Identifizierung, Diagnose und Einstufung bösartiger peripherer Nervenscheidentumoren in gentechnisch veränderten Mausmodellen

Summary

Wir haben eine Methodik entwickelt, um zu beurteilen, ob Neubildungen des Nervensystems in gentechnisch veränderten Mäusen die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke genau rekapitulieren. Hier wenden wir diese histologischen Techniken, definierten pathologischen Kriterien und Kulturmethoden auf Neurofibrome und maligne periphere Nervenscheidentumoren an, die im P 0-GGFβ3-Mausmodell auftreten.

Abstract

Patienten mit dem autosomal-dominanten Tumoranfälligkeitssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) entwickeln häufig plexiforme Neurofibrome (PNs), die sich anschließend in hochaggressive maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) verwandeln. Das Verständnis des Prozesses, durch den sich ein PN in ein MPNST verwandelt, würde durch die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEM) erleichtert, die das PN-MPNST-Fortschreiten beim Menschen mit NF1 genau replizieren. Leider rekapitulieren GEM-Modelle mit Nf1-Ablation diesen Prozess nicht vollständig. Dies führte uns zur Entwicklung von P 0-GGFβ3-Mäusen, einem GEM-Modell, in dem die Überexpression des Schwann-Zell-Mitogens Neuregulin-1 (NRG1) in Schwann-Zellen zur Entwicklung von PNs führt, die sich mit hoher Frequenz zu MPNSTs entwickeln. Um jedoch festzustellen, ob die Tumorgenese und die neoplastische Progression in P 0-GGFβ3-Mäusen die bei NF1-Patienten beobachteten Prozesse genau modellieren, mussten wir zunächst nachweisen, dass die Pathologie von P_{0-GGFβ3-Tumoren} der peripheren Nervenscheide die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke rekapituliert.

Hier beschreiben wir die spezialisierten Methoden, die zur genauen Diagnose und Bewertung von Neoplasien des peripheren Nervensystems in GEM-Modellen verwendet werden, wobei P 0-GGFβ3 und P_0-GGFβ3 verwendet werden; Trp53^+/- Mäuse als Beispiel. Wir beschreiben die histologischen, immunhistochemischen und histochemischen Methoden, die zur Diagnose von PNs und MPNSTs verwendet werden, wie man diese Neoplasien von anderen Tumorarten unterscheidet, die ihre Pathologie nachahmen, und wie man diese Neoplasien einstuft. Wir diskutieren die Etablierung von Frühpassagekulturen aus GEM-MPNSTs, wie diese Kulturen mit Hilfe der Immunzytochemie charakterisiert werden können und wie ihre Tumorigenität durch die Etablierung von Allotransplantaten verifiziert werden kann. Zusammengenommen charakterisieren diese Techniken die Pathologie von PNs und MPNSTs, die in GEM-Modellen auftreten, und vergleichen die Pathologie dieser murinen Tumoren kritisch mit ihren menschlichen Gegenstücken.

Introduction

In den letzten drei Jahrzehnten haben zahlreiche Laboratorien versucht, Mausmodelle für menschliche Krebserkrankungen zu erstellen, indem sie menschliche krebsassoziierte Mutationen in das Mausgenom einführten oder ein Genprodukt überexprimierten, das bei menschlichen Krebsarten überexprimiert wird. Die resultierenden gentechnisch veränderten Mausmodelle (GEM) können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, z. B. um festzustellen, dass die neu eingeführte genomische Modifikation die Tumorentstehung einleitet, um andere später auftretende genetische oder epigenetische Veränderungen zu identifizieren, die zur Tumorprogression beitragen, und um die wichtigsten Signalwege zu definieren, die die Tumorinitiierung und -progression vorantreiben. Im Gegensatz zu orthotopen Xenotransplantatmodellen, die auf der Verwendung von immundefizienten Mäusen beruhen, verfügen GEM-Krebsmodelle über ein voll funktionsfähiges Immunsystem und modellieren daher das Ansprechen auf Therapeutikakandidaten genauer. Bei der Verwendung von GEM-Krebsmodellen für solche Zwecke ist es jedoch wichtig, dass die Forscher bestätigen, dass Beobachtungen mit GEM-Neoplasien für ihre menschlichen Kollegen relevant sind. Diese Validierung sollte eine gründliche Beurteilung der Pathologie der GEM-Neoplasien und eine Feststellung umfassen, ob die pathologischen Merkmale der GEM-Neoplasien die Pathologie des entsprechenden menschlichen Tumortyps rekapitulieren.

