Isolierung, In-vitro-Expansion und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus

Zusammenfassung

Das Fettgewebe ist eine ausgezeichnete Quelle für mesenchymale Stammzellen. Hier bringen wir die Schritt-für-Schritt-Extraktion, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe von Schweizer Mäusen an.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als neuer therapeutischer Ansatz ausgiebig untersucht, hauptsächlich um verschlimmerte Entzündungen aufgrund ihres Potenzials, die Immunantwort zu modulieren, zu stoppen. Die MSCs sind immunprivilegierte Zellen, die in der Lage sind, in immunologisch inkompatiblen allogenen Transplantatempfängern zu überleben, basierend auf der geringen Expression von Klasse-I-Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und bei der Verwendung zellbasierter Therapien für allogene Transplantationen. Diese Zellen können aus mehreren Geweben isoliert werden, wobei die am häufigsten verwendeten Gewebe das Knochenmark und das Fettgewebe sind. Wir bieten ein einfaches Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von MSCs aus Nebenhodenfettgewebe von Mäusen. Das Nebenhodenfettgewebe wird chirurgisch exzidiert, physikalisch fragmentiert und mit 0,15%iger Kollagenase-Typ-II-Lösung verdaut. Anschließend werden primäre Fettgewebe-Stammzellen (ADSCs) in vitro kultiviert und expandiert, und die phänotypische Charakterisierung erfolgt durch Durchflusszytometrie. Wir liefern auch die Schritte zur Differenzierung der ADSCs in osteogene, adipogene und chondrogene Zellen, gefolgt von der funktionellen Charakterisierung jeder Zelllinie. Das hier bereitgestellte Protokoll kann für In-vivo - und Ex-vivo-Experimente verwendet werden, und als Alternative können die aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen zur Erzeugung von MSCs-ähnlichen immortalisierten Zellen verwendet werden.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind adulte Multipotentialzellen, die sich in Zellen wie Osteoblasten, Chondroblasten und Adipozyten^{differenzieren 1,2}. Diese Zellen befinden sich in mehreren Organen und können daher aus adulten Geweben wie Knochenmark, Muskeln, Fett, Haarfollikel, Zahnwurzel, Plazenta, Dermis, Perichondrium, Nabelschnur, Lunge, Leber und Milz extrahiert werden ^3,4.

Über die Auswirkungen von MSCs auf die Physiologie und das Immunsystem wurde berichtet ^5,6. Diese Zellen haben sich als vielversprechend für die Behandlung verschiedener Krankheiten erwiesen, sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin. Die MSCs können Entzündungen kontrollieren und die Angiogenese und Gewebehomöostase durch verschiedene Mechanismen fördern, wie z. B. Zell-Zell-Kontakt, lösliche Faktoren und kleine extrazelluläre Vesikel 7,8,9,10. Darüber hinaus handelt es sich bei den MSCs um immunprivilegierte Zellen, die in der Lage sind, in immunologisch inkompatiblen allogenen Transplantatempfängern zu überleben, da diese Zellen eine geringe Expression von Klasse-I-Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) aufweisen und in der zellbasierten Therapie für allogene Transplantationen verwendet werden^11,12. Die geringe Immunogenität in Kombination mit dem regenerativen Potenzial macht MSCs zu idealen Kandidaten für Zelltherapien, wie z.B. bei der Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD)¹³, dem systemischen Lupus erythematodes (SLE)¹⁴ und der Multiplen Sklerose^{15 16,17}.

Trotz der Tatsache, dass sich MSCs in mehreren adulten Geweben befinden, bietet das Fettgewebe Vorteile gegenüber anderen Quellen, wie z. B. die Zugänglichkeit für die Entnahme mit minimalen chirurgischen Eingriffen; große Anzahl verfügbarer Zellen mit hoher Expansionsrate; und einfache In-vitro-Expansion mit einem einfach durchzuführenden Protokoll, ohne dass spezielle Geräte und kostengünstige Materialien erforderlich sind 18,19,20. Nach der Extraktion müssen die aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ADSCs) charakterisiert werden, wie von der International Society for Cellular Therapy (ISCT)²¹ festgelegt. Daher müssen MSCs eine morphologische Fibroblasten-ähnliche Adhärenz an plastischen Kulturen aufweisen und einen hohen Prozentsatz (≥95%) von mesenchymalen Markern wie Endoglin (CD105), Ecto-5'-Nukleotidase (CD73) und Thy-1 (CD90) und einen niedrigen Prozentsatz (≤2%) von hämatopoetischen Markern wie Leukozyten-Common-Antigen (CD45), Transmembran-Phosphoglykoprotein (CD34), Glykolipid-verankertes Membranglykoprotein (CD14), Integrin alpha M (CD11b), B-Zell-Antigen-Rezeptor-Komplex-assoziierte Protein-Alpha-Kette (CD79α) oder B-Lymphozyten-Oberflächenantigen B4 (CD19) und humanes Leukozytenantigen der Klasse II (HLA-II). Darüber hinaus ist eine funktionelle Charakterisierung erforderlich, und die Zellen sollten in der Lage sein, sich in Osteoblasten-, Chondroblasten- oder Adipoblastenzellen zu differenzieren²¹.

