-Zellen verwendet werden, sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Keratinozyten
Hier wurde das Differenzierungsprotokoll aus einer früheren Veröffentlichung befolgt¹³. Das System säte undifferenzierte hiPSCs (253G1) mit einer Dichte von 15.000 Zellen/^cm2 in Zellkulturmatrix-beschichteten 6-Well-Platten in hiPSC-Kulturmedium mit 10 μM Y-27632. Nach 2 Tagen später (Differenzierungstag 1) wechselte das System das Medium zu Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12 und Neurobasalmedium (1:1) mit 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Glutamin, 55 μM 2-Mercaptoethanol, 1 % N-2-Ergänzung, 2 % B-27-Ergänzung, 50 μg/ml Ascorbinsäure-2-phosphat, 0,05 % Rinderserumalbumin und 100 ng/ml FGF-basisch. Am Differenzierungstag 3 und danach wurde das Medium unter Zugabe von 0,5 μg/ml Hydrocortison, 1 μM all-trans-Retinsäure, 25 ng/ml hBMP-4, 2,4 μg/ml Adenin, 1,37 ng/ml Trijodthyronin, 0,3 mM Ascorbinsäure-2-phosphat, und 2 μM Forskolin, alle 2 Tage durch das System. Die Einstellungen, die für die Keratinozytendifferenzierung von iPS-Zellen verwendet werden, sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

Wie bereits erwähnt, wurde der gesamte Prozess ausschließlich mit automatisierten Kulturgeräten durchgeführt, von der Aussaat der iPS-Zellen bis hin zur anschließenden Reihe von Differenzierungsprotokollen. Die Ausprägung der charakteristischen Marker in jeder Zelle wurde ausgewertet (Abbildung 4). Es konnte gezeigt werden, dass die Differenzierung nur mit einem automatisierten Kultursystem induziert werden kann.

Abbildung 1: Zusammenfassung des automatisierten Kultursystems. (A) Bild der Anlage mit Größe und Layout-Skizze 1. (B) Bild der Werkbank und Layoutskizze 2. (C) Handwerkzeuge: Schale, Röhrchen und Pipette. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Bando et ^al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Passaging-Aufgabe und Zellwachstum. (A) Das Quadrat veranschaulicht jeden Prozess. (B) iPSC-Expansion, berechnet mit jeder automatisierten Zellzählung in den drei unabhängigen Experimenten. (C) Repräsentative Bilder, die automatisch von Passage zu Passage aufgenommen werden. Maßstabsbalken = 400 μm und 100 μm (Einschub). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Bando et ^al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Automatisierte Langzeitwartung von iPSC. (A) Alle immunzytometorischen Analysen der drei unabhängigen Experimente für Oct-3/4 und SSEA-4. Jedes blaue Histogramm zeigt an, dass keine primäre Antikörperkontrolle vorliegt. Jedes rote Histogramm stellt das angezeigte antigenspezifische Signal dar. (B) Repräsentative Bilder immunhistochemisch gefärbter Zellen für Oct-3/4, SSEA-4 und Tra 1-81. Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Karyotyp des RIKEN2F-iPSC nach dem fünften Durchgang. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Bando et ^al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Immunhistochemische Färbung. Immunhistochemische Bilder von Hepatozyten (Maßstabsbalken = 100 μm), Kardiomyozyten (Maßstabsbalken = 100 μm), neuronalen Vorläuferzellen (Maßstabsbalken = 100 μm) und Keratinozyten (Maßstabsbalken = 200 μm). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Bando et ^al.9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Passagenvorbereitungen und Systemeinstellungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Kardiomyozyten-Differenzierungspräparate und Systemeinstellungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Hepatozytendifferenzierungspräparate und Systemeinstellungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Vorbereitungen zur Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen und Systemeinstellungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Keratinozytendifferenzierungspräparate und Systemeinstellungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Ein wichtiger Schritt im Protokoll besteht darin, dass ein Benutzer, wenn er Fehler findet, jederzeit auf die Schaltfläche "Abbrechen", "Beenden" oder "Zurücksetzen" klicken und mit dem ersten Schritt beginnen kann. Die Software kann menschliche Fehler vermeiden, wie z. B. Doppelbuchungen, das Öffnen von Türen, während die Systemaufgaben aktiv sind, und mangelnden Nachschub. Ein weiterer kritischer Punkt für eine erfolgreiche und effiziente Differenzierung zur gewünschten somatischen Zelle ist die richtige Auswahl pluripotenter Stammzelllinien, da jede pluripotente Stammzelle eine unkontrollierbare Verzerrung ihrer Differenzierungseigenschaften aufweist^14,15.

