Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

Es wird angenommen, dass perivaskuläres Fettgewebe (PVAT), eine perivaskuläre Struktur, die aus einer Mischung aus reifen Adipozyten und einer stromalen vaskulären Fraktion (SVF) besteht, über sein Sekretom parakrin mit der angrenzenden Gefäßwand interagiert¹. Als kritischer Regulator der vaskulären Homöostase ist die PVAT-Dysfunktion an der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt ^2,3,4. Die SVF des Adipozytengewebes besteht aus mehreren erwarteten Zellpopulationen, darunter Endothelzellen, Immunzellen, Mesothelzellen, neuronale Zellen sowie Fettstamm- und Vorläuferzellen (ASPCs)^5,6. Es ist bekannt, dass ASPCs, die sich in der SVF des Fettgewebes befinden, reife Adipozyten hervorbringen können⁵. Es wird angenommen, dass SVF eine kritische Quelle für reife Adipozyten in PVAT ist. Mehrere Studien haben gezeigt, dass PVAT-SVF unter bestimmten Induktionsbedingungen in reife Adipozyten differenzieren kann ^6,7,8.

Derzeit gibt es zwei Isolationssysteme zur Isolierung von SVF aus Fettgewebe, eines ist die enzymatische Verdauung und das andere ist nicht-enzymatisch⁹. Enzymatische Methoden führen typischerweise zu einer höheren Ausbeute an kernhaltigen Vorläuferzellen¹⁰. Bis heute wurden die Vorteile von SVF bei der Förderung der Gefäßregeneration und Neovaskularisation bei Wundheilungs-, Urogenital- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen umfassend nachgewiesen¹¹, insbesondere in der Dermatologie und plastischen Chirurgie^12,13. Die klinischen Anwendungsaussichten von PVAT-abgeleitetem SVF sind jedoch noch nicht gut erforscht, was auf das Fehlen einer standardisierten Methode zur Isolierung von SVF aus PVAT zurückzuführen ist. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Ansatz für die Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus Maus-PVAT, das die thorakale Aorta umgibt, zu etablieren und so eine weitere Untersuchung der PVAT-Funktion zu ermöglichen. Dieses Protokoll optimiert die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierungstechniken für die Kultivierung von periaortalen Adipozyten, die aus jungen Mäusen gewonnen wurden.

Die Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Shanghai Chest Hospital genehmigt, das der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine angegliedert ist (Zulassungsnummer: KS23010) und entsprachen den einschlägigen ethischen Vorschriften. Männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 4-8 Wochen sind für dieses Experiment zu bevorzugen.

1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten, Puffern und Nährmedien

1. Chirurgische Instrumente (z. B. chirurgische Scheren und Standardpinzetten) bei 121 °C für 30 Minuten autoklavieren. Mikrochirurgische Instrumente mit 75%igem Alkohol desinfizieren.
2. Bereiten Sie sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu, die mit 1 % Penicillin-Streptomycin und weiteren 10 ml PBS mit 10 % Penicillin-Streptomycin ergänzt ist.
   HINWEIS: In den folgenden Abschnitten bezieht sich PBS, sofern nicht ausdrücklich erwähnt, auf reguläres steriles PBS.
3. Bereiten Sie Krebs Ringer HEPES BSA-Puffer vor: 1% Rinderserumalbumin (BSA), 20 mM HEPES gelöst in Krebs Ringer-Lösung.
4. Bereiten Sie eine frische Verdauungslösung vor: Kollagenase Typ 1 (1 mg/ml) und Dispase II (4 mg/ml) gelöst in Krebs Ringer HEPES BSA-Puffer. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter.
5. Bereiten Sie eine kollagenbeschichtete 12-Well-Platte vor.
   1. Verdünnen Sie die Kollagenlösung (1 mg/ml) mit sterilem deionisiertem Wasser auf die Konzentration von 40 μg/ml. Geben Sie 1 ml der verdünnten Kollagenlösung auf die Oberfläche jeder Vertiefung, um eine Konzentration von 6-10 μg/^cm2 zu erreichen. Inkubieren Sie die Beschichtung 1 h bei Raumtemperatur.
   2. Entfernen Sie die restliche Lösung und spülen Sie jede Vertiefung 2x mit 1 ml PBS aus. Verwenden Sie die Platte sofort oder trocknen Sie die Platte an der Luft in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II und lagern Sie die beschichtete Platte bei 2-8 °C. Versiegeln Sie die beschichteten Platten bei der Lagerung mit Parafolie.
6. Bereiten Sie das Kulturmedium vor: Dulbecco-Modified Eagles Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, 10 % fötales Kälberserum (FBS), 1 % v/v Penicillin-Streptomycin. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.
7. Bereiten Sie lipogenes Induktionsmedium vor: DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % FBS, 1 % v/v Penicillin-Streptomycin, 1 nM Trijodthyronin, 1 μM Rosiglitazon, 1 μM Insulin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) und 1 μM Dexamethason. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.
8. Erhaltungsmedium vorbereiten: DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % FBS, 1 % v/v Penicillin-Streptomycin, 1 nM Trijodthyronin, 1 μM Rosiglitazon und 1 μM Insulin. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.

