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Methodenartikel

Identifizierung, Diagnose und Einstufung bösartiger peripherer Nervenscheidentumoren in gentechnisch veränderten Mausmodellen

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DOI:

10.3791/65740

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17. Mai 2024

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben eine Methodik entwickelt, um zu beurteilen, ob Neubildungen des Nervensystems in gentechnisch veränderten Mäusen die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke genau rekapitulieren. Hier wenden wir diese histologischen Techniken, definierten pathologischen Kriterien und Kulturmethoden auf Neurofibrome und maligne periphere Nervenscheidentumoren an, die im P 0-GGFβ3-Mausmodell auftreten.

Zusammenfassung

Patienten mit dem autosomal-dominanten Tumoranfälligkeitssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) entwickeln häufig plexiforme Neurofibrome (PNs), die sich anschließend in hochaggressive maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) verwandeln. Das Verständnis des Prozesses, durch den sich ein PN in ein MPNST verwandelt, würde durch die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEM) erleichtert, die das PN-MPNST-Fortschreiten beim Menschen mit NF1 genau replizieren. Leider rekapitulieren GEM-Modelle mit Nf1-Ablation diesen Prozess nicht vollständig. Dies führte uns zur Entwicklung von P 0-GGFβ3-Mäusen, einem GEM-Modell, in dem die Überexpression des Schwann-Zell-Mitogens Neuregulin-1 (NRG1) in Schwann-Zellen zur Entwicklung von PNs führt, die sich mit hoher Frequenz zu MPNSTs entwickeln. Um jedoch festzustellen, ob die Tumorgenese und die neoplastische Progression in P 0-GGFβ3-Mäusen die bei NF1-Patienten beobachteten Prozesse genau modellieren, mussten wir zunächst nachweisen, dass die Pathologie von P0-GGFβ3-Tumoren der peripheren Nervenscheide die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke rekapituliert.

Hier beschreiben wir die spezialisierten Methoden, die zur genauen Diagnose und Bewertung von Neoplasien des peripheren Nervensystems in GEM-Modellen verwendet werden, wobei P 0-GGFβ3 und P0-GGFβ3 verwendet werden; Trp53+/- Mäuse als Beispiel. Wir beschreiben die histologischen, immunhistochemischen und histochemischen Methoden, die zur Diagnose von PNs und MPNSTs verwendet werden, wie man diese Neoplasien von anderen Tumorarten unterscheidet, die ihre Pathologie nachahmen, und wie man diese Neoplasien einstuft. Wir diskutieren die Etablierung von Frühpassagekulturen aus GEM-MPNSTs, wie diese Kulturen mit Hilfe der Immunzytochemie charakterisiert werden können und wie ihre Tumorigenität durch die Etablierung von Allotransplantaten verifiziert werden kann. Zusammengenommen charakterisieren diese Techniken die Pathologie von PNs und MPNSTs, die in GEM-Modellen auftreten, und vergleichen die Pathologie dieser murinen Tumoren kritisch mit ihren menschlichen Gegenstücken.

Einleitung

In den letzten drei Jahrzehnten haben zahlreiche Laboratorien versucht, Mausmodelle für menschliche Krebserkrankungen zu erstellen, indem sie menschliche krebsassoziierte Mutationen in das Mausgenom einführten oder ein Genprodukt überexprimierten, das bei menschlichen Krebsarten überexprimiert wird. Die resultierenden gentechnisch veränderten Mausmodelle (GEM) können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, z. B. um festzustellen, dass die neu eingeführte genomische Modifikation die Tumorentstehung einleitet, um andere später auftretende genetische oder epigenetische Veränderungen zu identifizieren, die zur Tumorprogression beitragen, und um die wichtigsten Signalwege zu definieren, die die Tumorinitiierung und -progression vorantreiben. Im Gegensatz zu orthotopen Xenotransplantatmodellen, die auf der Verwendung von immundefizienten Mäusen beruhen, verfügen GEM-Krebsmodelle über ein voll funktionsfähiges Immunsystem und modellieren daher das Ansprechen auf Therapeutikakandidaten genauer. Bei der Verwendung von GEM-Krebsmodellen für solche Zwecke ist es jedoch wichtig, dass die Forscher bestätigen, dass Beobachtungen mit GEM-Neoplasien für ihre menschlichen Kollegen relevant sind. Diese Validierung sollte eine gründliche Beurteilung der Pathologie der GEM-Neoplasien und eine Feststellung umfassen, ob die pathologischen Merkmale der GEM-Neoplasien die Pathologie des entsprechenden menschlichen Tumortyps rekapitulieren.

Das Tumoranfälligkeitssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist die häufigste genetische Erkrankung des menschlichen Nervensystems und tritt bei etwa 1 von 3.000-3.500 Lebendgeburten auf 1,2,3. Personen, die von NF1 betroffen sind, entwickeln mehrere gutartige periphere Nervenscheidentumoren, die als Neurofibrome bekannt sind, in ihrer Haut (dermale Neurofibrome) und in großen Nerven und Nervengeflechten (plexiforme Neurofibrome). Während sowohl dermale als auch plexiforme Neurofibrome die Lebensqualität des Patienten verschlechtern, indem sie körperliche, verhaltensbezogene und/oder soziale Beeinträchtigungen hervorrufen, sind plexiforme Neurofibrome (PNs) besonders gefährlich 4,5. Dies liegt daran, dass sich PNs häufig in bösartige periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) verwandeln, bei denen es sich um aggressive Spindelzellneoplasien mit einer außergewöhnlich niedrigen Überlebensrate handelt 1,2. Diese niedrige Überlebensrate ist zum großen Teil darauf zurückzuführen, dass die derzeit zur Behandlung von MPNSTs verwendeten Radio- und Chemotherapien unwirksam sind. Die Entwicklung neuer, wirksamerer Therapien war jedoch eine Herausforderung. Dies liegt daran, dass MPNSTs trotz der Häufigkeit des Auftretens bei NF1-Patienten immer noch seltene Neoplasien sind. Infolgedessen ist es sehr schwierig, eine große Anzahl menschlicher Tumore für Studien zu erhalten. es ist auch schwierig, genügend Patienten mit MPNSTs für klinische Studien zu rekrutieren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere GEM-Modelle erstellt, mit dem Ziel, weitere Einblicke in die Anomalien zu gewinnen, die die Pathogenese des Neurofibroms und die PN-MPNST-Progression vorantreiben, und präklinische Studien mit Therapeutikakandidaten zu erleichtern.