Das Tumoranfälligkeitssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist die häufigste genetische Erkrankung des menschlichen Nervensystems und tritt bei etwa 1 von 3.000-3.500 Lebendgeburten auf ^1,2,3. Personen, die von NF1 betroffen sind, entwickeln mehrere gutartige periphere Nervenscheidentumoren, die als Neurofibrome bekannt sind, in ihrer Haut (dermale Neurofibrome) und in großen Nerven und Nervengeflechten (plexiforme Neurofibrome). Während sowohl dermale als auch plexiforme Neurofibrome die Lebensqualität des Patienten verschlechtern, indem sie körperliche, verhaltensbezogene und/oder soziale Beeinträchtigungen hervorrufen, sind plexiforme Neurofibrome (PNs) besonders gefährlich ^4,5. Dies liegt daran, dass sich PNs häufig in bösartige periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) verwandeln, bei denen es sich um aggressive Spindelzellneoplasien mit einer außergewöhnlich niedrigen Überlebensrate handelt ^1,2. Diese niedrige Überlebensrate ist zum großen Teil darauf zurückzuführen, dass die derzeit zur Behandlung von MPNSTs verwendeten Radio- und Chemotherapien unwirksam sind. Die Entwicklung neuer, wirksamerer Therapien war jedoch eine Herausforderung. Dies liegt daran, dass MPNSTs trotz der Häufigkeit des Auftretens bei NF1-Patienten immer noch seltene Neoplasien sind. Infolgedessen ist es sehr schwierig, eine große Anzahl menschlicher Tumore für Studien zu erhalten. es ist auch schwierig, genügend Patienten mit MPNSTs für klinische Studien zu rekrutieren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere GEM-Modelle erstellt, mit dem Ziel, weitere Einblicke in die Anomalien zu gewinnen, die die Pathogenese des Neurofibroms und die PN-MPNST-Progression vorantreiben, und präklinische Studien mit Therapeutikakandidaten zu erleichtern.

NF1-Patienten haben inaktivierende Mutationen in einer Kopie des NF1-Gens. Die Neurofibrom-Pathogenese wird ausgelöst, wenn eine inaktivierende Mutation im verbleibenden funktionellen NF1-Gen in einer Zelle der Schwann-Zelllinie auftritt. Überraschenderweise entwickelten Mäuse, die mit keimbahninaktivierenden Nf1-Mutationen erzeugt wurden, keine Neurofibrome ^6,7. Der anschließende Nachweis, dass Mäuse mit Nf1-null-Schwann-Zellen und Nf1-Haploinsuffizienz in allen anderen Zelltypen (Krox20-Cre;Nf1^flox/- Mäuse) entwickelten plexiformen Neurofibromen deuteten darauf hin, dass eine reduzierte Nf1-Gendosis in zusätzlichen Zelltypen für die Neurofibrom-Pathogenese erforderlich war⁸. Selbst dann sind die plexiformen Neurofibrome in Krox20-Cre; Nf1^flox/- Mäuse entwickelten sich nicht zu MPNSTs und ahmten daher die Biologie ihrer menschlichen Gegenstücke nur teilweise nach. Die MPNST-Pathogenese trat auf, wenn Nf1-Mutationen mit Mutationen in zusätzlichen Tumorsuppressorgenen wie Trp53⁹ oder Cdkn2a¹⁰ verpartnert wurden, aber MPNSTs in diesen GEM-Modellen entwickelten sich de novo oder aus atypischen neurofibromatösen Neoplasien mit unsicherem biologischem Potenzial (ANNUBPs)^11,12 und nicht aus bereits bestehenden gutartigen plexiformen Neurofibromen (siehe ^13,14 für hervorragende Übersichten dieser Modelle sowie anderer Modelle, die zusätzliche MPNST-assoziierte Funktionsverlustmutationen in Genen wie Suz12 und Pten¹⁵ einführen).