In dieser Arbeit zeigen wir, wie die MSCs aus Nebenhodenfettgewebe mittels mechanischer Dissoziation und enzymatischem Verdau für in vitro Studien und die durch ISCT präkonisierte morphologische Charakterisierung gewonnen werden können.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den internationalen Richtlinien für Tierethik durchgeführt und von institutionellen Pflege- und Verwendungsausschüssen der Staatlichen Universität Santa Cruz unter der Protokollnummer 021/22 genehmigt. Schweizer männliche Mäuse (6-8 Wochen) wurden von der Tierzucht-, Erhaltungs- und Versuchslaboratorium der Staatlichen Universität Santa Cruz (LaBIO-UESC) Tierversuchseinrichtung erworben, unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten und mit 12 h Hell-Dunkel-Zyklen ad libitum mit Wasser und Futter versorgt.

HINWEIS: Es können auch andere Mäuse verwendet werden. Wir empfehlen die Verwendung von adulten Mäusen (6-8 Wochen), da sie ein stärker entwickeltes Fettgewebe und Zellen mit hoher proliferativer Aktivität aufweisen.

1. Vorbereitung

HINWEIS: Bevor Sie fortfahren, bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor, die unten beschrieben werden. In der Materialtabelle finden Sie Informationen zu Reagenzien und Materiallieferanten. Persönliche Schutzausrüstung wie Masken, Mützen, Laborkittel und Handschuhe müssen bei allen praktischen Eingriffen getragen werden.

1. Extraktion von Nebenhodenfettgewebe
   1. Reservieren Sie die OP-Materialien: drei sterile Pinzetten und Scheren, fünf Nadeln und ein Becherglas mit 200 ml 70%igem Ethanol.
   2. Bereiten Sie ein Endanästhetikum vor, indem Sie Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) mischen.
2. ADSCs-Kultur
   1. Basalmedium: Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medium mit hohem Glukosegehalt vor, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 50 μg/ml Gentamicin, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 100 μg/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin ergänzt wird.
   2. Aufschlusslösung: Bereiten Sie 0,15 % Kollagenase Typ II in PBS sterilisiert in einem 0,25 μm-Filter auf.
      HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die vier im Basalmedium beschriebenen Antibiotika zu verwenden. Dies hängt von den Zellkulturbedingungen des Labors ab, in dem dies durchgeführt wird.
3. Phänotypische Charakterisierung von ADSCs
   1. Bereiten Sie 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS vor.
   2. Verdünnen Sie die Anti-Maus-Antikörper wie in Tabelle 1 beschrieben.
   3. Bereiten Sie 2% Formaldehyd in PBS vor.
4. ADSCs osteogene Differenzierung
   1. Osteogenes Differenzierungsmedium: Bereiten Sie DMEM vor, ergänzt mit 5,67 M Ascorbinsäure, 10 nM Dexamethason, 0,02 M β-Glycerophosphat, 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin.
   2. Bereiten Sie für die Von-Kossa-Färbung die folgenden Lösungen vor: 70 % Ethanol in Wasser, 5 % Silbernitrat in Wasser, destilliertes Wasser, 5 % Natriumthiosulfat in Wasser und 1 % Eosin B in Wasser.
5. Adipogene Differenzierung:
   1. Adipogenes Differenzierungsmedium: Bereiten Sie DMEM vor, ergänzt mit 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin, 200 μM Indomethacin, 1 μM Dexamethason, 10 μM Insulin, 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin.
   2. Bereiten Sie für die Ölrotfärbung die folgenden Lösungen vor: 10 % Formalin in entionisiertem Wasser, 60 % Isopropanol in deionisiertem Wasser, Lysochrom (fettlöslicher Farbstoff), Diazofarbstoff (Öl-Rot-O-Lösung) in 60 % Isopropanol und 1 % Hämatoxylin in deionisiertem Wasser.
6. Chondrogene Differenzierung:
   1. Chondrogenes Differenzierungsmedium: Bereiten Sie chondrogenes Medium vor, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt ist.
   2. Bereiten Sie 10% Formaldehyd in PBS vor.
   3. Für die Färbung von Proteoglykanen und Glykosaminoglykanen bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: Heteroglykan-Färbung (Alcianblau 1%) in Essigsäure, pH 2,5, Paraffin, Hämatoxylin, Verdünnung der Ethanolreihe in Wasser (100%, 96%, 80% und 70%).