NF1-Patienten haben inaktivierende Mutationen in einer Kopie des NF1-Gens. Die Neurofibrom-Pathogenese wird ausgelöst, wenn eine inaktivierende Mutation im verbleibenden funktionellen NF1-Gen in einer Zelle der Schwann-Zelllinie auftritt. Überraschenderweise entwickelten Mäuse, die mit keimbahninaktivierenden Nf1-Mutationen erzeugt wurden, keine Neurofibrome 6,7. Der anschließende Nachweis, dass Mäuse mit Nf1-null-Schwann-Zellen und Nf1-Haploinsuffizienz in allen anderen Zelltypen (Krox20-Cre;Nf1flox/- Mäuse) entwickelten plexiformen Neurofibromen deuteten darauf hin, dass eine reduzierte Nf1-Gendosis in zusätzlichen Zelltypen für die Neurofibrom-Pathogenese erforderlich war8. Selbst dann sind die plexiformen Neurofibrome in Krox20-Cre; Nf1flox/- Mäuse entwickelten sich nicht zu MPNSTs und ahmten daher die Biologie ihrer menschlichen Gegenstücke nur teilweise nach. Die MPNST-Pathogenese trat auf, wenn Nf1-Mutationen mit Mutationen in zusätzlichen Tumorsuppressorgenen wie Trp539 oder Cdkn2a10 verpartnert wurden, aber MPNSTs in diesen GEM-Modellen entwickelten sich de novo oder aus atypischen neurofibromatösen Neoplasien mit unsicherem biologischem Potenzial (ANNUBPs)11,12 und nicht aus bereits bestehenden gutartigen plexiformen Neurofibromen (siehe 13,14 für hervorragende Übersichten dieser Modelle sowie anderer Modelle, die zusätzliche MPNST-assoziierte Funktionsverlustmutationen in Genen wie Suz12 und Pten15 einführen).

Diese Mausmodelle waren von unschätzbarem Wert für die Etablierung der Rolle, die Gene wie NF1, TP53 und CDKN2A bei der Pathogenese von NF1-assoziierten Neoplasien des peripheren Nervensystems spielen, und für präklinische Studien zur Erprobung von Therapeutikakandidaten. Wir haben jedoch immer noch ein unvollständiges Verständnis des Prozesses, durch den plexiforme Neurofibrome zu atypischen neurofibromatösen Neoplasien mit ungewissem biologischem Potenzial (ANNUBPs16) und dann zu MPNSTs fortschreiten. In letzter Zeit wurden einige Fortschritte beim Verständnis dieses Prozesses erzielt, mit dem jüngsten Bericht, dass Mäuse mit Deletionen in Nf1 und Arf ANNUBPs entwickeln, die zu MPNSTs11 fortschreiten. Es gibt jedoch noch keine auf Nf1-Mutationen basierenden Mausmodelle, die den Prozess der plexiformen Neurofibrom-MPNST-Progression beim Menschen vollständig rekapitulieren. Darüber hinaus ist nicht klar, ob es mehrere unterschiedliche Wege gibt, die zur Entwicklung von MPNSTs führen. Vor diesem Hintergrund ist es möglich, dass die oben beschriebenen GEMs nur eine Teilmenge mehrerer verschiedener Signalwege modellieren, die zur Neurofibrom-MPNST-Progression und MPNST-Pathogenese führen. Dieser Punkt wird durch die Tatsache unterstrichen, dass MPNSTs auch sporadisch auftreten und dass einige sporadische MPNSTs anscheinend keine NF1-Mutationen aufweisen17,18.

Obwohl dieser letzte Punkt durch den jüngsten Vorschlag von Magollon-Lorenz et al. in Frage gestellt wurde, dass zumindest einige sporadische MPNSTs ohne NF1-Mutationen Melanome oder eine andere Art von Sarkom19 sind, haben wir kürzlich über ein sporadisches MPNST und eine von diesem Tumor abgeleitete Zelllinie (2XSB-Zellen) berichtet, die NF1-Wildtyp 20 war. Bei der Charakterisierung des Muttertumors und der 2XSB-Zelllinie schlossen wir systematisch alternative diagnostische Möglichkeiten aus, einschließlich des Melanoms und der zahlreichen anderen Sarkomtypen, die routinemäßig bei der Differentialdiagnose eines sporadischen malignen peripheren Nervenscheidentumors in Betracht gezogen werden20. Darüber hinaus stellen wir fest, dass Magollon-Lorenz et al. einräumten, dass ihre Ergebnisse in den drei von ihnen untersuchten sporadischen MPNST-Zelllinien nicht verallgemeinert werden konnten, um darauf hinzuweisen, dass alle Tumoren, die als sporadische MPNSTs identifiziert wurden, keine MPNSTs sind.

Um ein GEM-Modell zu konstruieren, in dem Neurofibrom und MPNST-Pathogenese nicht unbedingt von spezifischen Tumorsuppressorgenmutationen abhängig sind, erzeugten wir transgene Mäuse, in denen die Überexpression des potenten Schwann-Zell-Mitogens Neuregulin-1 (NRG1) durch den Schwann-Zell-spezifischen Myelinprotein-Null-Promotor (P0-GGFβ3-Mäuse) angetrieben wurde21. Wir haben bereits gezeigt, dass humane Neurofibrome, MPNSTs und MPNST-Zelllinien mehrere NRG1-Isoformen zusammen mit den erbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen (erbB2, erbB3 und erbB4) exprimieren, die die NRG1-Signalgebung vermitteln, und dass diese erbB-Rezeptoren konstitutiv aktiviert sind22. Wir haben auch gezeigt, dass pharmakologische Inhibitoren der erbB-Kinasen die MPNST-Proliferation22, das Überleben23 und die Migration24 stark hemmen. In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen beim Menschen entwickeln P 0-GGFβ3-Mäuse plexiforme Neurofibrome25, die sich mit hoher Frequenz zu MPNSTs entwickeln 21,25. Wir haben gezeigt, dass P 0-GGFβ3-MPNSTs, wie ihre menschlichen Gegenstücke, häufig Mutationen von Trp53 und Cdkn2a sowie zahlreiche andere genomische Anomalien entwickeln, die möglicherweise zur Tumorgenese beitragen25. MPNSTs, die in P 0-GGFβ3-Mäusen auftreten, weisen keine inaktivierenden Nf1-Mutationen auf. Unter Verwendung genetischer Komplementierung konnten wir jedoch zeigen, dass NRG1 die Tumorgenese in P 0-GGFβ3-Mäusen hauptsächlich durch dieselben Signalkaskaden fördert, die durch den Verlust von Nf1 verändert werden26; Diese Schlussfolgerung basiert auf unserer Erkenntnis, dass die Substitution der NRG1-Überexpression durch den Nf1-Verlust bei Vorliegen einer Trp53-Haploinsuffizienz (P 0-GGFβ3;Trp53+/- Mäuse) produziert Tiere, bei denen sich MPNSTs de novo entwickeln, wie es bei cis-Nf1+/- der Fall ist; Trp53+/- Mäuse27.

