Pflege in Gefangenschaft und Giftextraktion von Tityus serrulatus (Brasilianischer Gelber Skorpion) zur Herstellung von Gegengift

Zusammenfassung

Hier stellen wir erfolgreiche Erhaltungs- und Giftextraktionsprotokolle für die großflächige Haltung von Tityus serrulatus Lutz und Mello, 1922 (brasilianischer gelber Skorpion) vor, mit dem Ziel, Gift für die anschließende Skorpion-Gegengiftproduktion bereitzustellen, um den Bedarf des brasilianischen Gesundheitssystems zu decken.

Zusammenfassung

Die Vergiftung durch Skorpione ist in mehreren tropischen und subtropischen Ländern ein Problem der öffentlichen Gesundheit. Tityus serrulatus Lutz und Mello, 1922 (brasilianischer gelber Skorpion) sind für etwa 150.000 Vergiftungsfälle pro Jahr in Brasilien verantwortlich, von denen 10 % eine Gegengiftbehandlung erfordern, um lebensbedrohliche Giftwirkungen rückgängig zu machen. Daher werden Tausende von T. serrulatus-Individuen unter kontrollierten Gefangenschaftsbedingungen gehalten, um Gift zu extrahieren, das anschließend für die Herstellung des nationalen Vorrats an Skorpion-Gegengift verwendet wird. Das Instituto Butantan ist das wichtigste Labor zur Herstellung von Gegengiften in Brasilien und liefert etwa 70.000 Fläschchen mit Skorpion-Gegengift für das brasilianische Gesundheitssystem. Daher sind die Haltungsprotokolle und Giftextraktionsmethoden Schlüsselpunkte für den Erfolg einer großflächigen, standardisierten Giftproduktion. Das Ziel dieses Artikels ist es, die Protokolle für die Haltung von T. serrulatus in Gefangenschaft zu beschreiben, einschließlich der Haltungsroutine und der Verfahren zur Giftextraktion, der Einhaltung guter Herstellungspraktiken und der Gewährleistung des Tierschutzes. Diese Praktiken ermöglichen die Haltung von bis zu 20.000 Tieren in Gefangenschaft, mit einer Routine von 3.000 bis 5.000 Skorpionen, die monatlich gemolken werden, je nach Bedarf an Gegengiften, was eine durchschnittliche positive Extraktion von 90 % erreicht.

Einleitung

Skorpione sind Gliederfüßer der Klasse Arachnida, Ordnung Scorpiones, die etwa 2.621 Arten umfasst ^1,2. Diese Tiere haben ein großes geografisches Verbreitungsgebiet und sind auf allen Kontinenten außer der Antarktis¹ vertreten. Vergiftungen, die durch Skorpione verursacht werden, führen jedes Jahr weltweit zur Morbidität oder zum Tod von Tausenden von Menschen³. Im Jahr 2019 gab es schätzungsweise mehr als 1,2 Millionen Unfälle und 3.500 Todesfälle pro Jahr, die durch diese Tiere verursacht wurden. In Brasilien steigt die Zahl der Fälle exponentiell an und erreicht seit 2017 mehr als 100.000 Fälle pro Jahr ^4,5,6. Die in den letzten Jahrzehnten in Brasilien beobachtete unkontrollierte Verstädterung ohne angemessene Abwasserbehandlung und regelmäßige Sammlung und Entsorgung von Müll, die mit Umweltzerstörung und Klimaveränderungen einhergeht, hat die Bedingungen für die Vermehrung invasiver Skorpione wie T. serrulatus geschaffen, die den Kontakt mit Menschen erhöhen und so zu schädlichen Unfällen führen 4,7,8 . Es gibt etwa 178 Skorpionarten in Brasilien, aber Stiche von medizinischer Bedeutung werden durch die Gattung Tityus verursacht, wobei vier Arten (T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus und T. obscurus) medizinisch bedenklich sind, wobei Tityus serrulatus für die schwersten Fälle und Todesfälle verantwortlich ist ^7,9.