Antikörper/Fluorophor	Verdünnung	Klonen	Endkonzentration (μg/ml)	Funktion und Zelle, in der sie exprimiert wird
CD34- PE	1:100	Arbeitsspeicher 34	2	Zelladhäsionsfaktor. Hämatopoetische Stammzellen.
CD45- Schützenpanzer	1:100	30-F11	2	Unterstützung bei der Aktivierung von Leukozyten. Exprimiert in Leukozyten.
CD71- FITC	1:100	C2	5	Kontrolliert die Eisenaufnahme während der Zellproliferation. Proliferierende Zellen, Retikulozyten und Vorläuferzellen.
CD29- FITC	1:100	Ha2/5	5	Adhäsion und Aktivierung, Embryogenese, Leukozyten, dendritische Zellen, Blutplättchen, Mastzellen, Fibroblasten und Endothelzellen.
CD90- PerCP	1:100	OCHSE-7	2	Signalisierung, Adhäsion. T-Lymphozyten, NK, Monozyten, hämopoetische Stammzellen, Neuronen und Fibroblasten.

Tabelle 1: Antikörper, die für die phänotypische Charakterisierung von ADSCs mittels Durchflusszytometer verwendet werden. Liste der Antikörper mit ihren jeweiligen Fluorochromen, Verdünnungen, Klonen und Endkonzentration sowie ihrer Funktion in der Zelle, die exprimiert wird.

2. Methoden

HINWEIS: Das Fettgewebe ist im ganzen Körper an subkutanen oder intraabdominalen Stellen verteilt. Zu den am häufigsten für Experimente verwendeten Fettgeweben bei Mäusen gehören das subkutane Nebenhodengewebe, das Mesenterial und das Retroperitoneal²². Hier werden die Schritte zur Gewinnung von Nebenhodenfettgewebe gezeigt (Abbildung 1).