Um diese und andere Informationen zu erhalten, die zeigen, dass P 0-GGFβ3-Mäuse die Prozesse der Neurofibrom-Pathogenese und der Neurofibrom-MPNST-Progression, die bei Menschen mit NF1 beobachtet werden, genau modellieren, haben wir spezielle Methoden entwickelt, um Gewebe von diesen Tieren zu verarbeiten, ihre Tumore genau zu diagnostizieren, die in diesen Mäusen auftretenden MPNSTs zu bewerten, P0-GGFβ3 und P0-GGFβ3 in der frühen Passage zu etablieren und zu charakterisieren; Trp53+/- MPNST-Kulturen und kritischer Vergleich der Pathologie von P 0-GGFβ3 PNs und MPNSTs und P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNSTs mit denen ihrer menschlichen Gegenstücke. Viele dieser Methoden sind auf andere GEM-Modelle von Neoplasien des Nervensystems verallgemeinerbar. Darüber hinaus sind einige dieser Methoden breiter auf GEM-Modelle anwendbar, in denen Neoplasien an anderen Organstellen auftreten. Daher präsentieren wir hier eine detaillierte Beschreibung dieser Methoden.

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Protokoll

Die hier beschriebenen Verfahren wurden von der IACUC der Medical University of South Carolina genehmigt und von ordnungsgemäß geschultem Personal in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den institutionellen Tierpflegerichtlinien des MUSC durchgeführt.

1. Bestimmung der Tumorpenetranz und des Überlebens in P 0-GGFβ3-Mäusen und Identifizierung von Tumoren in diesen Tieren zur weiteren Charakterisierung

  1. Generieren Sie die Kohorte von Mäusen, die auf Tumorgenese untersucht werden. Die Anzahl der benötigten Mäuse hängt von der Penetranz des Tumorphänotyps ab. Um solche Verluste auszugleichen, beginnen Sie mit einer Kohorte, die 10-15% höher ist als die gewünschte endgültige Anzahl von Tieren.
    HINWEIS: Wir bestimmten die Tumorpenetranz in P 0-GGFβ3-Mäusen empirisch in einer ersten Kohorte von 50 Mäusen (von denen sechs aus Gründen verloren gingen, die nicht mit Neoplasien zusammenhängen (z. B. Bekämpfung))25.
  2. Beurteilen Sie die Gesundheit der Tiere dreimal wöchentlich und notieren Sie bei jeder Untersuchung die Werte für den Körperzustand, einschließlich Gewicht und Verhaltensänderungen. Beenden Sie tumortragende oder moribunde Mäuse (siehe Anmerkung unten) mit Kohlendioxid-Euthanasie, gefolgt von einer Zervixluxation. Rekordalter beim Tod in Tagen. Wenn Tumore äußerlich sichtbar sind, notieren Sie die Tumorabmessungen (Länge, Breite und Höhe).
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass Tiere nicht über die von der IACUC genehmigte maximal zulässige Tumorgröße und/oder den humanen Endpunkt hinausgehen dürfen.
  3. Erstellen Sie anhand des Sterbealters eine Kaplan-Meier-Überlebenskurve, um das mittlere Sterbealter und die Überlebensspanne zu bestimmen.
    HINWEIS: P 0-GGFβ3-Mäuse hatten ein mittleres Sterbealter von 261,5 Tagen mit einer Spanne von 74-533 Tagen; 91 % unserer Kohorte hatten multiple Neurofibrome und 71 % hatten MPNSTs21.
  4. Stellen Sie fest, ob grob sichtbare Tumore vorhanden sind, und wenn ja, sezieren Sie sie unter sterilen Bedingungen, um festzustellen, ob der Tumor mit einem peripheren Nerv assoziiert ist, und entfernen Sie dann den Tumor. In P 0-GGFβ3 und P0-GGFβ3; Trp53+/- Mäuse, periphere Nervenscheidentumoren werden am häufigsten im Trigeminus- und Ischiasnerv gefunden. Auch wenn grob sichtbare Tumore nicht in Verbindung mit diesen Nerven zu sehen sind, fixieren und betten Sie diese Nerven wie unten beschrieben ein, damit sie auf das Vorhandensein von Mikrotumoren untersucht werden können. Mikrotumoren treten typischerweise in den Ganglien auf, die mit diesen Nerven verbunden sind.
  5. Grob sichtbare Tumore in drei Stücke schneiden (Abbildung 1A). Verwenden Sie Stück 1 für die Histologie (Paraffinschnitte, Immunhistochemie und Histochemie). Verwenden Sie Stück 2, um frühe Übergangskulturen zu etablieren. Schnappfrostteil 3 (mit flüssigem Stickstoff) für mögliche zukünftige Experimente (z. B. Immunblots, RNA- und DNA-Isolierung).
  6. Das Stück 1 in 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wird über Nacht bei 4 °C fixiert. Der Rest des Körpers des Tieres wird durch Eintauchen in 4 % Paraformaldehyd über Nacht bei 4 °C fixiert.

2. Paraffin-Einbettung von grob sichtbaren Tumoren und Aufbereitung von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Schnitten für die diagnostische Erstbeurteilung