Das Instituto Butantan ist das wichtigste Labor zur Herstellung von Gegengiften in Brasilien und liefert etwa 70.000 Fläschchen mit Skorpion-Gegengift für das brasilianische Gesundheitssystem. Kurz gesagt, die Schritte bei der Herstellung von Gegengiften umfassen die Inokulation von aus Gift gewonnenen Antigenen bei Pferden, die Sammlung und Reinigung von reichhaltigem Antikörperplasma, was zu 5-ml-Fläschchen mit Skorpion-Gegengift führt. Jede Durchstechflasche ist in der Lage, mindestens 1 mg Skorpiongift pro ml Gegengift zu neutralisieren. Das Arthropoden-Bioterium ist ein integraler Bestandteil des Industriezentrums, das für die Bereitstellung des Ausgangsmaterials für das Gegengift des Skorpions verantwortlich ist.

Das Arthropoden-Bioterium am Instituto Butantan hieß ursprünglich Labor für Arthropoden und wurde 1967 gegründet. Erst 1995 zog das Labor in eine exklusive Einrichtung um, die der Unterbringung von Giftarthropoden gewidmet ist^10,11. Zu dieser Zeit wurden die Skorpione in einem Raum von 12^m2 ohne kontrollierte Temperatur gehalten und auf etwa 13 Gehege verteilt, in denen jeweils maximal 300 Tiere untergebracht waren¹⁰. Aufgrund der im Laufe der Jahre steigenden Nachfrage nach Gift und der daraus resultierenden Notwendigkeit, die Anzahl der Tiere zu erhöhen, sowie Verbesserungen im Giftextraktionsprozess kam es 2016 zu einer großen Veränderung. Das Labor wurde in das Industriezentrum des Instituto Butantan integriert und in Arthropods Bioterium umbenannt. Darüber hinaus zog das Bioterium 2016 in eine neue, eigens dafür gebaute Anlage um. Der neue Skorpionraum erstreckt sich über eine Fläche von 24^m2 und enthält ca. 48 Polypropylen-Gehege, in denen jeweils bis zu 300 Tiere untergebracht sind, wie in Abbildung 1 dargestellt. Dies führt dazu, dass insgesamt 10.000 bis 20.000 Individuen unter kontrollierten Bedingungen in Gefangenschaft gehalten werden, mit Schwankungen im Laufe des Jahres. Die Skorpione werden sorgfältig unter strengen Haltungsprotokollen gehalten, um ihr Wohlergehen zu gewährleisten und gleichzeitig die hohen Produktionsanforderungen zu erfüllen und gute Praktiken und ethische Standards für die Tierpflege einzuhalten. Für die Giftextraktion wurde ein spezieller Raum entworfen und gebaut, in dem zwei Luftstromschränke untergebracht sind, wie in Abbildung 2A dargestellt. Diese Schränke dienen als Sicherheitsmaßnahmen, um zu verhindern, dass Techniker während des Extraktionsvorgangs Giftpartikel einatmen. Persönliche Schutzausrüstung (PSA) ist für die Techniker obligatorisch, einschließlich synthetischer Schürzen und FFP2-Masken, um eine Kontamination zu vermeiden und ihre Sicherheit zu gewährleisten.

