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Methodenartikel

Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

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DOI:

10.3791/65703

⸱

21. Juli 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus, was die Untersuchung der perivaskulären Fettgewebsfunktion und ihrer Beziehung zu Gefäßzellen ermöglicht.

Zusammenfassung

Perivaskuläres Fettgewebe (PVAT) ist ein Fettgewebsdepot, das Blutgefäße umgibt und die Phänotypen weißer, beigefarbener und brauner Adipozyten aufweist. Neuere Entdeckungen haben die zentrale Rolle von PVAT bei der Regulierung der vaskulären Homöostase und der Beteiligung an der Pathogenese von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beleuchtet. Ein umfassendes Verständnis der Eigenschaften und Regulation von PVAT ist von großer Bedeutung für die Entwicklung zukünftiger Therapien. Primärkulturen von periaortalen Adipozyten sind wertvoll für die Untersuchung der PVAT-Funktion und der Interaktion zwischen periaortalen Adipozyten und Gefäßzellen. In dieser Arbeit wird ein wirtschaftliches und praktikables Protokoll für die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus vorgestellt, das für die Modellierung der Adipogenese oder Lipogenese in vitro nützlich sein kann. Das Protokoll beschreibt die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierung für die Kultivierung von periaortalen Adipozyten aus jungen Mäusen. Dieses Protokoll wird den technologischen Grundstein für die Untersuchung der PVAT-Funktion auf der Laborseite bilden.

Einleitung

Es wird angenommen, dass perivaskuläres Fettgewebe (PVAT), eine perivaskuläre Struktur, die aus einer Mischung aus reifen Adipozyten und einer stromalen vaskulären Fraktion (SVF) besteht, über sein Sekretom parakrin mit der angrenzenden Gefäßwand interagiert1. Als kritischer Regulator der vaskulären Homöostase ist die PVAT-Dysfunktion an der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt 2,3,4. Die SVF des Adipozytengewebes besteht aus mehreren erwarteten Zellpopulationen, darunter Endothelzellen, Immunzellen, Mesothelzellen, neuronale Zellen sowie Fettstamm- und Vorläuferzellen (ASPCs)5,6. Es ist bekannt, dass ASPCs, die sich in der SVF des Fettgewebes befinden, reife Adipozyten hervorbringen können5. Es wird angenommen, dass SVF eine kritische Quelle für reife Adipozyten in PVAT ist. Mehrere Studien haben gezeigt, dass PVAT-SVF unter bestimmten Induktionsbedingungen in reife Adipozyten differenzieren kann 6,7,8.

Derzeit gibt es zwei Isolationssysteme zur Isolierung von SVF aus Fettgewebe, eines ist die enzymatische Verdauung und das andere ist nicht-enzymatisch9. Enzymatische Methoden führen typischerweise zu einer höheren Ausbeute an kernhaltigen Vorläuferzellen10. Bis heute wurden die Vorteile von SVF bei der Förderung der Gefäßregeneration und Neovaskularisation bei Wundheilungs-, Urogenital- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen umfassend nachgewiesen11, insbesondere in der Dermatologie und plastischen Chirurgie12,13. Die klinischen Anwendungsaussichten von PVAT-abgeleitetem SVF sind jedoch noch nicht gut erforscht, was auf das Fehlen einer standardisierten Methode zur Isolierung von SVF aus PVAT zurückzuführen ist. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Ansatz für die Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus Maus-PVAT, das die thorakale Aorta umgibt, zu etablieren und so eine weitere Untersuchung der PVAT-Funktion zu ermöglichen. Dieses Protokoll optimiert die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierungstechniken für die Kultivierung von periaortalen Adipozyten, die aus jungen Mäusen gewonnen wurden.

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Protokoll

Die Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Shanghai Chest Hospital genehmigt, das der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine angegliedert ist (Zulassungsnummer: KS23010) und entsprachen den einschlägigen ethischen Vorschriften. Männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 4-8 Wochen sind für dieses Experiment zu bevorzugen.