  1. Paraffineinbettung von grob sichtbaren Tumoren
    1. Nachdem Sie Tumorstück 1 über Nacht in 4% Paraformaldehyd fixiert haben, spülen Sie das Gewebe aus, indem Sie es 15 Minuten lang in ein PBS-Volumen legen, das mindestens 10x größer ist als das Gewebevolumen. Verwenden Sie das gleiche Volumen für alle nachfolgenden Spülungen. Wiederholen Sie zwei weitere 15-minütige PBS-Spülungen und verwenden Sie für jede Spülung eine frische Menge PBS.
    2. Tumorstück 1 auf 70% Ethanol übertragen. Halten Sie das Gewebe 24 h lang bei 4 °C in 70%igem Ethanol. Falls gewünscht, lagern Sie das Gewebe langfristig unter diesen Bedingungen.
      HINWEIS: Die Schritte 2.1.1 bis 2.1.7 sind für Prüfer vorgesehen, die keinen Zugang zu einer kommerziellen Gewebeverarbeitungsmaschine haben. Wenn der Prüfer Zugang zu einem Gewebeprozessor hat, wird das Gewebe durch abgestufte Ethanole und Xylole gemäß dem programmierten Instrumentenprotokoll verarbeitet.
    3. Tumorstück 1 auf 80% Ethanol für 30 min bei Raumtemperatur übertragen. Wiederholen Sie die Inkubation für weitere 30 Minuten in einem frischen Volumen von 80 % Ethanol.
    4. Tumorstück 1 auf 95% Ethanol für 75 min bei Raumtemperatur übertragen. Wiederholen Sie die Inkubation noch zweimal, jeweils für weitere 75 Minuten in einem frischen Volumen von 95 % Ethanol.
    5. Tumorstück 1 auf 100% Ethanol übertragen und 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie die 60-minütige Inkubation noch zweimal, jedes Mal mit einem frischen Volumen von 100 % Ethanol.
    6. Tumorstück 1 in ein Lösungsmittel auf d-Limonen-Basis überführen und 30-60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Tumorstück 1 in ein frisches Volumen des Lösungsmittels auf d-Limonen-Basis überführen und weitere 30-60 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Tumorstück 1 für 1 h bei 60 °C in 1:1 Paraffin/d-Limonen-basiertes Lösungsmittel überführen. Das 1:1 Paraffin/d-Limonen-basierte Lösungsmittel verwerfen und Tumorstück 1 auf 60 °C Paraffin übertragen und 20 min bei 60 °C inkubieren. Die Inkubation in einem frischen Volumen von 60 °C Paraffin noch einmal für 20 min wiederholen. Inkubieren Sie Tumorstück 1 über Nacht bei 60 °C in Paraffin.
    8. Gießen Sie eine Basisschicht Paraffin in eine Histologieform aus Stahl und lassen Sie sie erstarren. Übertragen Sie das Tumorstück 1 auf die Oberfläche des Basisparaffins und bedecken Sie das Gewebe unmittelbar nach der Positionierung mit 60 °C Paraffin und legen Sie die Gewebekassette auf das geschmolzene Paraffin und bringen Sie es in Kontakt. Übertragen Sie die Form auf die kalte Seite der Einbettstation und lassen Sie sie 10-15 Minuten lang erstarren.
    9. Den Paraffinblock mit der angebrachten Gewebekassette aus der Form nehmen. Verwenden Sie die beigefügte Gewebekassette, um den Block während des Schneidens in das Mikrotom zu klemmen.
      HINWEIS: Der Paraffinblock kann nun unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Bereiten Sie Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Schnitte von grob sichtbaren Tumoren vor.
    1. Schneiden Sie 4-5 μm große Abschnitte des Tumorgewebes mit einem Mikrotom und montieren Sie sie auf positiv geladene Glasobjektträger.
    2. Um eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) durchzuführen, entparaffinisieren Sie die Gewebeschnitte, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel auf d-Limonen-Basis inkubieren. Wiederholen Sie die Inkubation in einem frischen Volumen eines Lösungsmittels auf d-Limonen-Basis für 10 Minuten.
    3. Die Objektträger auf 100% Ethanol umfüllen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Objektträger in ein frisches Volumen von 100 % Ethanol überführen und weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Die Objektträger auf 95%iges Ethanol übertragen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Objektträger in ein frisches Volumen von 95 % Ethanol überführen und weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Die Objektträger auf 70%iges Ethanol übertragen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann auf 50% Ethanol umfüllen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Die Objektträger in destilliertes Wasser geben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Färben Sie die Objektträger, indem Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in Hämatoxylin tauchen. 1-2 Min. mit fließendem Leitungswasser abspülen. Unterscheiden Sie, indem Sie Objektträger 2-5x in 0,5% Salzsäure in 70% Ethanol tauchen. 1-2 Min. in fließendem Leitungswasserbad abspülen. Legen Sie die Objektträger 10 s lang in 95% Ethanol mit 0,5% Essigsäure.
    8. Färben Sie die Objektträger 30 s lang bei Raumtemperatur mit Eosin-Y und übertragen Sie die Objektträger dann für 5 min auf 100% Ethanol. Die Proben werden 5 Minuten lang in einem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis gelöscht.
    9. Deckgläser mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis montieren, während das Objektträger noch mit dem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis benetzt ist. Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht aushärten.
      HINWEIS: Verwenden Sie kein Eindeckmedium auf Wasserbasis.
  3. Bereiten Sie Gewebe ohne grob sichtbare Tumoren vor, um plexiforme Neurofibrome und Mikro-MPNSTs zu identifizieren. Betten Sie das Gewebe in Paraffin ein, bereiten Sie histologische Schnitte vor und färben Sie diese Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin.
    1. Entfernen Sie die inneren Organe und betten Sie repräsentative Teile jedes Organs in Paraffin ein, um H&E-gefärbte Schnitte vorzubereiten, die auf mikroskopische Anzeichen von Tumoren untersucht werden (Abbildung 1B). Entfernen Sie den Kopf, die Vordergliedmaßen, die Hintergliedmaßen und den Schwanz (Abbildung 1C). Um das Rückenmark und die Nervenwurzeln in situ auf Anzeichen von Nervenwurzeltumoren zu untersuchen, entkalken Sie die Wirbelsäule und die zugehörigen Rippen und Weichteile durch Eintauchen in 0,3 M EDTA/4% Paraformaldehye (pH 8,0) für 48-72 h bei 4 °C; Spülen Sie die Proben dann mit 1x PBS. Stellen Sie am Ende der Entkalkung sicher, dass die Entkalkung abgeschlossen ist, indem Sie versuchen, die Wirbelsäule mit einer Nadel zu durchstechen. Die Entkalkung ist erfolgreich, wenn die Nadel leicht in den Knochen eindringt, ohne zu knirschen.
    2. Schneiden Sie die entkalkte Wirbelsäule und die zugehörigen Strukturen in Blöcke, die in eine Gewebekassette passen. Dehydrieren Sie durch abgestufte Ethanole, gefolgt von einem Lösungsmittel auf d-Limonen-Basis, wie in den Schritten 2.1.2 bis 2.1.7 beschrieben. In Paraffin einbetten und 4-5 μm-Schnitte wie in den Schritten 2.1.7-2.2.1 beschrieben vorbereiten. H&E-Färbungen wie in den Schritten 2.2.2-2.2.9 beschrieben durchführen; Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht aushärten.

3. Identifizieren Sie potenzielle plexiforme Neurofibrome und führen Sie spezielle Färbungen durch, um die Diagnosen zu bestätigen

HINWEIS: Wir empfehlen dringend, einen erfahrenen Human- oder Veterinärpathologen in die Beurteilung von H&E und speziellen Färbungen von GEM-Tumorschnitten einzubeziehen.