Abbildung 1: Gesamtansicht des Skorpionraums des Arthropoden-Bioteriums. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Arbeitsbereich. (A) Gesamtansicht des Giftextraktionsraums des Arthropoden-Bioteriums. (B) Arbeitsfläche des Airflow-Schranks. Alle Materialien und Geräte werden vorbereitet und auf der Arbeitsfläche des Airflow-Schranks angeordnet. Der schwarze Pfeil zeigt das Elektrostimulatorgerät und der rote Pfeil die Zange an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Etwa 90 % der T. serrulatus-Skorpione im Arthropoden-Bioterium stammen von verschiedenen Standorten, die von kommunalen Gesundheitsbehörden im Rahmen eines Überwachungs- und Kontrollprogramms für diese Tiere gesammelt wurden. Die Skorpione werden in städtischen Gebieten gefangen und dann im Rahmen eines Kooperationsprogramms an das Instituto Butantan geschickt. T. serrulatus Skorpione sind parthenogenetisch, was bedeutet, dass die Geburt als Folge der Entwicklung von Nachkommen aus unbefruchteten Eizellen erfolgt, ohne dass ein Individuum des anderen Geschlechts anwesend ist¹². Aufgrund dieser Art der Fortpflanzung werden einige Tiere in unserer Einrichtung in Gefangenschaft geboren und bis zum Erreichen der Erwachsenenphase gehalten, wobei ein ähnliches Haltungsprotokoll wie unten beschrieben befolgt wird. Sobald sie das Erwachsenenstadium erreicht haben, werden sie der Giftextraktionsroutine hinzugefügt. Nach ihrer Ankunft werden die Skorpione einem ersten Screening unterzogen, und diejenigen, die sich in einem guten Gesundheitszustand befinden, werden in Sammelgehegen mit maximal 350 Individuen gehalten, die nach ihrer Herkunft unterteilt sind. Für jedes Gehege wird täglich ein Kontrollformular ausgefüllt, das Daten über das Datum der Fütterung und die Art der angebotenen Beute (Grille oder Schaben), die Wasserversorgung, die Reinigungsverfahren, die Anzahl der toten Tiere und die Anzahl der verbleibenden lebenden Tiere im Gehege enthält.

In einem vorher festgelegten Programm werden die Tiere einer elektrischen Stimulation unterzogen, und das resultierende Gift von Hunderten von Individuen wird dann lyophilisiert, was zu Chargen gefriergetrockneten Giftes führt. Das aus diesem Prozess gewonnene standardisierte Gift ist für die Immunisierung von Pferden als Teil des Herstellungsprozesses sowie als Referenzmaterial für die Qualitätskontrolle des Wirkstoffs und des Endprodukts bestimmt.

Es gibt nur sehr wenige Einrichtungen auf der Welt, die in der Lage sind, eine so große Anzahl von Skorpionen zu halten und die Menge der Giftextraktionen in Übereinstimmung mit guten Herstellungspraktiken und ethischer Verwendung der Tiere durchzuführen, wie dies im Arthropods Bioterium des Instituto Butantan geschieht. Daher ist es unser Ziel, die Skorpion-Erhaltungsprotokolle und Giftextraktionsverfahren zu beschreiben, die in der Haltung von T. serrulatus verwendet werden und die erfolgreich die notwendige Menge an Gift für die Produktion von Skorpion-Gegengift liefern.

Protokoll

Protokolle, die wirbellose Tiere betreffen, sind von der Genehmigung durch den Ausschuss für die Verwendung und Pflege von Tieren des Instituto Butantan ausgenommen. Die hier beschriebene Haltung von Skorpionen folgt jedoch ethischen Parametern, und der Tierschutz wird entsprechend den Bedürfnissen der Art respektiert.

1. Wohnen

1. Halten Sie die Skorpione in gemeinschaftlichen Polypropylenbehältern als Gehege (Höhe 35 cm, Breite 35,5 cm, Länge 72 cm) mit maximal 350 Tieren.
2. Halten Sie den Raum, in dem die Tiergehege untergebracht sind, bei einer kontrollierten Temperatur von 24 °C (±0,5 °C) in einem Lichtzyklus von 10 Stunden bei eingeschaltetem Licht und 14 h bei ausgeschaltetem Licht.
3. Den Gehegeboden (Boden) jedes Behälters mit Kraftpapier auslegen, das an den Rändern an allen Seiten mit Kreppband befestigt ist, damit die Tiere nicht unter das Papier gelangen können (Abbildung 3A).
4. Verwenden Sie vier Pappschalen (Eierschalen) als vertikale Substrate, die auf einer Seite des Behälters gestapelt sind, wobei zwischen jedem Tablett eine starre Pappfolie platziert wird (Abbildung 3B, C).
5. Stellen Sie auf der gegenüberliegenden Seite des Geheges eine flache Polypropylenschale (Wasserschale) auf, die getränkte Baumwolle als Wasserquelle für die Tiere enthält (Abbildung 3B).
6. Bewahren Sie die Behälter ohne Deckel auf, um den Luftstrom zu erhöhen. Legen Sie einen ca. 10 cm langen Streifen selbstklebendes Kunststoffband auf die Oberseite der Innenfläche des Geheges und an die oberen Ecken, um die Wände glatt genug zu machen, damit die Tiere nicht aus dem Behälter entkommen können (Abbildung 3A).