1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten, Puffern und Nährmedien

  1. Chirurgische Instrumente (z. B. chirurgische Scheren und Standardpinzetten) bei 121 °C für 30 Minuten autoklavieren. Mikrochirurgische Instrumente mit 75%igem Alkohol desinfizieren.
  2. Bereiten Sie sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu, die mit 1 % Penicillin-Streptomycin und weiteren 10 ml PBS mit 10 % Penicillin-Streptomycin ergänzt ist.
    HINWEIS: In den folgenden Abschnitten bezieht sich PBS, sofern nicht ausdrücklich erwähnt, auf reguläres steriles PBS.
  3. Bereiten Sie Krebs Ringer HEPES BSA-Puffer vor: 1% Rinderserumalbumin (BSA), 20 mM HEPES gelöst in Krebs Ringer-Lösung.
  4. Bereiten Sie eine frische Verdauungslösung vor: Kollagenase Typ 1 (1 mg/ml) und Dispase II (4 mg/ml) gelöst in Krebs Ringer HEPES BSA-Puffer. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter.
  5. Bereiten Sie eine kollagenbeschichtete 12-Well-Platte vor.
    1. Verdünnen Sie die Kollagenlösung (1 mg/ml) mit sterilem deionisiertem Wasser auf die Konzentration von 40 μg/ml. Geben Sie 1 ml der verdünnten Kollagenlösung auf die Oberfläche jeder Vertiefung, um eine Konzentration von 6-10 μg/cm2 zu erreichen. Inkubieren Sie die Beschichtung 1 h bei Raumtemperatur.
    2. Entfernen Sie die restliche Lösung und spülen Sie jede Vertiefung 2x mit 1 ml PBS aus. Verwenden Sie die Platte sofort oder trocknen Sie die Platte an der Luft in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II und lagern Sie die beschichtete Platte bei 2-8 °C. Versiegeln Sie die beschichteten Platten bei der Lagerung mit Parafolie.
  6. Bereiten Sie das Kulturmedium vor: Dulbecco-Modified Eagles Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, 10 % fötales Kälberserum (FBS), 1 % v/v Penicillin-Streptomycin. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.
  7. Bereiten Sie lipogenes Induktionsmedium vor: DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % FBS, 1 % v/v Penicillin-Streptomycin, 1 nM Trijodthyronin, 1 μM Rosiglitazon, 1 μM Insulin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) und 1 μM Dexamethason. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.
  8. Erhaltungsmedium vorbereiten: DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % FBS, 1 % v/v Penicillin-Streptomycin, 1 nM Trijodthyronin, 1 μM Rosiglitazon und 1 μM Insulin. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.

2. Dissektion und Isolierung von perivaskulärem Fettgewebe (PVAT)

  1. Euthanasie der Maus durch Zervixluxation unter 2%iger Isofluran-Anästhesie oder mit Kohlendioxid-Überdosierung. Sprühen Sie mit 75% Alkohol zur Hautdesinfektion.
  2. Bringen Sie die Maus in Rückenlage (mit dem Gesicht nach oben).
  3. Heben Sie die Haut an, machen Sie einen kleinen Schnitt und trennen Sie die Haut und die Bauchmuskeln mit einer chirurgischen Schere stumpf entlang der ventralen Mittellinie vom Becken bis zum Hals. Lege das Herz und die Lunge frei, indem du das Zwerchfell und die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie durchschneidest.
  4. Entfernen Sie vorsichtig Leber, Milz, Darm und Niere. Vermeiden Sie es, die Darmwand zu durchtrennen.
  5. Entferne die Lunge und die Speiseröhre.
  6. Heben Sie das Herz vorsichtig mit einer Zange in der einen Hand an und trennen Sie die Aorta mit einer chirurgischen Schere in der anderen Hand von der Wirbelsäule. Dann werden das Herz und die Aorta in eine 60-mm-Petrischale mit PBS gelegt, die 1% v/v Penicillin-Streptomycin enthält.
  7. Entfernen Sie die mikrochirurgische Zange und die mikrochirurgische Schere vom Alkohol und spülen Sie 25 ml PBS ein, um den überschüssigen Alkohol zu entfernen. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop den Thymus und anderes Gewebe aus dem Herzen und der Aorta, entfernen Sie dann das Herz und belassen Sie die Aorta mit den PVATs.
  8. Die Aorta mit den PVATs in eine saubere 60 mm Petrischale mit PBS mit 1% v/v Penicillin-Streptomycin überführen.
  9. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Pinzette, um PVATs zu entfernen, wobei eine Pinzette die Aorta fixiert und die andere das Fettgewebe abzieht. Entfernen Sie das Gefäßgewebe so weit wie möglich und minimieren Sie gleichzeitig die Schädigung des perivaskulären Fettgewebes.
  10. Sammeln Sie das PVAT, das die thorakale Aorta umgibt, in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das DMEM mit hohem Glukosegehalt enthält, ergänzt mit 1 % v/v Penicillin-Streptomycin, das auf Eis gelegt wird.