  1. Untersuchen Sie die H&E-gefärbten Objektträger, die wie oben beschrieben mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie hergestellt wurden, um potenzielle Tumoren der peripheren Nervenscheide zu identifizieren. Da Neurofibrome und MPNSTs innerhalb peripherer Nerven auftreten, ist es wichtig zu bestimmen, ob mikroskopisch kleine Tumoren mit einem peripheren Nerv assoziiert sind. Identifizieren Sie Blockaden mit potenziellen Tumoren der peripheren Nervenscheide, damit Immunfärbungen und andere spezielle Färbungen durchgeführt werden können, um Diagnosen zu bestätigen oder zu widerlegen.
  2. Unterscheidung potenzieller PNs von MPNSTs/anderen hochgradigen Neoplasien basierend auf histologischen Merkmalen, die bei der Hellfelduntersuchung von H&E-gefärbten Schnitten beobachtet wurden. Menschliche PNs sind leicht hyperzelluläre Neoplasien, die überwiegend aus Zellen mit länglichen, oft welligen Kernen bestehen. In vielen Bereichen sind die Zellen locker gepackt und können durch myxoides extrazelluläres Material getrennt sein; PNs in P 0-GGFβ3-Mäusen haben ein ähnliches Aussehen. Mitosen sind typischerweise nicht vorhanden; wenn dies der Fall ist und der Tumor mäßig bis stark hyperzellulär ist, handelt es sich bei dem Tumor um ein MPNST oder eine andere Art von hochgradigem Neoplasma (siehe unten).
  3. PNs bestehen aus einer Mischung aus neoplastischen Schwann-Zellen und anderen nicht-neoplastischen Zelltypen wie Mastzellen. Um die Identität eines PN zu bestätigen, führen Sie Immunfärbungen für die Schwann-Zellmarker S100β und Sox10 sowie den Mastzellmarker CD117 (c-Kit) an Schnitten von Blöcken durch, die potenzielle PNs enthalten, die bei der H&E-Untersuchung identifiziert wurden (siehe Abschnitt 3.4 für alternative Mastzellmarker-Färbeoptionen). Führen Sie Ki67-Immunfärbungen durch, um niedrige Proliferationsraten zu bestätigen.
    HINWEIS: Tabelle 1 listet die Antigenmarker auf, die für die routinemäßige Identifizierung von plexiformen GEM-Neurofibromen (S100β, Sox10, CD117, Ki67), die Diagnose von MPNSTs und für eine vollständige Beurteilung anderer in Neurofibromen vorhandener Zelltypen verwendet werden; wir färben diese letzteren Antigene nur, wenn wir zum ersten Mal ein neues GEM-Modell beschreiben. Konsultieren Sie das Datenblatt des Antikörperherstellers für empfohlene Bedingungen. Beachten Sie, ob die Beilage des Antikörperherstellers die Antigenentnahme empfiehlt; Nicht alle Antigene müssen abgerufen werden, um nachweisbar zu sein.
    1. Bereiten Sie 4-5 μm-Schnitte aus den ausgewählten Paraffinblöcken vor und montieren Sie sie auf positiv geladene Objektträger. Entparaffinieren Sie die Abschnitte wie in den Schritten 2.2.2 bis 2.2.6 beschrieben.
    2. Spülen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 3-5 min.
    3. Wenn der Antikörperhersteller eine Antigengewinnung empfiehlt, bereiten Sie Citratpuffer vor. Kombinieren Sie 9 ml Zitronensäurelösung (10,5 g Zitronensäure in 500 ml destilliertem Wasser) und 41 ml Natriumcitratlösung (14,7 g Natriumcitrat in 500 ml destilliertem Wasser).
    4. Führen Sie die Antigengewinnung durch, indem Sie Objektträger 20 Minuten lang in Citratpuffer in einen beheizten Reiskocher legen.
    5. Übertragen Sie Objektträger 10 Minuten lang in 3% Wasserstoffperoxid/1x PBS, um die Peroxidaseaktivität im Gewebe zu beseitigen.
      Anmerkungen: Machen Sie diese Lösung jedes Mal frisch und verwenden Sie nicht die Stammlösung von Wasserstoffperoxid, wenn sie älter als 3-4 Monate ist.
    6. Spülabschnitte in 1x PBS.
    7. Blockabschnitte mit Blockierpuffer (2% BSA, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) für 1 h. Dias kurz in 1x PBS ausspülen.
    8. Fügen Sie den Gewebeschnitten einen primären Antikörper hinzu. Bereiten Sie Primärantikörper in verdünntem Blockierungspuffer vor. Objektträger 2 Stunden bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    9. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 1x PBS. Wiederholen Sie dies 3x.
    10. Inkubieren Sie das Gewebe mit biotinylierten Sekundärantikörpern für 1-2 h.
    11. Bereiten Sie Diaminobenzidin (DAB)-Lösung basierend auf dem Protokoll des Herstellers vor und tauchen Sie die Objektträger 2-10 Minuten lang in die Lösung. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in Wasser.
    12. Streichen Sie die Abschnitte durch Eintauchen in Hämatoxylin für 10-15 Minuten. Fließendem Wasser aussetzen, bis es klar ist. Tauchen Sie Objektträger schnell in Alkohol und spülen Sie Objektträger in Wasser ab.
    13. Dehydrieren Sie Objektträger in abgestuftem Ethanol, indem Sie Objektträger 4-5x pro Lösung schnell in 70 % Ethanol, 95 % Ethanol und dann 100 % Ethanol tauchen. Objektträger 2 Minuten lang in einem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis inkubieren. Inkubieren Sie Objektträger in einer zweiten Charge eines Lösungsmittels auf D-Limonen-Basis für 2 Minuten.
    14. Dia mit einem Einbettmedium auf Xylolbasis einbinden.
    15. Untersuchen Sie Objektträger mit Hellfeldmikroskopie.
    16. Für Immunfluoreszenz lassen Sie die Schritte 3.3.10-3.3.15 aus. Inkubieren Sie stattdessen Gewebe mit speziesspezifischen Sekundärantikörpern, die in Blockierungspuffer verdünnt sind, für 1-2 h.
    17. Rutschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in PBS aus. Wiederholen Sie dies 3x.
    18. Montieren Sie Objektträger mit 1x PBS/Glycerin.
    19. Untersuchen Sie Objektträger mit Fluoreszenzmikroskopie.
  4. Alternative Methode zur Färbung von Mastzellen: Toluidinblau-Färbung
    1. Bereiten Sie Toluidinblau-Stammlösung vor, indem Sie 1 g Toluidinblau O in 100 ml 70%igem Ethanol auflösen.
    2. Bereiten Sie 1% ige Natriumchlorid (NaCl)-Lösung vor, indem Sie 0,5 g NaCl in 50 ml destilliertem Wasser auflösen. Zum Auflösen mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf ca. 2,0-2,5 ein.
      HINWEIS: Diese NaCl-Lösung muss bei jeder Färbung frisch gemacht werden.
    3. Bereiten Sie Toluidinblau-Arbeitslösung vor, indem Sie 5 ml Toluidinblau-Stammlösung zu 45 ml der 1%igen NaCl-Lösung hinzufügen. Gut mischen und darauf achten, dass der pH-Wert etwa 2,3 beträgt.
      HINWEIS: Ein pH-Wert von mehr als 2,5 führt zu einer Färbung mit weniger Metachromasie. Machen Sie diese Lösung jedes Mal frisch, wenn eine Färbung durchgeführt wird.
    4. Entparaffinieren Sie 4-5 μm-Abschnitte, die auf positiv geladenen Objektträgern montiert sind, wie in den Schritten 2.2.2-2.2.6 beschrieben. Waschen Sie entparaffinisierte Abschnitte 2 Minuten lang unter fließendem Wasser.
    5. Färbeabschnitte in toluidinblauer Arbeitslösung für 2-3 min. In destilliertem Wasser 2 Min. waschen.
    6. Dehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie 10x in 95%iges Ethanol tauchen. Tauchen Sie 10x in 100% Ethanol. Tauchen Sie die Objektträger noch 10 Mal in frisches 100%iges Ethanol.
    7. Objektträger 2 Minuten lang in einem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis inkubieren. Inkubieren Sie Objektträger in einer zweiten Charge eines Lösungsmittels auf D-Limonen-Basis für 2 Minuten.
    8. Montieren Sie Deckgläser mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis, während das Objektträger noch mit einem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis benetzt ist.
      HINWEIS: Verwenden Sie kein Eindeckmedium auf Wasserbasis.
    9. Untersuchen Sie Objektträger mit Hellfeldmikroskopie. Identifizieren Sie Mastzellen durch das Vorhandensein von dunkelvioletten Körnchen in ihrem Zytoplasma. Andere Zelltypen sind hellblau gefärbt.