Diese Mausmodelle waren von unschätzbarem Wert für die Etablierung der Rolle, die Gene wie NF1, TP53 und CDKN2A bei der Pathogenese von NF1-assoziierten Neoplasien des peripheren Nervensystems spielen, und für präklinische Studien zur Erprobung von Therapeutikakandidaten. Wir haben jedoch immer noch ein unvollständiges Verständnis des Prozesses, durch den plexiforme Neurofibrome zu atypischen neurofibromatösen Neoplasien mit ungewissem biologischem Potenzial (ANNUBPs¹⁶) und dann zu MPNSTs fortschreiten. In letzter Zeit wurden einige Fortschritte beim Verständnis dieses Prozesses erzielt, mit dem jüngsten Bericht, dass Mäuse mit Deletionen in Nf1 und Arf ANNUBPs entwickeln, die zu MPNSTs¹¹ fortschreiten. Es gibt jedoch noch keine auf Nf1-Mutationen basierenden Mausmodelle, die den Prozess der plexiformen Neurofibrom-MPNST-Progression beim Menschen vollständig rekapitulieren. Darüber hinaus ist nicht klar, ob es mehrere unterschiedliche Wege gibt, die zur Entwicklung von MPNSTs führen. Vor diesem Hintergrund ist es möglich, dass die oben beschriebenen GEMs nur eine Teilmenge mehrerer verschiedener Signalwege modellieren, die zur Neurofibrom-MPNST-Progression und MPNST-Pathogenese führen. Dieser Punkt wird durch die Tatsache unterstrichen, dass MPNSTs auch sporadisch auftreten und dass einige sporadische MPNSTs anscheinend keine NF1-Mutationen aufweisen^17,18.

Obwohl dieser letzte Punkt durch den jüngsten Vorschlag von Magollon-Lorenz et al. in Frage gestellt wurde, dass zumindest einige sporadische MPNSTs ohne NF1-Mutationen Melanome oder eine andere Art von Sarkom¹⁹ sind, haben wir kürzlich über ein sporadisches MPNST und eine von diesem Tumor abgeleitete Zelllinie (2XSB-Zellen) berichtet, die NF1-Wildtyp ²⁰ war. Bei der Charakterisierung des Muttertumors und der 2XSB-Zelllinie schlossen wir systematisch alternative diagnostische Möglichkeiten aus, einschließlich des Melanoms und der zahlreichen anderen Sarkomtypen, die routinemäßig bei der Differentialdiagnose eines sporadischen malignen peripheren Nervenscheidentumors in Betracht gezogen werden²⁰. Darüber hinaus stellen wir fest, dass Magollon-Lorenz et al. einräumten, dass ihre Ergebnisse in den drei von ihnen untersuchten sporadischen MPNST-Zelllinien nicht verallgemeinert werden konnten, um darauf hinzuweisen, dass alle Tumoren, die als sporadische MPNSTs identifiziert wurden, keine MPNSTs sind.

Um ein GEM-Modell zu konstruieren, in dem Neurofibrom und MPNST-Pathogenese nicht unbedingt von spezifischen Tumorsuppressorgenmutationen abhängig sind, erzeugten wir transgene Mäuse, in denen die Überexpression des potenten Schwann-Zell-Mitogens Neuregulin-1 (NRG1) durch den Schwann-Zell-spezifischen Myelinprotein-Null-Promotor (P_{0-GGFβ3-Mäuse}) angetrieben ^wurde21. Wir haben bereits gezeigt, dass humane Neurofibrome, MPNSTs und MPNST-Zelllinien mehrere NRG1-Isoformen zusammen mit den erbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen (erbB2, erbB3 und erbB4) exprimieren, die die NRG1-Signalgebung vermitteln, und dass diese erbB-Rezeptoren konstitutiv aktiviert sind²². Wir haben auch gezeigt, dass pharmakologische Inhibitoren der erbB-Kinasen die MPNST-Proliferation²², das Überleben²³ und die Migration²⁴ stark hemmen. In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen beim Menschen entwickeln P 0-GGFβ3-Mäuse plexiforme Neurofibrome²⁵, die sich mit hoher Frequenz zu MPNSTs entwickeln ^21,25. Wir haben gezeigt, dass P 0-GGFβ3-MPNSTs, wie ihre menschlichen Gegenstücke, häufig Mutationen von Trp53 und Cdkn2a sowie zahlreiche andere genomische Anomalien entwickeln, die möglicherweise zur Tumorgenese beitragen²⁵. MPNSTs, die in P 0-GGFβ3-Mäusen auftreten, weisen keine inaktivierenden Nf1-Mutationen auf. Unter Verwendung genetischer Komplementierung konnten wir jedoch zeigen, dass NRG1 die Tumorgenese in P 0-GGFβ3-Mäusen hauptsächlich durch dieselben Signalkaskaden fördert, die durch den Verlust von Nf1 verändert werden²⁶; Diese Schlussfolgerung basiert auf unserer Erkenntnis, dass die Substitution der NRG1-Überexpression durch den Nf1-Verlust bei Vorliegen einer Trp53-Haploinsuffizienz (P _0-GGFβ3;Trp53^+/- Mäuse) produziert Tiere, bei denen sich MPNSTs de novo entwickeln, wie es bei cis-Nf1^+/- der Fall ist; Trp53^+/- Mäuse²⁷.