Abbildung 3: Gehäuse- und Gehäusevorbereitung . (A) Pfeile zeigen das Kraftpapier auf der Unterseite, das an den Rändern mit Kreppband befestigt ist. Gestrichelte Linien zeigen das selbstklebende Kunststoffband an, das auf der Oberseite der Innenfläche des Gehäuses angebracht ist. (B) Vertikales Substrat (Eierschalen auf einer Seite des Behälters) und eine flache Polypropylenschale (Wasserwanne) auf der gegenüberliegenden Seite. (C) Vertikales Substratdetail: Eierschalen mit einer starren Pappfolie zwischen zwei Schalen. (D) Pappbögen und Eierschalen, die in Schichten angeordnet sind und den natürlichen, dunklen und feuchten Lebensraum von T. serrulatus simulieren. (E) Tiere, die im Substrat untergebracht sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Hygiene-Routine

HINWEIS: Die Hygieneroutine ist in zwei Wartungsverfahren unterteilt: vollständige und teilweise Wartung. Die erste wird 2 Tage nach der Fütterung der Tiere oder bei Auswahl des Geheges für die Giftextraktion durchgeführt. Die teilweise Wartung wird durchgeführt, wenn die Tiere nicht gefüttert werden.

1. Komplette Wartung
   1. Bereiten Sie ein sauberes Gehäuse mit neuem Substrat (Eierschalen, Pappe und Kraftpapier) und einer Schale mit sauberem Wasser vor, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
   2. Entferne die Wasserschale mit einer langen Pinzette aus dem Gehäuse. Wenn sich Skorpione auf der Wasserschale befinden, entfernen Sie diese und stellen Sie sie in das saubere Gehäuse.
   3. Wiederholen Sie den in Schritt 2.1.2 beschriebenen Vorgang mit allen Eierschalen und Pappbögen, entfernen Sie alle Skorpione und legen Sie sie in das saubere Gehäuse.
   4. Entfernen Sie nach dem Entfernen der Schalen alle Skorpione, die auf dem Boden des Geheges verblieben sind, und legen Sie sie in das saubere Gehäuse. Achten Sie darauf, alle Kadaver zu berücksichtigen und ordnungsgemäß zu entsorgen. Sammle alle verbliebenen lebenden Beutetiere (Insekten) ein und entferne sie aus dem Gehege.
   5. Entfernen Sie alle Einwegsubstrate aus dem Gehäuse (Eierschalen, Pappe und Kraftpapier) und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß. Schicken Sie die wiederverwendbaren Gegenstände (Wasserschale und Polypropylenbehälter) zur Desinfektion.
      HINWEIS: Die Desinfektion der wiederverwendbaren Artikel erfolgt mit 0,5 % Hypochlorit in Kombination mit einem neutralen Reinigungsmittel. Es ist zwingend erforderlich, dass die Materialien nach der Verwendung von Hygieneprodukten oder -lösungen gründlich und reichlich mit fließendem Wasser abgespült werden.
2. Teilweise Wartung
   HINWEIS: Die Teilwartung besteht darin, alle Substrate (Eierschalen und Kraftpapier) zu inspizieren, um tote Skorpionkadaver und andere unerwünschte Ablagerungen zu entfernen, ohne jedoch die Substrate zu entsorgen oder das Gehäuse zu wechseln.
   1. Führen Sie die Inspektion mit einer langen Pinzette durch, um jede Eierschale vorsichtig anzuheben und den Abfall zu entfernen.
   2. Ersetzen Sie bei Bedarf eine oder mehrere Eierschalen durch eine saubere.
   3. Ersetzen Sie die Wasserschale mit einer langen Pinzette vollständig durch eine saubere. Übertragen Sie alle Skorpione auf der Wasserschale in die Eierschale in einem anderen Teil des Geheges.