4. Spezielle Färbungen zur Diagnose von MPNSTs und zum Ausschluss alternativer Diagnosen

  1. Das histologische Erscheinungsbild von humanen MPNSTs ist sehr variabel und mehrere verschiedene Tumorarten haben ein ähnliches Erscheinungsbild wie MPNSTs28. Da MPNSTs von der Schwann-Zelllinie abgeleitet sind, bestimmen Sie, ob der Tumor von einem peripheren Nerv oder innerhalb eines vorhandenen gutartigen PN entsteht, durch grobe Untersuchung oder hellfeldmikroskopische Untersuchung von H&E-gefärbten Schnitten. Obwohl MPNSTs gelegentlich nicht in Verbindung mit einem peripheren Nerv oder PN gefunden werden (normalerweise aufgrund einer versehentlichen Trennung vom Nerv während der Dissektion, Zerstörung des bereits vorhandenen PN durch MPNST-Überwucherung oder weil die Läsion metastasiert ist), suchen Sie nach der Assoziation des Tumors mit einem Nerv oder PN, da die Diagnose weniger wahrscheinlich ist, wenn der Tumor nicht mit einem Nerv oder PN assoziiert ist.
  2. Bereiten Sie 4-5 μm-Schnitte aus Paraffinblöcken vor, die potenzielle MPNSTs enthalten, und montieren Sie sie wie in Schritt 2.2.1 beschrieben auf positiv geladene Objektträger. Entparaffinieren Sie die Abschnitte wie in den Schritten 2.2.2 bis 2.2.6 beschrieben.
  3. Führen Sie eine Immunhistochemie mit dem in Tabelle 2 angegebenen Antikörperpanel durch, wie in den Schritten 3.3.1 bis 3.3.15 beschrieben.
  4. Untersuchen Sie die Immunfärbungen durch Hellfeldmikroskopie. Da MPNSTs eine Schwannsche Differenzierung zeigen, suchen Sie nach einheitlicher oder fleckiger Immunreaktivität für S100β, Nestin und Sox10. Wenn die Tumoren für diese drei Marker nicht positiv sind, beziehen Sie sich auf Tabelle 2 , um die Diagnose zu stellen.
    HINWEIS: MPNSTs von Mensch und Maus können eine divergente Differenzierung aufweisen. Zum Beispiel zeigen einige menschliche MPNSTs eine fokale Rhabdomyoblastendifferenzierung (diese Varianten werden als maligne Triton-Tumoren bezeichnet); obwohl diese Neoplasien für die Schwannschen Marker gefärbt sind, exprimieren sie auch Muskelmarker wie Desmin, MyoD1 und Myogenin. Die Immunreaktivität für diese letzteren Marker sollte die Forscher nicht davon abhalten, den Tumor als MPNST zu diagnostizieren. Obwohl mehrere Mausmodelle, die das SS18-SSX-Fusionsgen bedingt exprimieren, etabliert wurden, um die Pathogenese des Synovialsarkoms29 zu modellieren, sind nach unserem besten Wissen keine Synovialsarkommodelle bekannt, die spontan das äquivalente Fusionstranskript erzeugen. Folglich suchen wir nicht nach SS18-SSX-Fusionstranskripten in GEM-Tumoren und verlassen uns stattdessen auf immunhistochemische Profile.

5. Einstufung der MPNSTs

  1. Stellen Sie fest, ob eine Tumornekrose, ein Kennzeichen von MPNSTs des WHO-Grades IV, vorliegt. Achten Sie bei MPNSTs Grad IV auf eine ausgeprägte Hyperzellularität, eine lebhafte mitotische Aktivität (≥4 Mitosen pro 10 Hochleistungsfelder (40x)) und zytologische Atypien.
    1. Wenn keine Nekrose vorliegt, beurteilen Sie den Tumor, um festzustellen, ob Hyperzellularität, lebhafte mitotische Aktivität und zytologische Atypie vorliegen. Wenn diese Merkmale alle in Abwesenheit von Nekrose vorhanden sind, stufen Sie den Tumor als WHO-Grad-III-MPNST ein.
    2. WHO-Grad-II-Tumoren sind durch eine erhöhte Zellularität gekennzeichnet, jedoch in geringerem Maße als WHO-MPNSTs der Grade III und IV. Die Kerne von Tumorzellen in einem MPNST des WHO-Grades II zeigen eine erhöhte Größe (mehr als die 3-fache Größe der Tumorzellkerne bei Neurofibromen) und Hyperchromasie. Eine erhöhte mitotische Aktivität (<4 Mitosen pro 10 Hochleistungsfelder) ist mit WHO-Grad-II-Tumoren verbunden, aber keine Voraussetzung dafür.
      HINWEIS: Da höhergradige Tumoren typischerweise von niedriggradigen Tumoren fortschreiten, können niedriggradige und hochgradige Regionen im selben MPNST vorhanden sein. In diesem Fall wird der Grad des Tumors durch die höchstgradige Region bestimmt.
      HINWEIS: Unter Humanpathologen herrscht Kontroverse darüber, ob das oben beschriebene WHO-Bewertungssystem die Patientenergebnisse vorhersagt, und einige dieser Pathologen ziehen es stattdessen vor, MPNSTs einfach als minderwertig oder hochgradig zu klassifizieren. Nach diesem Schema weisen hochgradige MPNSTs eine ausgeprägte zytologische Atypie, eine lebhafte mitotische Aktivität (>5 Mitosen pro 10 Hochleistungsfelder) und eine ausgeprägte Hyperzellularität mit oder ohne Nekrose auf. Niedriggradige MPNSTs haben keine Nekrose, zeigen aber mitotische Aktivität, zytologische Atypie und Zellularität, die zwischen einem hochgradigen MPNST und einem atypischen neurofibromatösen Neoplasma mit unbekanntem biologischem Potenzial (ANNUBP) liegt. Wir bevorzugen das oben beschriebene System, da die Unterscheidung zwischen einem ANNUBP und einem minderwertigen MPNST für Ermittler, die nicht lange Erfahrung mit diesen Entitäten haben, eine Herausforderung darstellen kann.