Abbildung 1: Versuchsaufbau zur Gewinnung von Stammzellen aus Fettgewebe von Schweizer Mäusen. (A) Das Tier mit Nadeln auf die Kork- oder Styroporplatte legen; (B) Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an, machen Sie einen Schnitt in der Mitte der Bauchregion und lösen Sie die Haut vom Bauchfell; (C) das weiße Fettgewebe oberhalb des Nebenhodens zu identifizieren; (D) das Gewebe in ein DMEM-Medium überführen, das mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika ergänzt ist, das Nebenhodenfettgewebe gründlich mit PBS waschen und das Gewebe in die Verdauungslösung überführen; (E), das Gewebe fragmentieren und (F) 1 h lang bei 37 °C inkubieren, dabei alle 10 min kräftig schütteln; (G) Nach dem Zählen der Zellen in 6-Well-Platten einfüllen und die Zellmorphologie unter einem inversen Mikroskop beobachten. (F) Die Zellmorphologie ändert sich von rund zu fibroblastenartig. Maßstabsleiste = 22,22 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Extraktion von Nebenhodenfettgewebe
   HINWEIS: Beachten Sie, dass alle Eingriffe unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow-Schrank durchgeführt werden müssen, um eine reine und kontaminationsfreie Zellkultur zu gewährleisten.
   1. Die Tiere werden mit Ketamin und Xylazinlösung (100 mg und 10 mg/kg, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben) intraperitoneal eingeschläfert.
      HINWEIS: Andere Einschläferungsmethoden können verwendet werden²³. Stellen Sie sicher, dass das Tier tot ist, indem Sie bestätigen, dass kein Herzschlag vorhanden ist.
   2. Legen Sie das Tier mit der Bauchseite nach oben auf eine mit Aluminiumfolie bedeckte Kork- oder Styroporplatte und fixieren Sie es mit sterilen Nadeln (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, sprühen Sie 70% Alkohol in die Bauchregion. Alternativ können Sie die Haare mit einem Skalpell rasieren.
   3. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette in der Mitte der Bauchregion an und machen Sie einen Schnitt mit einer sterilen Schere.
      HINWEIS: Zwei sterile Pinzetten und Scheren sind erforderlich, um eine Kontamination zu vermeiden. Die erste wird verwendet, um das Tier zu öffnen, die Haut und die Peritonealschicht zu schneiden. Der zweite wird verwendet, um das Nebenhodenfettgewebe aufzunehmen. Bewahren Sie außerdem 150 ml 70%igen Alkohol in einem Becherglas auf, um Schere und Pinzette zwischen den Schritten zu reinigen.
   4. Führen Sie die Schere unter die Haut des Tieres ein und öffnen Sie sie, um sie vom Bauchfell zu lösen (Abbildung 1B). Heben Sie die Bauchfellschicht mit einer Pinzette an und schneiden Sie sie mit einer sterilen Schere auf.
   5. Verwenden Sie eine weitere sterile Pinzette und Schere und identifizieren Sie den Nebenhoden über den Hoden und das weiße Fettgewebe über den Nebenhoden. Ziehen Sie mit einer sterilen Pinzette das gesamte Nebenhodenfettgewebe von einer Größe von ca. 2 cm heraus und schneiden Sie sehr nah an den Nebenhoden heran (Abbildung 1C).
   6. Geben Sie das Fett in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen mit Basalmedium und legen Sie es auf Eis (Abbildung 1D). Fahren Sie in der Motorhaube mit den nächsten Schritten fort, wie unten beschrieben.
2. Isolierung von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ADSCs)
   HINWEIS: Verarbeiten Sie die Proben in einer Laminar-Flow-Haube der biologischen Klasse II, und das Personal sollte einen Laborkittel, Handschuhe und eine chirurgische Maske tragen.
   1. Waschen Sie das Nebenhodenfettgewebe gründlich mit PBS.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um das Blut und andere Partikel aus der Probe zu entfernen. Das Blut kann das Kollagenase-Typ-II-Enzym hemmen und das Experiment beeinträchtigen.
   2. Das Nebenhodenfettgewebe wird mit einer sterilen Pinzette in ein 50-ml-Röhrchen mit 15-20 ml Aufschlusslösung überführt, das in Schritt 1.2.2 hergestellt wird. Fragmentieren Sie das Gewebe mit einer sterilen Schere und inkubieren Sie das Gewebe 1 h lang bei 37 °C (Abbildung 1E, F).
      HINWEIS: In diesem Schritt kann ein Wasserbad oder ein Inkubator bei 37 °C verwendet werden. Alle 10 Minuten muss die Suspension kräftig geschüttelt werden, um die Verdauung zu erleichtern. Verlängern Sie nicht die Inkubationszeit von 1 Stunde.
   3. Inaktivieren Sie die Kollagenase, indem Sie die Probe 1:1 in Basalmedium verdünnen und die Suspension bei 250 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um die vaskuläre Fraktion des Stromas zu erhalten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Basalmedium.
   4. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit und zählen Sie die Zellen durch die Trypanblau-Farbstoffausschlussmethode in einer Neubauer-Kammer mit einer Verdünnung von 1:10 oder 1:100.
      HINWEIS: Die erwartete Ausbeute liegt bei etwa 0,5-1 Millionen Zellen/g verarbeitetem Fettgewebe und einer Lebensfähigkeit von 80%.
   5. Plattieren Sie die isolierten Zellen (0,3-0,5 Millionen) in 3 ml Basalmedium in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert.
   6. Am nächsten Tag: Nehmen Sie das Medium aus der Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit PBS. Fügen Sie 3 mL Basalmedium hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 2 Tage, bis die Zellen zu 90 % zusammenfließen.
      HINWEIS: Beobachten Sie immer die Morphologie der Zellen unter dem inversen Mikroskop, die von rund zu fibroblastenartig wechselt (Abbildung 1H).
3. Expansion von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ADSCs)
   HINWEIS: Sobald die Zellen zu ~90 % konfluent wachsen, fahren Sie mit der Subkultur wie unten beschrieben fort.
   1. Nehmen Sie das Medium aus der Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit PBS. Fügen Sie 0,5 ml/Well Trypsin/EDTA (0,05 % Trypsin; 200 mg/l EDTA) hinzu und inkubieren Sie die Platte für 3-5 Minuten bei 37 °C, um die Zellen zu lösen.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 5 Minuten in Trypsin/EDTA. Die vollständige Ablösung der Zellen sollte unter dem inversen Mikroskop überprüft werden. Der Prozess kann beschleunigt werden, indem vorsichtig auf und ab pipettiert oder an die Seite der Platte geklopft wird.
   2. Inaktivieren Sie das Enzym, indem Sie die Probe 1:1 in DMEM verdünnen, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Antibiotika ergänzt wird.
   3. Teilen Sie die Zellsuspension in 2 Vertiefungen auf und fügen Sie 3 ml Basalmedium hinzu (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika). Über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
   4. Am nächsten Tag das Medium wechseln, dann alle 2 Tage bis zu 90% Konfluenz.
   5. Wiederholen Sie den Vorgang bis zur dritten Passage und fahren Sie mit der Phänotyp- und Funktionscharakterisierung fort.
      HINWEIS: Beobachten Sie immer die Morphologie der Zellen unter dem inversen Mikroskop, die von rund zu fibroblastenartig wechselt.
4. Charakterisierung von Stammzellen aus Fettgewebe (ADSCs)
   1. Phänotypische Charakterisierung durch Durchflusszytometrie
      1. Trennen Sie die Zellen mit Trypsin/EDTA, wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.2 beschrieben.
      2. Die Zellen in einem konischen Röhrchen (50 mL) sammeln und bei 250 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml PBS.
      3. Zählen Sie die Zellen wie in Schritt 2.2.4 beschrieben und säen Sie 0,5-1 x 10⁶ Zellen in 100 μl PBS in einer 96-Well-Platte aus.
         HINWEIS: Die Anzahl der Vertiefungen hängt von der Farbe des Fluorochrom-Konjugats und den Filtern/Lasern des Zytometers ab.
      4. Fügen Sie Antikörper (Tabelle 1) hinzu, verdünnt in 1 % BSA in PBS.