Dieses automatisierte Kultursystem für induzierte pluripotente Stammzellen kann diese erhalten und in verschiedene somatische Zelltypen differenzieren. Die Größe dieses Systems beträgt 200 cm (Breite), 110 cm (Tiefe) und 233 cm (Höhe) bei einem Gesamtgewicht von 1,2 Tonnen. Der im Gerät eingebaute Inkubator kann gleichzeitig sechsunddreißig 10-cm-Schalen und neun Multiwell-Platten aufnehmen.

Verbesserungen gegenüber den Vorgängermodellen bestehen darin, dass zunächst das X-Y-Z-Achsen-Schienensystem als Handhabungsarm von einem 6-Achsen-Gelenkarm neu umgebaut wurde, bei dem das Spitzenwerkzeug des Arms auf drei verschiedene Teile für Schalen, Röhrchen und Pipetten umgestellt wird. Der Arm hängt an der Decke des Systems und bewegt sich entlang der X-Y-Z-Achse. Zweitens wurde ein Zellzählsystem für feederfreie Erhaltungskulturen und Differenzierungsinduktionsprotokolle eingeführt, die kontinuierlich von der Passage aus durchgeführt werden. Nach dem Mischen der Einzelzell-Suspensionslösung mit der Trypanblau-Lösung wurde sie zur mikroskopischen Beobachtung und Bildgebung in ein Einweg-Hämozytometer überführt. Die Software analysiert automatisch das erhaltene Bild, um die Anzahl der lebenden Zellen zu zählen und das Volumen zu berechnen, das erforderlich ist, um die erforderliche Anzahl von Zellen zu impfen. Die Genauigkeit der Zellzahl, die durch diese Bildanalyse erhalten wurde, stimmte mit der Genauigkeit überein, die manuell ermittelt wurde.

Das X-Y-Z-Achsen-Schienensystem wurde verwendet, um jede Aufgabe schneller zu erledigen als die Vorgängerversion (mehrachsiger Gelenkarm). Mit diesem automatisierten Kultursystem wurden fünf kontinuierliche Passagen über 16 Tage durchgeführt und die iPS-Zellen um das 625± 93-fache expandiert. Obwohl der Nachweis der Ausdauer für die Zeit der Zellerhaltung ohne Feederzellen kürzer war als unsere vorherige Demonstration mit Feederzellen, war die Zellexpansion im Vergleich zur vorherigen Demonstration⁶ effizienter. Die verkürzte Aufgabenzeit schien dazu beizutragen, dass Zellschäden während der Aufgaben nicht austrockneten.

Darüber hinaus wurden Differenzierungsaufgaben von der Erhaltungskultur bis hin zur Differenzierung in Kardiomyozyten, Hepatozyten, neuronale Vorläuferzellen und Keratinozyten ohne menschliches Eingreifen durchgeführt. Nach einer Reihe dieser Verläufe wurde durch Fluoreszenz-Immunfärbung bestätigt, dass sich die allein im automatisierten Kultursystem gewonnenen Zellen zu den gewünschten Zellen differenziert hatten. Daher können Forscher, die mit dem iPS-Zellmanagement nicht vertraut sind, durch die gemeinsame Nutzung eines Aufgabenprogramms und die Verwendung dieses Systems aus iPS-Zellen gewonnene somatische Zellen für ihre eigene Forschung gewinnen. Darüber hinaus könnten Unterschiede in der Reproduzierbarkeit zwischen Forschern oder Einrichtungen so weit wie möglich eliminiert werden, und es könnte sichergestellt werden, dass jedes Mal Zellen von homogener Qualität erhalten werden.