3. Isolierung der stromalen Gefäßfraktion (SVF)

  1. Spülen Sie das gesammelte Gewebe nacheinander mit PBS mit 10% v/v Penicillin-Streptomycin und PBS mit 1% v/v Penicillin-Streptomycin.
    HINWEIS: Ab diesem Schritt müssen alle Versuche unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II durchgeführt werden.
  2. Die Taschentücher in eine sterile 60-mm-Petrischale geben, 200 μl Aufschlusslösung hinzufügen und mit einer sterilen Schere in 1 mm3 Stücke zerkleinern.
  3. Die Mischung wird mit einer Kunststoffpipettenspitze in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, das Ende durch einen sterilen Scherenschnitt verbreitert und 6 ml Aufschlusslösung hinzugefügt, um die Aufschlussreaktion zu starten.
    HINWEIS: Eine Verdauungsreaktion (3 ml Aufschlusslösung) ist ausreichend für PVAT-Depots von sechs Mäusen.
  4. Das Gewebe wird bei 37 °C in einem Inkubator mit einem Orbitalschüttler (150 U/min Frequenz für effektives Mischen) für 30-45 Minuten inkubiert. Binden Sie die Röhrchen flach auf ein Gestell, damit die Röhrchen horizontal wackeln. Alle 5-10 min 10 s mit der Hand kräftig auf und ab schütteln.
    HINWEIS: Die Verdauung kann abgebrochen werden, wenn eine homogene, gelbliche Verdauungsflüssigkeit ohne Gewebefragmente zu sehen ist.
  5. Das verdaute Gewebe wird durch ein 70-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen abgeseiht. Spülen Sie das Zellsieb mit einer gleichen Menge Kulturmedium, um die Zellausbeute zu maximieren und die Verdauung zu stoppen.
  6. Das Filtrat in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 1.800 × g 10 min zentrifugieren. Drehen Sie das Röhrchen um, um den Überstand zu verwerfen, und resuspendieren Sie die Pellets in 5 ml PBS. Bei 1.800 × g 5 min zentrifugieren.
  7. Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen umdrehen und die Pellets in einem geeigneten Nährmedium resuspendieren.
    HINWEIS: Die Zellpellets, die von jeweils sechs Mäusen gesammelt werden, werden in 1 ml Kulturmedium resuspendiert und in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte gesät.
  8. Die Zellen werden in eine kollagenbeschichtete 12-Well-Platte gesät und bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 über Nacht inkubiert.
  9. Am nächsten Tag wird das Kulturmedium abgesaugt, die Zellen mit vorgewärmtem (37 °C) PBS gewaschen, das 1 % v/v Penicillin-Streptomycin enthält, um Zelltrümmer und rote Blutkörperchen zu entfernen, und 1 ml frisches Kulturmedium in jede Vertiefung zurückgeben.

4. Adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus periaortalem Fettgewebe

  1. Wechseln Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag, bis die Zellen ~60-70% Konfluenz erreicht haben.
    HINWEIS: Normalerweise dauert es 3-4 Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 60-70% erreicht haben.
  2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 60-70 % erreicht haben, saugen Sie das Kulturmedium ab und ersetzen Sie es durch braunes adipogenes Induktionsmedium. Betrachten Sie den Tag der Induktion der adipogenen Differenzierung als Tag 0 der Differenzierung.
  3. Nach 72 h (Tag 3 der Differenzierung) wird das Medium mit Erhaltungsmedium aufgefrischt. Wechseln Sie das Erhaltungsmedium alle 2 Tage, bis die Zellen für Experimente verwendet werden.
  4. Analysieren Sie die adipogenen Zellen in geeigneter Weise, z. B. durch Ölrot-O-Färbung14 und Western Blot15.