3. Fütterung

1. Füttern Sie die Tiere alle 15 Tage gemäß dem Giftextraktionsplan. Füttern Sie Tiere, die 7 Tage vor und 7 Tage nach der Giftextraktion gemolken werden.
2. Für die Fütterung abwechselnd Schaben (Phoetalia pallida) und Grillen (Gryllus sp.) bereitstellen.
3. Berechnen Sie die Futtermenge entsprechend der Energieaufnahme der Tiere; Biete 1 Beute für jeweils 3 oder 5 Skorpione im Gehege an.
4. Zählen Sie die berechnete Menge an Beutetieren und legen Sie sie lebendig in das Gehege, wobei Sie sie 2 Tage lang stehen lassen, bevor sie vollständig gewartet werden (Abschnitt 2.1).
5. Wenn Sie Kakerlaken anbieten, tragen Sie eine Kalziumkarbonat-Alkohol-Lösung auf die Oberseite der Gehege auf. Die Lösung führt dazu, dass die Kakerlaken ausrutschen und nicht in der Lage sind, die Seitenfläche des Geheges zu erklimmen, wodurch die Insekten daran gehindert werden, zu entkommen.

4. Gift-Extraktion

HINWEIS: Die Tiere, die in der Giftextraktionsroutine verwendet werden, sind erwachsene oder präadulte Tiere. Aufgrund der Schwierigkeit, die vollständige Geschlechtsreife des brasilianischen Gelbskorpions (adulte Phase) zu bestimmen, wurde festgestellt, dass Tiere mit einer Gesamtkörperlänge von 5 bis 7 cm für das Verfahren in Frage kommen.

1. Melken Sie jedes Tier alle 2-3 Monate.
2. Am Tag der Giftentnahme werden alle lebenden Tiere im Gehege gezählt und mit einer langen Pinzette in einen Glasbehälter umgefüllt (Abbildung 4).
3. Bereiten Sie alle Materialien und Geräte vor, die auf der Arbeitsfläche des Luftstromschranks verwendet werden sollen, und ordnen Sie sie an. Stecken Sie das Netzkabel des Elektrostimulators in die Steckdose und schalten Sie den Elektrostimulator und den Luftstromschrank ein (Abbildung 2B).
   1. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die Parameter des Elektrostimulators: Potential (Differenz des Potentials zwischen den Elektroden): 540 mV, Spannung (Dauer des elektrischen Impulses): 2 ms, Wirkung (Intervall zur Mäßigung der verwendeten Potenz, wodurch die Erwärmung des organischen Telson-Gewebes reduziert würde): 70%, Zyklus (Anpassung der zyklischen Wiederholung): 1 s, und Intensität (elektrischer Strom, der durch den Muskel des Tieres zirkuliert): 0,75 mA.
4. Halten Sie jedes Tier manuell so fest, dass der Telson stillsteht, und befolgen Sie die folgenden Schritte:
   1. Halten Sie das Metassom des Tieres mit einer geraden Pinzette fest (Abbildung 5A).
   2. Immobilisieren Sie das Telson mit einer gebogenen Pinzette (Abbildung 5B).
   3. Halten Sie den Telson mit der Hand fest (Abbildung 5C,D).
5. Bringen Sie das Telson nach dem Fixieren in direkten Kontakt mit dem Leiter des Elektrostimulators, ohne dass eine leitfähige Lösung verwendet werden muss. Der elektrische Schlag bewirkt eine unwillkürliche Muskelkontraktion der Giftdrüse und damit den Ausstoß des Giftes.
6. Sammeln Sie die Gifttropfen direkt in ein Mikroröhrchen aus Kunststoff, das in der Nähe des Elektrostimulatorleiters platziert wird (Abbildung 6).
7. Als nächstes entlässt du das Tier wieder in den Glasbehälter und befolgst dabei die folgenden Schritte:
   1. Übertragen Sie das Telson des Tieres von der Hand auf die gebogene Pinzette.
   2. Legen Sie das Tier vorsichtig auf den Boden des Glasbehälters.
8. Führen Sie die Schritte 4.4-4.7 mit jedem Tier im Glasbehälter durch.
9. Nachdem alle Tiere im Glasbehälter gemolken wurden, setzen Sie sie wieder in das Gehege.
10. Lagern Sie das aufgefangene Gift bei -20 °C bis zum Gefriertrocknungsprozess.