         HINWEIS: Es ist nicht notwendig, den Fc-Block zu verwenden, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden, da wir bereits BSA zur Verdünnung von Antikörpern verwenden. Reservieren Sie eine Zellprobe, ohne Antikörper zu erhalten, die als Kontrolle der Färbung verwendet werden. Die Antikörper können entsprechend dem im Labor verfügbaren Fluorochrom-Farbstoff und Zytometer in derselben Vertiefung kombiniert werden. Alle in Tabelle 1 beschriebenen Antikörper können in dieselbe Vertiefung gegeben werden, mit Ausnahme von CD71 FITC und CD29 FITC, die sich aufgrund des gleichen Fluorochroms in unterschiedlichen Vertiefungen befinden müssen.
      5. Inkubieren Sie die Platte 30 min bei 4 °C im Dunkeln.
      6. Waschen Sie die Zellen, vervollständigen Sie dann das Volumen mit PBS auf 200 μl, zentrifugieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 4 °C bei 252 x g und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
      7. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 200 μl 2 % Formaldehyd in PBS pro Vertiefung hinzufügen. Lagern Sie die Zellen im Dunkeln bei 4 °C bis zur Analyse im Durchflusszytometer.
         HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, entnehmen Sie die Zellen so schnell wie möglich auf dem Durchflusszytometer. Die Helligkeit der Fluoreszenz von Markern nimmt bei den meisten Fluorochromen nach 48 h deutlich ab. Überschreiten Sie also nicht 48 Stunden, um die Platte zu lesen. Empfohlen wird der Erwerb von 30.000 Veranstaltungen.
      8. Verwenden Sie die in Abbildung 2B dargestellte Gating-Strategie, um die ASC-Population auszuwählen.
   2. Funktionelle Charakterisierung: Osteogene Differenzierung
      1. Trennen Sie die Zellen mit Trypsin/EDTA (wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.2 beschrieben), sammeln und zentrifugieren Sie die Zellen (wie in den Schritten 2.4.1.2 und 2.4.1.2 beschrieben) und zählen Sie sie (wie in den Schritten 2.2.4 beschrieben).
      2. Platte, in dreifacher Ausfertigung, 2 x 10⁵ Zellen pro Well in 6-Well-Platten in basaler medialer Form (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika); Bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubieren.
         HINWEIS: Es werden zwei 6-Well-Platten benötigt, eine für jede Differenzierungszeit (14 und 21 Tage).
      3. Am nächsten Tag wird das Medium auf osteogenes Medium umgestellt (Schritt 1.4.1).
         HINWEIS: Reservieren Sie 3 Vertiefungen, die nur mit dem Basalmedium kultiviert werden, das die Kontrolle für die Differenzierung darstellt.
      4. Kulturzellen für 14 und 21 Tage in osteogenen Medien und die Kontrollzellen, wobei das Medium alle 3 Tage gewechselt wird. Fahren Sie mit der Von-Kossa-Färbung (Schritt 1.4.2) fort, um die mineralisierten Knollen am Ende jeder Kulturperiode zu bewerten.
      5. Saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung an und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 2 mL 70%igem Ethanol über Nacht bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Zellen vorsichtig unter fließendem Wasser.
      6. Fügen Sie 2 ml 5%ige Silbernitratlösung hinzu und inkubieren Sie die Platte 1 h lang in ultraviolettem Licht. Waschen Sie die Zellen mit destilliertem Wasser. Fügen Sie 2 ml 5% Natriumthiosulfat hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang. Mit destilliertem Wasser waschen.
      7. Gegenfärbung mit 2 mL Eosin für 40 s. Waschen Sie mit destilliertem Wasser, bis die Färbelösung entfernt ist, und visualisieren Sie die Färbung mit einem optischen Mikroskop.
   3. Funktionelle Charakterisierung: Adipogene Differenzierung
      1. Trennen Sie die Zellen mit Trypsin/EDTA (wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.2 beschrieben), sammeln und zentrifugieren Sie die Zellen (wie in den Schritten 2.4.1.2 und 2.4.1.2 beschrieben) und zählen Sie sie (wie in den Schritten 2.2.4 beschrieben).
      2. Platte: 2 x 10,⁵ Zellen pro Well in 6-Well-Platten, in basal, medial (DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika); Bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubieren.
         HINWEIS: Es werden zwei 6-Well-Platten benötigt, eine für jede Differenzierungszeit (14 und 21 Tage).
      3. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium auf adipogenes Medium (Schritt 2.5.1).
         HINWEIS: Reservieren Sie 3 Vertiefungen, die nur mit dem Basalmedium als Kontrolle kultiviert werden.
      4. Kulturzellen für 14 und 21 Tage in adipogenem Medium, wobei das Medium alle 3 Tage gewechselt wird. Am Ende jeder Kulturperiode fahren Sie mit der Öl-Rot-O-Färbung (Schritte 2.4.3.5-2.4.3.7) fort, einem Indikator für die intrazelluläre Lipidakkumulation.
      5. Saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung an. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen 1 h lang in 2 ml 10% Formalin. Einmal mit PBS waschen und dann einmal mit Wasser.
      6. Mit 2 mL Öl-Rot-O-Lösung in 60%igem Isopropanol 5 min einfärben. Einmal mit destilliertem Wasser waschen.
      7. Gegenfärbung mit 2 mL 1% Hämatoxylin, 1:2 in destilliertem Wasser verdünnt, für 1 min. Waschen Sie mit destilliertem Wasser, bis die Färbelösung entfernt ist, und visualisieren Sie die gefärbten Proben mit einem optischen Mikroskop.
   4. Funktionelle Charakterisierung: Chondrogene Differenzierung
      1. Trennen Sie die Zellen mit Trypsin/EDTA (wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.2 beschrieben), sammeln und zentrifugieren Sie die Zellen (wie in den Schritten 2.4.1.2 und 2.4.1.2 beschrieben) und zählen Sie sie (wie in den Schritten 2.2.4 beschrieben).
      2. 5 x 10⁵ ADSCs in vier konische Polypropylen-Röhrchen geben und bei 450 x g 5 min zentrifugieren, um ein Pellet zu bilden. Entsorgen Sie den Überstand.
      3. Die Pellets werden in einem konischen Röhrchen in einem chondrogenen Medium (Schritt 1.6.1) oder nur einem Basalmedium (Kontrolle der Differenzierung) für 14 und 21 Tage bei 37 °C in 5 % CO₂ kultiviert. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage und vermeiden Sie das Entfernen von Pellets.
         HINWEIS: Jedes Zellpellet bezieht sich auf die jeweilige Kulturzeit sowie auf die jeweiligen Kontrollen, die nur mit Basalmedium gezüchtet werden.
      4. Sammeln Sie am Ende jedes Kulturzeitpunkts die Pellets mit einer Pinzette mit feiner Spitze und legen Sie sie in eine 24-Well-Platte. Fahren Sie mit der histologischen Schnittung und Färbung von Proteoglykanen und Glykosaminoglykanen fort (Schritte 2.4.4.5.-2.4.4.9).
         HINWEIS: Jedes Pellet wird in einer separaten Vertiefung verarbeitet.
      5. Fixieren Sie die Pellets 30 Minuten lang in 2 mL mit 10% gepuffertem Formaldehyd. Entsorgen Sie die Formaldehydlösung und fügen Sie 2 ml 70%iges Ethanol hinzu. Entfernen Sie das Pellet mit einer Spitze aus dem konischen Rohr und betten Sie das Pellet in Paraffin ein.
      6. Mit einem rotierenden Paraffinmikrotom histologische Schnitte von 5 μm herstellen. Die Schnitte werden 15 min lang bei 60 °C inkubiert und zweimal (5 und 15 min) in Xylol getaucht.
      7. Rehydrieren Sie die Proben, indem Sie die histologischen Schnitte jeweils 2 Minuten lang in Alkoholbäder in abnehmenden Konzentrationen (100 %, 96 %, 80 % und 70 %) tauchen und dann 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser spülen.
      8. Fahren Sie fort, die Proben 30 Minuten lang mit Alcianblau 1% in Essigsäure, pH 2,5, zu färben.
      9. 1 Minute lang mit Hämatoxylin gegenfärben und mit destilliertem Wasser waschen. Mit DPX (Eindeckmittel für die Histologie) oder einer anderen Einbettlösung eingravieren und Proben mit einem optischen Mikroskop sichtbar machen.