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Ergebnisse

Mit diesem oben beschriebenen Protokoll haben wir sorgfältig PVATs isoliert, die die thorakalen Aorten der Maus umgeben (Abbildung 1A-D). Nach dem Waschen und Zerkleinern der PVATs in kleine Stücke mit einer sterilen Schere (Abbildung 1E,F) wurden die Gewebefragmente in einer Aufschlusslösung, die Kollagenase Typ 1 (1 mg/ml) und Dispase II (4 mg/ml) enthielt, aufgeschlossen und bei 37 °C auf einem Schüttler für 30-45 Minuten inkubiert (

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Diskussion

Wir schlagen einen praktischen und praktikablen Ansatz für die Isolierung und adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus periaortalem Fettgewebe der Maus vor. Die Vorteile dieses Protokolls sind, dass es einfach und kostengünstig ist. Eine ausreichende Anzahl von Mäusen ist entscheidend für eine erfolgreiche Isolierung, da unzureichendes Gewebe zu einer niedrigen SVF-Dichte und einem schlechten Wachstumszustand führen kann, was letztendlich die lipogene Effizienz beeinträchtigt. Darüber hinaus ist das Alt...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, weder finanzieller noch anderer Art, zu deklarieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82130012 und 81830010) und den Nurture-Projekten für Grundlagenforschung des Shanghai Chest Hospital unterstützt (Fördernummer: 2022YNJCQ03).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 μ m SpritzenvorsatzfilterPALL4612
12-Well-Platte Labselect11210
15 mL ZentrifugenröhrchenLabserv310109003
3,3',5-Trijod-L-thyronin (T3)Sigma-AldrichT-28771 nM
50 mL ZentrifugenröhrchenLabselectCT-002-50A
Anti-AdiponektinAbcamab225541:1.000 Arbeitskonzentration
anti-COX IVCST48501:1.000 Arbeitskonzentration
anti-FABP4CST21201:1.000 Arbeitskonzentration
anti-PGC1αAbcamab1918381:1.000 Arbeitskonzentration
Anti-PPAR & Gamma;InvitrogenMA5-148891:1.000 Arbeitskonzentration
anti-UCP1Abcamab109831:1.000 Arbeitskonzentration
anti-α-ActininCST64871:1.000 Arbeitskonzentration
BSABeyotimeST023-200g1%
C57BL/6 Mäuse im Alter von 4-8 Wochen beiderlei GeschlechtsShanghai Model Organisms Center, Inc.
Zellsieb 70 µ m, NylonFalcon352350
Kollagen aus KalbslederSigma-AldrichC8919
Kollagenase, Typ 1WorthingtonLS0041961 mg/ml
DexamethasonSigma-AldrichD17561 μ M
Dispase IISigma-AldrichD4693-1G4 mg/ml
fötales RinderserumGibco16000-04410%
HEPESSigma-AldrichH4034-25G20 mM
hohem GlukosegehaltSH30022.01
IBMX Sigma-AldrichI70180,5 mM
Inkubator mit OrbitalschüttlerShanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.LYZ-103B
Insulin (Rinder)Sigma-Aldrich11070-73-81 μ M
IsofluranRWDR510-22-10
Krebs-Ringer's LösungPreislla PB180347Schutz vor Licht 
Mikrochirurgische ZangeBeyotimeFS233
Mikrochirurgische SchereBeyotimeFS217
Öl Rot O Sangon Biotech (Shanghai) Co., LtdA600395-0050
PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Sangon Biotech (Shanghai) Co., LtdB548117-0500
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Maus IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 115-035-1461:5.000 Arbeitskonzentration
Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 111-035-144Arbeitskonzentration 1:5.000
RosiglitazonSigma-AldrichR24081 μ M
Standard-PinzetteBeyotimeFS225
Chirurgische SchereBeyotimeFS001
DMEM-Hyklon mit

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