Abbildung 4: Skorpione im Glasbehälter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Fixierungsverfahren zur Giftextraktion. (A) Metassoma wird mit einer geraden Pinzette fixiert (schwarzer Pfeil). (B) Telson mit gebogener Pinzette immobilisiert (schwarzer Pfeil). (C) Übertragung des gefesselten Telsons von der Zange auf die Hand. (D) Telson wird mit der Hand gefesselt. Es wird empfohlen, die Tiere mit bloßen Händen anzufassen, da die Skorpione bei der Verwendung von Handschuhen das Material mit ihren Krallen greifen können, was das Befreien am Ende des Eingriffs erschwert und die Unfallgefahr erheblich erhöht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Giftextraktion. Ein Mikroröhrchen aus Kunststoff (weißer Pfeil), das in der Nähe des Elektrostimulators (gelber Pfeil) platziert wird. Die Gifttropfen werden direkt in das Röhrchen gesammelt, das während des Eingriffs auf Raumtemperatur gehalten wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Für jedes Verfahren wurden dreißig Standardarbeitsanweisungen (SOPs) entwickelt, die die Wiederholbarkeit der Verfahren unter den Technikern und die Einhaltung der Qualitätsparameter gewährleisten. Die durchschnittliche Sterblichkeitsrate nach dem Extraktionsverfahren liegt bei etwa 12 %, was angesichts der Elektrostimulationsroutine und der Umgebung in Gefangenschaft, in der Stressfaktoren durch die Anwendung der Verfahren erfolgreich reduziert werden, als niedrig angesehen werden kann.

Um di...

Diskussion

Die Anwendung der beschriebenen Methoden ermöglicht es uns, eine große Anzahl von T. serrulatus-Individuen zu halten und gibt uns eine konsistente Vorhersagbarkeit der Anzahl der Skorpione, die für die jährliche Giftproduktion benötigt werden. Auf diese Weise sind wir in der Lage, genügend Giftchargen im Voraus bereitzustellen, um den Herstellungsprozess des Gegengiftes zu liefern. Gleichzeitig ist die Entwicklung von vorgefertigten Zeitplänen für die Wartung, Fütterung und Giftextraktion ein wesentlicher Bestan...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kartonbogen	NA	NA
Eierablage	NA	NA	Karton 36 Plätze Eierablage
Elektrostimulator	Instituto Butantan	ART-FV-01	Intern für die Giftabsaugung konzipiert
Kraftpapier	NA	NA	Normales
Kraftpapier Bastelband	NA	NA	Weißes Kreppband (24 mm x 50 m)
Polypropylen-Behälter	NA	NA	70 L Polypropylen-Schachtel (H – 35 cm, B – 35,5 cm, L - 72 cm)
Polypropylen-Tablett	NA	NA	Polypropylen-Tablett (H – 3,0 cm, B – 18,5 cm, L - 30 cm)
Selbstklebender Kunststoff	NA	NA