2. Dissektion und Isolierung von perivaskulärem Fettgewebe (PVAT)

1. Euthanasie der Maus durch Zervixluxation unter 2%iger Isofluran-Anästhesie oder mit Kohlendioxid-Überdosierung. Sprühen Sie mit 75% Alkohol zur Hautdesinfektion.
2. Bringen Sie die Maus in Rückenlage (mit dem Gesicht nach oben).
3. Heben Sie die Haut an, machen Sie einen kleinen Schnitt und trennen Sie die Haut und die Bauchmuskeln mit einer chirurgischen Schere stumpf entlang der ventralen Mittellinie vom Becken bis zum Hals. Lege das Herz und die Lunge frei, indem du das Zwerchfell und die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie durchschneidest.
4. Entfernen Sie vorsichtig Leber, Milz, Darm und Niere. Vermeiden Sie es, die Darmwand zu durchtrennen.
5. Entferne die Lunge und die Speiseröhre.
6. Heben Sie das Herz vorsichtig mit einer Zange in der einen Hand an und trennen Sie die Aorta mit einer chirurgischen Schere in der anderen Hand von der Wirbelsäule. Dann werden das Herz und die Aorta in eine 60-mm-Petrischale mit PBS gelegt, die 1% v/v Penicillin-Streptomycin enthält.
7. Entfernen Sie die mikrochirurgische Zange und die mikrochirurgische Schere vom Alkohol und spülen Sie 25 ml PBS ein, um den überschüssigen Alkohol zu entfernen. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop den Thymus und anderes Gewebe aus dem Herzen und der Aorta, entfernen Sie dann das Herz und belassen Sie die Aorta mit den PVATs.
8. Die Aorta mit den PVATs in eine saubere 60 mm Petrischale mit PBS mit 1% v/v Penicillin-Streptomycin überführen.
9. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Pinzette, um PVATs zu entfernen, wobei eine Pinzette die Aorta fixiert und die andere das Fettgewebe abzieht. Entfernen Sie das Gefäßgewebe so weit wie möglich und minimieren Sie gleichzeitig die Schädigung des perivaskulären Fettgewebes.
10. Sammeln Sie das PVAT, das die thorakale Aorta umgibt, in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das DMEM mit hohem Glukosegehalt enthält, ergänzt mit 1 % v/v Penicillin-Streptomycin, das auf Eis gelegt wird.

3. Isolierung der stromalen Gefäßfraktion (SVF)

1. Spülen Sie das gesammelte Gewebe nacheinander mit PBS mit 10% v/v Penicillin-Streptomycin und PBS mit 1% v/v Penicillin-Streptomycin.
   HINWEIS: Ab diesem Schritt müssen alle Versuche unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II durchgeführt werden.
2. Die Taschentücher in eine sterile 60-mm-Petrischale geben, 200 μl Aufschlusslösung hinzufügen und mit einer sterilen Schere in 1 mm³ Stücke zerkleinern.
3. Die Mischung wird mit einer Kunststoffpipettenspitze in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, das Ende durch einen sterilen Scherenschnitt verbreitert und 6 ml Aufschlusslösung hinzugefügt, um die Aufschlussreaktion zu starten.
   HINWEIS: Eine Verdauungsreaktion (3 ml Aufschlusslösung) ist ausreichend für PVAT-Depots von sechs Mäusen.
4. Das Gewebe wird bei 37 °C in einem Inkubator mit einem Orbitalschüttler (150 U/min Frequenz für effektives Mischen) für 30-45 Minuten inkubiert. Binden Sie die Röhrchen flach auf ein Gestell, damit die Röhrchen horizontal wackeln. Alle 5-10 min 10 s mit der Hand kräftig auf und ab schütteln.
   HINWEIS: Die Verdauung kann abgebrochen werden, wenn eine homogene, gelbliche Verdauungsflüssigkeit ohne Gewebefragmente zu sehen ist.
5. Das verdaute Gewebe wird durch ein 70-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen abgeseiht. Spülen Sie das Zellsieb mit einer gleichen Menge Kulturmedium, um die Zellausbeute zu maximieren und die Verdauung zu stoppen.
6. Das Filtrat in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 1.800 × g 10 min zentrifugieren. Drehen Sie das Röhrchen um, um den Überstand zu verwerfen, und resuspendieren Sie die Pellets in 5 ml PBS. Bei 1.800 × g 5 min zentrifugieren.
7. Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen umdrehen und die Pellets in einem geeigneten Nährmedium resuspendieren.
   HINWEIS: Die Zellpellets, die von jeweils sechs Mäusen gesammelt werden, werden in 1 ml Kulturmedium resuspendiert und in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte gesät.
8. Die Zellen werden in eine kollagenbeschichtete 12-Well-Platte gesät und bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂ über Nacht inkubiert.
9. Am nächsten Tag wird das Kulturmedium abgesaugt, die Zellen mit vorgewärmtem (37 °C) PBS gewaschen, das 1 % v/v Penicillin-Streptomycin enthält, um Zelltrümmer und rote Blutkörperchen zu entfernen, und 1 ml frisches Kulturmedium in jede Vertiefung zurückgeben.

4. Adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus periaortalem Fettgewebe

1. Wechseln Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag, bis die Zellen ~60-70% Konfluenz erreicht haben.
   HINWEIS: Normalerweise dauert es 3-4 Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 60-70% erreicht haben.
2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 60-70 % erreicht haben, saugen Sie das Kulturmedium ab und ersetzen Sie es durch braunes adipogenes Induktionsmedium. Betrachten Sie den Tag der Induktion der adipogenen Differenzierung als Tag 0 der Differenzierung.
3. Nach 72 h (Tag 3 der Differenzierung) wird das Medium mit Erhaltungsmedium aufgefrischt. Wechseln Sie das Erhaltungsmedium alle 2 Tage, bis die Zellen für Experimente verwendet werden.
4. Analysieren Sie die adipogenen Zellen in geeigneter Weise, z. B. durch Ölrot-O-Färbung¹⁴ und Western Blot¹⁵.

Mit diesem oben beschriebenen Protokoll haben wir sorgfältig PVATs isoliert, die die thorakalen Aorten der Maus umgeben (Abbildung 1A-D). Nach dem Waschen und Zerkleinern der PVATs in kleine Stücke mit einer sterilen Schere (Abbildung 1E,F) wurden die Gewebefragmente in einer Aufschlusslösung, die Kollagenase Typ 1 (1 mg/ml) und Dispase II (4 mg/ml) enthielt, aufgeschlossen und bei 37 °C auf einem Schüttler für 30-45 Minuten inkubiert (Abbildung 1G). Die verdauten Gewebe wurden durch ein 70-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen gesiebt (Abbildung 1H). Die Zellpellets wurden nach der Zentrifugation gesammelt (Abbildung 1I).

Um das adipogene Potenzial der SVF-abgeleiteten Präadipozyten zu bestätigen, induzierten wir die Zellen mit braunem adipogenem Induktionsmedium, das 1 nM Trijodthyronin, 1 μM Rosiglitazon, 1 μM Insulin, 0,5 mM IBMX und 1 μM Dexamethason enthielt. Reife Adipozyten wurden nach 7-10 Tagen brauner adipogener Induktion beobachtet, die durch die Bildung von ölroten O-gefärbten, lipidreichen Vakuolen gekennzeichnet war (Abbildung 2A). Die Western-Blotting-Analyse zeigte außerdem die erhöhte Expression von Adipozyten-spezifischen Proteinen, einschließlich Adiponektin, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Ucp1 und des mitochondrialen Proteins Cox IV (Abbildung 2B,C). Diese Daten deuten darauf hin, dass die SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus dem periaortalen Fettgewebe der Maus ein starkes adipogenes Potenzial aufweisen.

Abbildung 1: Isolierung der stromalen Gefäßfraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus . (A) Das Herz und die Aorta werden sorgfältig mit einer chirurgischen Zange und einer Schere präpariert. Weiße und gelbe Pfeilspitzen zeigen das Herz bzw. die Aorta an. (B) PVATs, die die thorakale Aorta umgeben, werden vorsichtig mit einer Pinzette abgestreift. (C) Die Aorta, die nach der Entfernung von PVAT um die thorakale Aorta herum verbleibt. (D) PVATs werden in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt, das DMEM mit hohem Glukosegehalt mit 1 % v/v Penicillin-Streptomycin enthält. (E) PVATs werden nacheinander mit PBS mit 10 % v/v Penicillin-Streptomycin und PBS mit 1 % v/v Penicillin-Streptomycin gespült. (F) Zerkleinern der PVATs in 1 mm3 Stücke mit einer sterilen Schere. (G) Überführung von zerkleinerten PVATs in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das 6 ml Aufschlusslösung enthält, und Inkubation des Gewebes bei 37 °C für 30-45 Minuten unter Schütteln bei 150 U/min. (H) Stoppen Sie den Aufschluss und filtrieren Sie die Suspension durch ein 70-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. (I) Das Filtrat wird 10 min lang bei 1.800 × g zentrifugiert; die SVF isoliert wurde. Abkürzungen: PVAT = perivaskuläres Fettgewebe; SVF = stromale vaskuläre Fraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Adipogene Differenzierung der stromalen Gefäßfraktion aus dem periaortalen Fettgewebe der Maus. (A) Repräsentative Bilder des Lichtmikroskops und der Ölrot-O-Färbung von primären Adipozyten, die von periaortalen Präadipozyten an Tag 8 differenziert wurden. Maßstabsbalken = 200 μm. (B,C) Western-Blotting-Analyse der Proteinspiegel von Adiponectin, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Cox IV und Ucp1 für primäre Adipozyten, die an Tag 8 von periaortalen Präadipozyten differenziert wurden. Ungepaarte zweiseitige Student-t-Tests wurden verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu berechnen. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, weder finanzieller noch anderer Art, zu deklarieren.