Ergebnisse

Zellen, die gemäß dem hier vorgestellten Protokoll aus Fettgewebe extrahiert wurden, zeigten eine Morphologie, die den von der ISCT vorgeschlagenen Mindestkriterien für MSCs entsprach. Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Phänotypisch zeigten ADSCs in den ersten Tagen der Zellkultur eine Adhärenz an der plastischen und fibroblastenähnlichen Morphologie (Abbildung 2A). Zudem wuchsen sie homogen und bildeten Kolonien. Darüber hinaus zeigten ADSCs eine geringe Expression von CD34 (2,12 %) und CD45 (1,81 %), beides hämatopoetische Marker, und eine hohe Expression von CD71 (42,6 %), CD29 (74,2 %) und CD90 (55,1 %), alles mesenchymale Zellmarker (Abbildung 2B).

Abbildung 2: Phänotypische Charakterisierung von Zellen aus Fettgewebe. (A) ADSCs-Morphologie, die sich an den Tagen 2, 4 und 8 der Kultur von rund zu fibroblastenartig ändert; Maßstabsbalken = 22,22 μm. (B) Histogramme für Marker, die durch ASC exprimiert (CD71, CD29 und CD90) oder nicht (CD34 und CD45) exprimiert werden. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Miranda et ^al.24 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Funktionell zeigten ADSCs eine Multipotenz zur Differenzierung in Osteoblasten, Adipoblasten und Chondroblasten, wenn sie 14 oder 21 Tage lang in konditionierten Medien für jede Linie kultiviert wurden (Abbildung 3). Die Von-Kossa-Färbung zeigte mineralisierte Knötchen in der extrazellulären Matrix, die für den Osteogeneseprozess charakteristisch sind (Abbildung 3). Die Ölrot-O-Färbung wies Lipidvakuolen im Zytoplasma von ADSCs nach, und die Alcianblau-Färbung bestätigte das Vorhandensein von Glykosaminoglykanen in der extrazellulären Matrix (Abbildung 3). Zusammengenommen haben phänotypische und funktionelle Merkmale die Population von Zellen bestätigt, die aus Nebenhodenfettgewebe als MSCs extrahiert wurden.