Durch die Einführung eines neuen Schienensystems konnte die Ausrüstung verkleinert und im Gewicht auf 1,2 Tonnen reduziert werden, ~200 kg leichter als zuvor. Darüber hinaus konnten die Kosten für Teile und Programmeinstellungen um ca. 10.000 US-Dollar gesenkt werden. Es wurde geschätzt, dass die Wartungs- und Programmierkosten um 13 % sinken würden. Um mehr Forschende zu motivieren, einfach in die iPS-Zellforschung einzusteigen, ist es auch wichtig, die Gerätekosten niedrig zu halten⁶. Wir hoffen, dass die aktuelle und die nächste Generation automatischer Kultursysteme dazu beitragen werden, iPS-Zellen und aus iPSCs gewonnene differenzierte Zellen von einheitlicherer Qualität bereitzustellen.

Die größten Einschränkungen dieses Systems sind die begrenzte Kapazität des Kühlschranks für die vorläufige Lagerung von Kulturen und seine Schwäche bei der Handhabung kleiner Mengen (<100 μl) Flüssigkeit. Darüber hinaus deaktiviert das Fehlen einer ausgefeilten künstlichen Intelligenz die automatische Optimierung entsprechend dem pünktlichen Zellzustand. Die kleine Einschränkung ist die Forderung nach speziellen Pipettenspitzen, die von den Systemherstellern zur Verfügung gestellt werden ^4,5. Wir entwickeln die nächste Generation von Kultursystemen, die in der Lage sein werden, kleine Flüssigkeitsmengen für mittlere Zubereitungen zu verarbeiten und ein Feedback-Optimierungssystem auf Basis leistungsstarker künstlicher Intelligenz (Systemlernen) enthalten. Unser kooperierender Hersteller⁹ verfügt über genügend Know-how, um maßgeschneiderte Systeme nach den speziellen Bedürfnissen der Anwender zu bauen. Darüber hinaus werden in Kürze Systeme der nächsten Generation auf den Markt kommen, die mit allgemeineren und breiteren Funktionen ausgestattet sind. Wir denken auch über ein abonnementbasiertes Mietsystem nach, um allen Nutzern aktuelle Systeme zur Verfügung zu stellen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,15 % Rinderserumalbuminfraktion V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1 % GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm Kunststoffplatten	Corning Inc., NY, Vereinigte Staaten	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  Maus	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenin	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  Kaninchen	Dako	A0001
All-trans Retinsäure	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automatisiertes Kultursystem	Panasonic
B-27 Ergänzung	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher	Scientific PHC9531
Rinderserumalbumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, Vereinigte Staaten #HY-10182	252917-06-9
Definiertes Keratinozyten-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Humanes Keratinozytenmedium
Dexamethason	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Kanada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Einweg-Hämozytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco' s modifizierte Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Grundnahrungsmittel 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Humanes pluripotentes Stammzellmedium
Fötales Rinderserum	Biowest, FL, Vereinigte Staaten	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.
Glutamin	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamin Supplement
Ziege IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  Ziege	Santacruz	6556
Hydrocortison	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortison 21-Hemisuccinat	Merck	H2882
iMatrix511 Seide	Nippi Inc., Tokio, Japan	892 021	Zellkulturmatrix
Insulin-Transferrin-Selen	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  Maus	Santacruz	376224
Keratin 10  Kaninchen	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patienten-abgeleitete iPSCs
Knockout-Serumersatz	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-Ascorbinsäure 2-phosphat	A8960, Merck	A8960
Leibovitz' s L-15 mittel	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.
Maus IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 Ergänzung	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin Maus	Santacruz	23927
Neurobasales Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  Kaninchen	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Gö ttingen, Deutschland	05-100-1A	Zellkulturmedium
Oct 3/4  Maus	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Kaninchen IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Kaninchen IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Rekombinantes humanes Albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Deutschland	A9731
Rho-Kinase-Inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokio, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferenzierte hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Natrium-L-Ascorbat	Merck	A4034-100G
SSEA-4  Maus	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokio, Japan	AK02	Zellkulturmedium
TnT Kaninchen	Abcam	ab92546
TRA 1-81 Maus	Millipore	MAB4381
Trijodthyronin	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM Express Enzym	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Vereinigte Staaten	12604013
Trypanblau-Lösung	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptosephosphat-Bouillon	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, Vereinigtes Königreich	5148
β   Tublin  Maus	Promega	G712A