Um diese und andere Informationen zu erhalten, die zeigen, dass P 0-GGFβ3-Mäuse die Prozesse der Neurofibrom-Pathogenese und der Neurofibrom-MPNST-Progression, die bei Menschen mit NF1 beobachtet werden, genau modellieren, haben wir spezielle Methoden entwickelt, um Gewebe von diesen Tieren zu verarbeiten, ihre Tumore genau zu diagnostizieren, die in diesen Mäusen auftretenden MPNSTs zu bewerten, P_0-GGFβ3 und P_0-GGFβ3 in der frühen Passage zu etablieren und zu charakterisieren; Trp53^+/- MPNST-Kulturen und kritischer Vergleich der Pathologie von P 0-GGFβ3 PNs und MPNSTs und P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNSTs mit denen ihrer menschlichen Gegenstücke. Viele dieser Methoden sind auf andere GEM-Modelle von Neoplasien des Nervensystems verallgemeinerbar. Darüber hinaus sind einige dieser Methoden breiter auf GEM-Modelle anwendbar, in denen Neoplasien an anderen Organstellen auftreten. Daher präsentieren wir hier eine detaillierte Beschreibung dieser Methoden.

Protocol

Die hier beschriebenen Verfahren wurden von der IACUC der Medical University of South Carolina genehmigt und von ordnungsgemäß geschultem Personal in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den institutionellen Tierpflegerichtlinien des MUSC durchgeführt.

1. Bestimmung der Tumorpenetranz und des Überlebens in P 0-GGFβ3-Mäusen und Identifizierung von Tumoren in diesen Tieren zur weiteren Charakterisierung