Abbildung 3: Funktionelle Charakterisierung von Zellen aus Fettgewebe. Osteogenes, adipogenes und chondrogenes Multilinienpotenzial von ADSC nach 14 und 21 Tagen in Kultur. Maßstabsleiste = 50 μm (obere Platte), 100 μm (mittlere und untere Platte). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Miranda et ^al.24 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die MSCs können aus verschiedenen Geweben extrahiert werden. Obwohl Knochenmark sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen eine häufige Quelle für MSCs darstellt^25,26, haben wir uns in dieser Studie für die Arbeit mit Fettgewebe entschieden, da es reich an MSCs ist, im Körper verteilt ist und leicht zugänglich ist. Als Alternative können aus Fett gewonnene Stammzellen verwendet werden, um MSCs-ähnliche immortalisierte Zellen zu erzeugen²⁷.

Einige Punkte der Extraktion verdienen besondere Aufmerksamkeit für den Erfolg der hier vorgestellten Protokolle. Zunächst heben wir die Sorgfalt bei der Entnahme des Gewebes hervor, die unter aseptischen Bedingungen erfolgen muss. Stellen Sie also sicher, dass die Mäuse vor Beginn der Operation ordnungsgemäß mit 70% Alkohol desinfiziert werden. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, nicht die gleiche Pinzette und Schere zu verwenden, um das Nebenhodenfettgewebe aufzunehmen, um jede Kontaminationsquelle zu vermeiden.

Ein zweites Problem ist die Verarbeitung von Gewebe. Die Fragmente in dem konischen Röhrchen müssen nach einer Inkubationszeit von 10 min bei 37 °C ordnungsgemäß und kräftig geschüttelt werden. Es ist sehr wichtig, das Medium am nächsten Tag und dann alle 2-3 Tage zu wechseln. Es wird empfohlen, die Kultur täglich zu beobachten und dabei die Farbe des Mediums, die Zellform und jegliche Interferenzen in der Umgebung der Kultur zu überprüfen.

Eine dritte Sorge betrifft den besten Zeitpunkt/Durchgang für die MSC-Charakterisierung. Hier empfehlen wir, dies beim dritten Durchgang der Zellen zu tun, aber dies ist nicht zwingend erforderlich. Das hängt vom Ziel der Studie ab. In der dritten Passage haben wir etwa 80% der Zellen als MSCs charakterisiert, was zum Beispiel für die Ziele dieser Studie ausreicht. Die phänotypische Charakterisierung erfolgt durch die Analyse der Expression von hämatopoetischen Markern (z.B. CD34 und CD45) und mesenchymalen Markern (z.B. CD29, CD73, CD90 und CD105). Darüber hinaus betont die International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT)²¹ , dass die ADSCs eine fibroblastenähnliche Morphologie aufweisen und an den Kunststoff der Kulturplattform anhaften sollten. Die Morphologie kann während der Wachstumskultur unter dem Mikroskop beobachtet werden. Die funktionelle Charakterisierung erfolgt durch die Analyse des Potenzials von ADSCs zur Differenzierung in Osteoblasten-, Adipoblasten- und Chondroblastenzellen. Bei der phänotypischen Charakterisierung kann der Prozentsatz der mesenchymalen und hämatopoetischen Marker je nach Tierart und Zellquelle variieren und entspricht nicht vollständig den von der ISCT empfohlenen Zahlen. Zum Beispiel empfiehlt das ISCT für humane MSCs ≥95 % CD105, CD73, CD90 und ≤2 % CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79a oder CD19, humanes Leukozytenantigen - DR-Isotyp (HLA-DR)²¹. Darüber hinaus ist es wichtig, die funktionelle Charakterisierung durchzuführen und die Multipotenz von Zellen zu bestätigen, die sich in Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozytenlinien differenzieren. Mindestens zwei dieser Linien werden zum Nachweis der Multipotenz empfohlen.

Zusätzlich zu diesen hervorgehobenen Punkten können einige hier vorgeschlagene Assays substituiert werden, z. B. Alizarin Red S anstelle der Von Kossa-Färbung, Periodic Acid Shiff anstelle von Alcian Blue und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) anstelle der Durchflusszytometrie.