6. Vorbereitung von Kulturen von P 0-GGFβ3 MPNST-Zellen der frühen Passage

  1. Kultivierung von P 0-GGFβ3-Tumorzellen aus frischem Tumorstück 2 in der frühen Passage (Schritt 1.5, Abbildung 1A). Halten Sie von diesem Zeitpunkt an sterile Bedingungen aufrecht.
    1. Dissoziieren Sie den Tumor, indem Sie ihn in kleine (2-4 mm) Stücke schneiden und in DMEM10 (Dulbeccos minimales essentielles Medium) mit 10% fötalem Kälberserum, 2 μmol/L Forskolin und 10 nmol/L Neuregulin 1β (NRG1β) in 100-mm-Gewebekulturschalen zerkleinern.
    2. Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in 5% CO2 aus den zerkleinerten Gewebefragmenten herauswachsen, bis die Platten zusammenfließen. Wechseln Sie alle 3-4 Tage das Medium.
    3. Teilen Sie die Zellkultur. Entfernen Sie das Medium aus dem 100-mm-Geschirr und spülen Sie die Zellen mit PBS. Entfernen und entsorgen Sie gehacktes Gewebe. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin für 2-5 Minuten bei Raumtemperatur hinzu. Um die Zellablösung zu fördern, klopfen Sie vorsichtig auf die Platte und prüfen Sie sie mit einem Lichtmikroskop auf Ablösung. Verlängern Sie die Trypsin-Inkubation nach Bedarf.
    4. Neutralisieren Sie Trypsin durch Zugabe von 2 ml DMEM10. Die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen und Pelletzellen bei 500 × g für 5 min umfüllen. Entfernen Sie das Medium und geben Sie 5 ml frisches DMEM10 in das Pellet.
    5. Verteilen Sie die Zellsuspension auf zwei bis vier 100-mm-Schalen, die DMEM10 enthalten. Teilen Sie die Zellen nicht länger als fünf Passagen (Schritte 6.1.3 und 6.1.4) und halten Sie sie in DMEM ohne Forskolin und NRG1β. Denken Sie daran, die Zellen an Durchgang 2 für die zukünftige Verwendung einzufrieren.

7. Überprüfung der Identität von MPNST-Zellen der frühen Passage durch Immunzytochemie

  1. Legen Sie sterile 18 mm #1,5 runde Glasdeckgläser in die Vertiefungen von sterilen 6-Well-Gewebekulturschalen.
    1. Geben Sie die Poly-L-Lysin/Laminin-Lösung in einem Volumen in die Vertiefungen, das ausreicht, um das Deckglas zu bedecken. Verschließen Sie die Platte mit Plastikfolie, um die Verdunstung zu minimieren. Über Nacht bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Deckgläser am nächsten Morgen 3x mit sterilem PBS.
      HINWEIS: Wir haben versucht, MPNST-Zellen mit früher Passage auf unbeschichteten Deckgläsern zu plattieren, und haben festgestellt, dass die Zellen ohne Poly-L-Lysin/Laminin-Beschichtung nicht gut haften.
    2. Platten Sie 10.000 Zellen auf das Deckglas, indem Sie vorsichtig 2 ml der Zellsuspension in Wachstumsmedien in jede Vertiefung geben, die das Deckglas enthält. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 in einem Gewebekultur-Inkubator.
    3. Am nächsten Morgen spülen Sie die Deckgläser 2 x 5 Minuten lang mit PBS aus.
    4. Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 18 min bei Raumtemperatur fixieren.
    5. Spülen Sie die Deckgläser 3 x 5 min mit PBS aus. Verschließen Sie die Platte auf Wunsch mit Plastikfolie und lagern Sie sie zu diesem Zeitpunkt bei 4 °C.
    6. Machen Sie frische 50 mM NH4Cl in PBS. Aldehyde durch Inkubation von Deckgläsern in 50 mM NH4Cl in PBS für 10 min bei Raumtemperatur abschrecken.
    7. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie Deckgläser in 0,3% Triton X-100 in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Deckgläser 3 x 5 min mit PBS waschen.
    8. Blockieren Sie die unspezifische Bindung durch Inkubieren von Deckgläsern in Blockierungspuffer (1 x PBS mit 1 % Rinderserumalbumin, 0,2 % fettfreier Trockenmilch und 0,3 % Triton X-100) für 1 h bei Raumtemperatur.
    9. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die die im Muttertumor vorhandenen MPNST-Marker erkennen (typischerweise S100β, Nestin und Sox10), verdünnt auf die vorgegebene optimale Verdünnung im Blockierungspuffer. Die Platte mit Plastikfolie umwickeln und über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
    10. 3 x 5 min mit PBS waschen, um den ungebundenen Primärantikörper zu entfernen. Fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper, verdünnt in Blockierungspuffer, zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Vor Licht schützen.
    11. 3 x 5 min mit PBS waschen. Deckgläser in 1-5 μg Hoechst-Farbstoff 10 min inkubieren. Weiter vor Licht schützen.
    12. Deckgläser mit PBS 5 Min. waschen. Montieren Sie Objektträger mit 1:1 1x PBS/Glycerin. Aufnahme mit einem Fluoreszenzmikroskop.