1. Generieren Sie die Kohorte von Mäusen, die auf Tumorgenese untersucht werden. Die Anzahl der benötigten Mäuse hängt von der Penetranz des Tumorphänotyps ab. Um solche Verluste auszugleichen, beginnen Sie mit einer Kohorte, die 10-15% höher ist als die gewünschte endgültige Anzahl von Tieren.
   HINWEIS: Wir bestimmten die Tumorpenetranz in P 0-GGFβ3-Mäusen empirisch in einer ersten Kohorte von 50 Mäusen (von denen sechs aus Gründen verloren gingen, die nicht mit Neoplasien zusammenhängen (z. B. Bekämpfung)⁾²⁵.
2. Beurteilen Sie die Gesundheit der Tiere dreimal wöchentlich und notieren Sie bei jeder Untersuchung die Werte für den Körperzustand, einschließlich Gewicht und Verhaltensänderungen. Beenden Sie tumortragende oder moribunde Mäuse (siehe Anmerkung unten) mit Kohlendioxid-Euthanasie, gefolgt von einer Zervixluxation. Rekordalter beim Tod in Tagen. Wenn Tumore äußerlich sichtbar sind, notieren Sie die Tumorabmessungen (Länge, Breite und Höhe).
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass Tiere nicht über die von der IACUC genehmigte maximal zulässige Tumorgröße und/oder den humanen Endpunkt hinausgehen dürfen.
3. Erstellen Sie anhand des Sterbealters eine Kaplan-Meier-Überlebenskurve, um das mittlere Sterbealter und die Überlebensspanne zu bestimmen.
   HINWEIS: P 0-GGFβ3-Mäuse hatten ein mittleres Sterbealter von 261,5 Tagen mit einer Spanne von 74-533 Tagen; 91 % unserer Kohorte hatten multiple Neurofibrome und 71 % hatten MPNSTs²¹.
4. Stellen Sie fest, ob grob sichtbare Tumore vorhanden sind, und wenn ja, sezieren Sie sie unter sterilen Bedingungen, um festzustellen, ob der Tumor mit einem peripheren Nerv assoziiert ist, und entfernen Sie dann den Tumor. In P 0-GGFβ3 und P_0-GGFβ3; Trp53^+/- Mäuse, periphere Nervenscheidentumoren werden am häufigsten im Trigeminus- und Ischiasnerv gefunden. Auch wenn grob sichtbare Tumore nicht in Verbindung mit diesen Nerven zu sehen sind, fixieren und betten Sie diese Nerven wie unten beschrieben ein, damit sie auf das Vorhandensein von Mikrotumoren untersucht werden können. Mikrotumoren treten typischerweise in den Ganglien auf, die mit diesen Nerven verbunden sind.
5. Grob sichtbare Tumore in drei Stücke schneiden (Abbildung 1A). Verwenden Sie Stück 1 für die Histologie (Paraffinschnitte, Immunhistochemie und Histochemie). Verwenden Sie Stück 2, um frühe Übergangskulturen zu etablieren. Schnappfrostteil 3 (mit flüssigem Stickstoff) für mögliche zukünftige Experimente (z. B. Immunblots, RNA- und DNA-Isolierung).
6. Das Stück 1 in 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wird über Nacht bei 4 ^°C fixiert. Der Rest des Körpers des Tieres wird durch Eintauchen in 4 % Paraformaldehyd über Nacht bei 4 °C fixiert.

2. Paraffin-Einbettung von grob sichtbaren Tumoren und Aufbereitung von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Schnitten für die diagnostische Erstbeurteilung