Unter den drei beim Menschen beschriebenen Arten von Fettgewebe (weiß, braun und beige) hat weißes Fettgewebe die höchste Quelle für MSCs²⁸. Dieses Gewebe kann aus der Unterhaut-, Bauch- und Leistenregion gewonnen werden, wie z. B. das Fett oberhalb der Nebenhoden, von dem hier berichtet wird. Die physikalische Fragmentierung und der enzymatische Verdau durch Kollagenase, die in dem hier geteilten Protokoll verwendet werden, leiten die stromale vaskuläre Fraktion (SVF) ab, die aus vielen Zelltypen besteht, mit Ausnahme der Adipozyten, die während der Verarbeitung erschöpft werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hauptvorteile der Verwendung von Fettgewebe als Quelle für MSCs die Fülle und Einfachheit der Methoden zur Zellisolierung sind, die mit dem therapeutischen Potenzial der MSCs als entzündungshemmende und regenerative Eigenschaften verbunden sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
140 °C; C Sterilisation bei hoher Hitze CO2 Inkubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Essigsäure eiszeitlich	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagenz, geeignet für den Nachweis von Glykoproteinen. 1% in Essigsäure, pH 2,5
Alkohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in Wasser
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antikörper gegen Maus anti-CD29 FITC (Klon Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Funktionen in der Zelle: Adhäsion und Aktivierung, Embryogenese, Leukozyten, DC, Blutplättchen, Mastzellen, Fibroblasten und Endothelzellen
Antikörper Anti-Maus Anti-CD34 PE (Klon RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Funktionen in der Zelle: Zelladhäsionsfaktor. Hämatopoetische Stammzellen
Antikörper Anti-Maus Anti-CD45 APC (Klon 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Funktionen in der Zelle: Hilft bei der Aktivierung von Leukozyten
Antikörper Anti-Maus Anti-CD71 FITC (Klon C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Funktionen in der Zelle: Kontrolliert die Eisenaufnahme während der Zellproliferation. Proliferierende Zellen, Retikulozyten und Vorläufer
Antikörper Anti-Maus Anti-CD90 PerCP (Klon OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Funktionen in der Zelle: Signalweg, Adhäsion. T-Lymphozyten, NK, Monozyten, HSC, Neuronen, Fibroblasten
Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatische Pipetten	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Becherglas	Nicht zutreffend		1 Einheit
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Zellkulturplatten (6-Well)	Merck, Darmstadt, Deutschland	Z707759	07 Einheiten steril. TPP-Gewebekulturplatten
Zellkulturplatten (96-Well. Rund- oder V-Boden)	Merck, Darmstadt, Deutschland	CLS353077	01 Einheit steril. Wells, 96, mit Gewebekultur (TC) behandelte Oberfläche, durchsichtige Wells mit rundem Boden, steriles
chondrogeneses Medium	Stem Pro Chondrogenesis Differenzierung– Life Technologies	A1007101	TGF-β 2, TGF-Β 3, Dexamethason, Insulin, Transferrin, ITS, Natrium-L-Ascorbat, Natriumpyruvat, Ascorbat-2-phosphat
Kollagenase Typ II	Life Technologies, Kalifornien, USA	17101015
Kork- oder Styroporplatte mit Aluminium überzogen	Nicht zutreffend		1 Einheit
Baumwolle	Nicht zutreffend		50 g
Dexamethason	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Präparierschere	Nicht zutreffend		03 Einheiten steriles
DPX Eindeckmittel für die Histologie	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	Mit 1000 mg/L Glucose und L-Glutamin, ohne Natriumbicarbonat, Pulver, geeignet für Zellkultur
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyd	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hämatoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Injektionsnadel (0,3 mm x 13 mm)	Nicht anwendbar		5 Einheiten
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamin-D4-Hydrochloridlösung	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1,0 mg/ml in Methanol (als freie Base), zertifiziertes Referenzmaterial, Cerilliant®
Neubauer Kammer	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND Zählkammer BLAUBRAND Neubauer Muster. Mit Clips, doppellinigen
Nichiryo-Pipettenspitzen (0,1– 10 μ L)	Merck, Darmstadt, Deutschland	Z645540	Volumenbereich 0,1– 10 μ L, länglich, Großpackung. Sterile
Nichiryo Pipettenspitzen (1– 10 mL)	Merck, Darmstadt, Deutschland	Z717401	Volumenbereich 1– 10 mL, universell, Großpackung. Sterile
Nichiryo Pipettenspitzen (200 μ L)	Merck, Darmstadt, Deutschland	Z645516	Maximales Volumen 200 μ L, graduiert, Ministack. Steriles
Öl-Rot-O-Lösung	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0,5 % in Isopropanol-Paraffin
	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46– 48, in Blockform
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Lösung stabilisiert, mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin/ml, 0,1 μ m filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Pulver, pH 7,4, zur Herstellung von 1 L Lösungen. Konische und sterile
Röhrchen aus Polypropylen (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
konische Röhrchen aus Polypropylen (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	Einheiten steriles
Skalpell (optional)	Nicht anwendbar		1 Einheit
Silbernitrat	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Natriumthiosulfat	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Chirurgische Pinzette (15 cm)	Nicht anwendbar		3 Einheiten sterile
Schweizer männliche Mäuse (6– 8 Wochen)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
Spritze (1 mL)	Nicht anwendbar		1 Stück
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0,4%, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkultur
Trypsin/EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-Glycerophosphat Dinatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, geeignet für Zellkultur, geeignet für pflanzliche Zellkultur, ≥ 99% (Titration)