8. Allotransplantat von Tumorzellen der frühen Passage zum Nachweis der Tumorigenität

  1. Züchten Sie P 0-GGFβ3 MPNST-Zellen in der frühen Passage von DMEM10 auf 80% Konfluenz. Spülen Sie die Zellen einmal mit der ausgewogenen Salzlösung von Hanks (HBSS) bei Raumtemperatur. Behandeln Sie die Zellen 30 s bis 1 min lang mit einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung, um sie vom Substrat zu entfernen. Fügen Sie 5 ml DMEM10 pro 1 ml eines nicht-enzymatischen Zelldissoziationsreagenzes hinzu.
    HINWEIS: Die zelluläre Dissoziation kann viel länger dauern, bis zu 10-20 Minuten. Bitte beachten Sie das Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Züchten Sie keine Zellen bis zum Zusammenfluss, da dies die Wirksamkeit des Transplantats verringert.
    1. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Schleudern Sie die Zellen bei 5 × g für 5 min herunter und resuspendieren Sie sie in einer Konzentration von 1-2 × 106 Zellen pro 100 μl DMEM10. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis sie für die Injektion bereit sind.
    2. Betäuben Sie NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) Mäuse in der Induktionskammer eines Isofluran-Verdampfers. Legen Sie das Tier auf den Bauch und sterilisieren Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol. Lassen Sie die Stelle vor der Injektion an der Luft trocknen. Lassen Sie die Zellen vor der Injektion auf Raumtemperatur kommen.
    3. Injizieren Sie 1-2 x 106 Zellen subkutan in die rechte Flanke. Legen Sie die Maus allein in einen bettfreien Käfig und lassen Sie sie sich erholen. Stellen Sie sicher, dass sich nur ein Teil des Käfigs auf einem Heizkissen befindet, um Unterkühlung zu vermeiden. Dies bietet eine Zone, in die sich die Maus bewegen kann, wenn sie überhitzt wird.
      HINWEIS: Wir transplantieren mindestens drei Mäuse mit jeder frühen Passagekultur, da einige Transplantate möglicherweise nicht benötigt werden.
    4. Lassen Sie das Transplantat 15-60 Tage lang wachsen; Bewerten Sie die Tiergesundheit 3x wöchentlich und zeichnen Sie bei jeder Untersuchung Körperzustandswerte auf, einschließlich Gewicht und Verhaltensänderungen. Beenden Sie Mäuse, die die maximal zulässige Transplantatgröße erreicht haben, oder sterbende Mäuse mit Kohlendioxid-Euthanasie, gefolgt von einer Zervixluxation. Rekordalter beim Tod in Tagen. Wenn Tumore äußerlich sichtbar werden, notieren Sie die Tumorabmessungen (Länge, Breite und Höhe).
      HINWEIS: Unserer Erfahrung nach transplantieren verschiedene MPNST-Kulturen mit unterschiedlicher Effizienz und unterscheiden sich in der Zeit, die für das Transplantatwachstum benötigt wird. Tiere dürfen nicht über die von der IACUC genehmigte maximal zulässige Tumorgröße und/oder den humanen Endpunkt hinausgehen.
  2. Entnehmen Sie den Tumor, fixieren Sie ihn in 4% Paraformaldehyd, betten Sie ihn in Paraffin ein und führen Sie H&E-Färbungen durch, wie in den Abschnitten 2.1-2.2.9 beschrieben, um zu überprüfen, ob es sich bei dem Allotransplantat um einen Tumor und nicht um ein reaktives Gewebe handelt. Falls erforderlich, immunfärben Sie das Transplantat für die Marker, die im Muttertumor vorhanden waren.

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Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt Beispiele für grob offensichtliche Neoplasien, die bei P 0-GGFβ3-Mäusen auftreten. Tumoren, die mit bloßem Auge leicht zu erkennen sind, können als Massen gesehen werden, die sich in Körperregionen ausdehnen, wie in Abbildung 2A (Pfeil) dargestellt. Bei der Bestimmung, ob es sich bei dem Neoplasma möglicherweise um einen peripheren Nervenscheidentumor handelt, muss unbedingt festgestellt werden, dass der Tumor mit einem peripheren Ne...

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Diskussion

Die hier vorgestellten histologischen und biochemischen Methoden bieten einen Rahmen für die Diagnose und Charakterisierung von GEM-Modellen des Neurofibroms und der MPNST-Pathogenese. Im Laufe der Jahre haben wir festgestellt, dass diese Methoden sehr nützlich sind, um die Pathologie von peripheren Nervenscheidentumoren zu beurteilen, die in GEM-Modellen auftreten 21,25,26. Während die hier skizzierten Protokolle nützlich sind,...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 und R01 NS109655 an S.L.C. unterstützt; R01 NS109655-03S1 an D.P.J.), das National Cancer Institute (R01 CA122804 an S.L.C.) und das Verteidigungsministerium (X81XWH-09-1-0086 und W81XWH-12-1-0164 an S.L.C.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mm GewebekulturplattenCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidin (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6-Well-PlattenCorning Costar3516
EssigsäureFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Sekundär (Ziege Anti-Maus)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Sekundär (Ziege Anti-Maus)InvitrogenA21043 oder A11004
Alexa Fluor 568 Sekundär (Ziege Anti-Kaninchen)InvitrogenA11036
Ammoniumchlorid (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
RinderserumalbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
ZellschaberSarstedt83.183
ZellabstreiferCorning25-056-CI
KreisdeckglasFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (Lösungsmittel auf d-Limonen-Basis)Decon Laboratories5989-27-5
KritiksäureFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako Klon D33 (M0760)
Diaminobensizdin (DAB) LösungVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fötales KälberserumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerinSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HämatoxylinFisherbrand245-677
HämazytometerBrightline-Hauser Scientific1490
SalzsäureFisher ScientificA144-212
WasserstoffperoxidFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Maus auf MausVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Pferd Anti-KaninchenVektor LaboratorienMP-7401
InkubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2-Inkubator
IsofluranPiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Zellsignalisierung12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Flüssiger Stickstoff
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Mikrotom
NestinMillipore Mensch: MAD5236 (10C2), Mensch: MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIm eigenen HausMade by S.L.C. (auch erhältlich als 396-HB-050/CF bei R& D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnologie sc-67
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ MäuseJackson Laboratory5557
Fettfreie TrockenmilchWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ 3 MäuseHauseigenes
ParaffinwachsLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyd (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylol-Eindeckmedium)Fisher ScientificSP15-100
pH-MessgerätMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysin-HydrobromidSigma-AldrichP5899-5MG
Tragbares IsofluranzgerätVetEquip Inhalationsanästhesiesysteme
PVA-DABCO (wässriges Eindeckmedium)Millipore Sigma10981100ML
ReiskocherBuche Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (jetzt GA504)
SMAVentana Medical Systems Klon 1A4
NatriumchloridFisherScientific S640
Natriumcitrat (Dihydrat)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Histologieform
Superfrost Plus ObjektträgerFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Signalübertragung der Zellen (CH48H11) #2569
Gewebekassette
Toluidin BlauACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31
aus Stahl

Referenzen

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