1. Paraffineinbettung von grob sichtbaren Tumoren
   1. Nachdem Sie Tumorstück 1 über Nacht in 4% Paraformaldehyd fixiert haben, spülen Sie das Gewebe aus, indem Sie es 15 Minuten lang in ein PBS-Volumen legen, das mindestens 10x größer ist als das Gewebevolumen. Verwenden Sie das gleiche Volumen für alle nachfolgenden Spülungen. Wiederholen Sie zwei weitere 15-minütige PBS-Spülungen und verwenden Sie für jede Spülung eine frische Menge PBS.
   2. Tumorstück 1 auf 70% Ethanol übertragen. Halten Sie das Gewebe 24 h lang bei 4 °C in 70%igem Ethanol. Falls gewünscht, lagern Sie das Gewebe langfristig unter diesen Bedingungen.
      HINWEIS: Die Schritte 2.1.1 bis 2.1.7 sind für Prüfer vorgesehen, die keinen Zugang zu einer kommerziellen Gewebeverarbeitungsmaschine haben. Wenn der Prüfer Zugang zu einem Gewebeprozessor hat, wird das Gewebe durch abgestufte Ethanole und Xylole gemäß dem programmierten Instrumentenprotokoll verarbeitet.
   3. Tumorstück 1 auf 80% Ethanol für 30 min bei Raumtemperatur übertragen. Wiederholen Sie die Inkubation für weitere 30 Minuten in einem frischen Volumen von 80 % Ethanol.
   4. Tumorstück 1 auf 95% Ethanol für 75 min bei Raumtemperatur übertragen. Wiederholen Sie die Inkubation noch zweimal, jeweils für weitere 75 Minuten in einem frischen Volumen von 95 % Ethanol.
   5. Tumorstück 1 auf 100% Ethanol übertragen und 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie die 60-minütige Inkubation noch zweimal, jedes Mal mit einem frischen Volumen von 100 % Ethanol.
   6. Tumorstück 1 in ein Lösungsmittel auf d-Limonen-Basis überführen und 30-60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Tumorstück 1 in ein frisches Volumen des Lösungsmittels auf d-Limonen-Basis überführen und weitere 30-60 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   7. Tumorstück 1 für 1 h bei 60 ^°C in 1:1 Paraffin/d-Limonen-basiertes Lösungsmittel überführen. Das 1:1 Paraffin/d-Limonen-basierte Lösungsmittel verwerfen und Tumorstück 1 auf 60 ^°C Paraffin übertragen und 20 min bei 60 °C inkubieren. Die Inkubation in einem frischen Volumen von 60 ^°C Paraffin noch einmal für 20 min wiederholen. Inkubieren Sie Tumorstück 1 über Nacht bei 60 ^°C in Paraffin.
   8. Gießen Sie eine Basisschicht Paraffin in eine Histologieform aus Stahl und lassen Sie sie erstarren. Übertragen Sie das Tumorstück 1 auf die Oberfläche des Basisparaffins und bedecken Sie das Gewebe unmittelbar nach der Positionierung mit 60 ^°C Paraffin und legen Sie die Gewebekassette auf das geschmolzene Paraffin und bringen Sie es in Kontakt. Übertragen Sie die Form auf die kalte Seite der Einbettstation und lassen Sie sie 10-15 Minuten lang erstarren.
   9. Den Paraffinblock mit der angebrachten Gewebekassette aus der Form nehmen. Verwenden Sie die beigefügte Gewebekassette, um den Block während des Schneidens in das Mikrotom zu klemmen.
      HINWEIS: Der Paraffinblock kann nun unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Bereiten Sie Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Schnitte von grob sichtbaren Tumoren vor.
   1. Schneiden Sie 4-5 μm große Abschnitte des Tumorgewebes mit einem Mikrotom und montieren Sie sie auf positiv geladene Glasobjektträger.
   2. Um eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) durchzuführen, entparaffinisieren Sie die Gewebeschnitte, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel auf d-Limonen-Basis inkubieren. Wiederholen Sie die Inkubation in einem frischen Volumen eines Lösungsmittels auf d-Limonen-Basis für 10 Minuten.
   3. Die Objektträger auf 100% Ethanol umfüllen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Objektträger in ein frisches Volumen von 100 % Ethanol überführen und weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Die Objektträger auf 95%iges Ethanol übertragen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Objektträger in ein frisches Volumen von 95 % Ethanol überführen und weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. Die Objektträger auf 70%iges Ethanol übertragen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann auf 50% Ethanol umfüllen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   6. Die Objektträger in destilliertes Wasser geben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   7. Färben Sie die Objektträger, indem Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in Hämatoxylin tauchen. 1-2 Min. mit fließendem Leitungswasser abspülen. Unterscheiden Sie, indem Sie Objektträger 2-5x in 0,5% Salzsäure in 70% Ethanol tauchen. 1-2 Min. in fließendem Leitungswasserbad abspülen. Legen Sie die Objektträger 10 s lang in 95% Ethanol mit 0,5% Essigsäure.
   8. Färben Sie die Objektträger 30 s lang bei Raumtemperatur mit Eosin-Y und übertragen Sie die Objektträger dann für 5 min auf 100% Ethanol. Die Proben werden 5 Minuten lang in einem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis gelöscht.
   9. Deckgläser mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis montieren, während das Objektträger noch mit dem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis benetzt ist. Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht aushärten.
      HINWEIS: Verwenden Sie kein Eindeckmedium auf Wasserbasis.
3. Bereiten Sie Gewebe ohne grob sichtbare Tumoren vor, um plexiforme Neurofibrome und Mikro-MPNSTs zu identifizieren. Betten Sie das Gewebe in Paraffin ein, bereiten Sie histologische Schnitte vor und färben Sie diese Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin.
   1. Entfernen Sie die inneren Organe und betten Sie repräsentative Teile jedes Organs in Paraffin ein, um H&E-gefärbte Schnitte vorzubereiten, die auf mikroskopische Anzeichen von Tumoren untersucht werden (Abbildung 1B). Entfernen Sie den Kopf, die Vordergliedmaßen, die Hintergliedmaßen und den Schwanz (Abbildung 1C). Um das Rückenmark und die Nervenwurzeln in situ auf Anzeichen von Nervenwurzeltumoren zu untersuchen, entkalken Sie die Wirbelsäule und die zugehörigen Rippen und Weichteile durch Eintauchen in 0,3 M EDTA/4% Paraformaldehye (pH 8,0) für 48-72 h bei 4 ^°C; Spülen Sie die Proben dann mit 1x PBS. Stellen Sie am Ende der Entkalkung sicher, dass die Entkalkung abgeschlossen ist, indem Sie versuchen, die Wirbelsäule mit einer Nadel zu durchstechen. Die Entkalkung ist erfolgreich, wenn die Nadel leicht in den Knochen eindringt, ohne zu knirschen.
   2. Schneiden Sie die entkalkte Wirbelsäule und die zugehörigen Strukturen in Blöcke, die in eine Gewebekassette passen. Dehydrieren Sie durch abgestufte Ethanole, gefolgt von einem Lösungsmittel auf d-Limonen-Basis, wie in den Schritten 2.1.2 bis 2.1.7 beschrieben. In Paraffin einbetten und 4-5 μm-Schnitte wie in den Schritten 2.1.7-2.2.1 beschrieben vorbereiten. H&E-Färbungen wie in den Schritten 2.2.2-2.2.9 beschrieben durchführen; Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht aushärten.

