Vergleich zweier repräsentativer Methoden zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in mesenchymale Stromazellen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in mesenchymale Stromazellen (MSCs). Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus. Die Methode der Embryoidkörper (EBs) zeichnet sich durch einen geringeren Zeitaufwand aus.

Abstract

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind adulte pluripotente Stammzellen, die in der regenerativen Medizin weit verbreitet sind. Da MSCs aus somatischem Gewebe durch begrenzte Spende, Qualitätsschwankungen und Biosicherheit eingeschränkt sind, haben in den letzten 10 Jahren die Bemühungen, MSCs aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu erzeugen, stark zugenommen. Frühere und neuere Bemühungen zur Differenzierung von hiPSCs in MSCs konzentrierten sich auf zwei Kulturmethoden: (1) die Bildung von Embryoidkörpern (EBs) und (2) die Verwendung von Monolayer-Kulturen. Dieses Protokoll beschreibt diese beiden repräsentativen Methoden zur Ableitung von MSC aus hiPSCs. Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile, einschließlich Zeit, Kosten, Zellproliferationsfähigkeit, der Expression von MSC-Markern und ihrer Fähigkeit zur Differenzierung in vitro. Dieses Protokoll zeigt, dass beide Methoden reife und funktionelle MSCs aus hiPSCs ableiten können. Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus, während sich die EB-Methode durch einen geringeren Zeitaufwand auszeichnet.

Introduction

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind aus dem Mesoderm gewonnene adulte pluripotente Stammzellen¹. MSCs sind in fast allen Bindegeweben vorhanden². Seit MSCs in den 1970er Jahren entdeckt und 1987 von Friedenstein et al.3,4,5 erfolgreich aus dem Knochenmark isoliert wurden, wurde eine Vielzahl von menschlichen somatischen (einschließlich fetaler und adulter) Gewebe wie Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskeln, Fettgewebe und hämatopoetisches unterstützendes Stroma zur Isolierung von MSCs verwendet 1,2....

Protocol

1. Wartung von hiPSCs

1. Auftauen von hiPSC
   1. Nehmen Sie die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auf. Die auftauenden Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen überführt, das mit 3 ml iPSC-Erhaltungsmedium vorbereitet ist (Materialtabelle). Mischen Sie das Medium vorsichtig.
   2. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml iPSC-Erhaltungsmedium mit 10 μM Y-27632 (Pitaptieren Sie die Zellen 2-3 Mal nach oben und unten).
   3. Die Zellsuspension wird in eine 6-Well-Gewebekultur....

Results

In Anlehnung an das Protokoll (Abbildung 1A) wurden hiPSCs mit Hilfe der EB-Bildung und der Monolayer-Kulturmethode in MSCs differenziert. Während der Differenzierung zeigten die Zellen unterschiedliche repräsentative Morphologien (Abbildung 1B,C).

Wie in Abbildung 1B dargestellt, zeigen die hiPS-Kolonien vor der Differenzierung eine typische kompakte Morphologie mit einem klaren Rand, de.......

Discussion

In diesem Protokoll wurden zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in MSCs untersucht 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Beide Methoden waren in der Lage, MSCs aus hiPSCs .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarinrot Färbeset	Beyotime  Biotechnologie	C0148S
Anti-Mensch-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-Mensch-CD34 (FITC)	Biolegende	343503
Anti-Mensch-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-Mensch-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-Mensch-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbinsäure	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Kohlendioxid-Schüttler	Crystal	CO-06UC6
Kompensationsperlen	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethason	Beyotime  Biotechnologie	ST1254
DMEM/F12  Medium	Servicebio	G4610
Fötales Rinderserum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stammzelle	78003.1
Gelatine	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
humane IgG1-Isotypkontrolle APC	BioLegend	403505
humane IgG1-Isotypkontrolle FITC	BioLegend	403507
humane IgG1-Isotypkontrolle PE	BioLegend	403503
Human TGF-β 1	Stammzelle	78067
TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime  Biotechnologie	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime  Biotechnologie	P3376
iPSC-Erhaltungsmedium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime  Biotechnologie	C0341-10mL
Matrigel, Wachstumsfaktor reduziert	BD Corning	354230
Oli Red O Färbekit	Beyotime  Biotechnologie	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Natriumpyruvat	ThermoFisher	11360-070
TGFβ 3	Novoprotein	CJ44
Toluidinblau-Färbekit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzym(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-Glycerophosphat	Solarbio	G8100