3. Identifizieren Sie potenzielle plexiforme Neurofibrome und führen Sie spezielle Färbungen durch, um die Diagnosen zu bestätigen

HINWEIS: Wir empfehlen dringend, einen erfahrenen Human- oder Veterinärpathologen in die Beurteilung von H&E und speziellen Färbungen von GEM-Tumorschnitten einzubeziehen.

1. Untersuchen Sie die H&E-gefärbten Objektträger, die wie oben beschrieben mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie hergestellt wurden, um potenzielle Tumoren der peripheren Nervenscheide zu identifizieren. Da Neurofibrome und MPNSTs innerhalb peripherer Nerven auftreten, ist es wichtig zu bestimmen, ob mikroskopisch kleine Tumoren mit einem peripheren Nerv assoziiert sind. Identifizieren Sie Blockaden mit potenziellen Tumoren der peripheren Nervenscheide, damit Immunfärbungen und andere spezielle Färbungen durchgeführt werden können, um Diagnosen zu bestätigen oder zu widerlegen.
2. Unterscheidung potenzieller PNs von MPNSTs/anderen hochgradigen Neoplasien basierend auf histologischen Merkmalen, die bei der Hellfelduntersuchung von H&E-gefärbten Schnitten beobachtet wurden. Menschliche PNs sind leicht hyperzelluläre Neoplasien, die überwiegend aus Zellen mit länglichen, oft welligen Kernen bestehen. In vielen Bereichen sind die Zellen locker gepackt und können durch myxoides extrazelluläres Material getrennt sein; PNs in P 0-GGFβ3-Mäusen haben ein ähnliches Aussehen. Mitosen sind typischerweise nicht vorhanden; wenn dies der Fall ist und der Tumor mäßig bis stark hyperzellulär ist, handelt es sich bei dem Tumor um ein MPNST oder eine andere Art von hochgradigem Neoplasma (siehe unten).
3. PNs bestehen aus einer Mischung aus neoplastischen Schwann-Zellen und anderen nicht-neoplastischen Zelltypen wie Mastzellen. Um die Identität eines PN zu bestätigen, führen Sie Immunfärbungen für die Schwann-Zellmarker S100β und Sox10 sowie den Mastzellmarker CD117 (c-Kit) an Schnitten von Blöcken durch, die potenzielle PNs enthalten, die bei der H&E-Untersuchung identifiziert wurden (siehe Abschnitt 3.4 für alternative Mastzellmarker-Färbeoptionen). Führen Sie Ki67-Immunfärbungen durch, um niedrige Proliferationsraten zu bestätigen.
   HINWEIS: Tabelle 1 listet die Antigenmarker auf, die für die routinemäßige Identifizierung von plexiformen GEM-Neurofibromen (S100β, Sox10, CD117, Ki67), die Diagnose von MPNSTs und für eine vollständige Beurteilung anderer in Neurofibromen vorhandener Zelltypen verwendet werden; wir färben diese letzteren Antigene nur, wenn wir zum ersten Mal ein neues GEM-Modell beschreiben. Konsultieren Sie das Datenblatt des Antikörperherstellers für empfohlene Bedingungen. Beachten Sie, ob die Beilage des Antikörperherstellers die Antigenentnahme empfiehlt; Nicht alle Antigene müssen abgerufen werden, um nachweisbar zu sein.
   1. Bereiten Sie 4-5 μm-Schnitte aus den ausgewählten Paraffinblöcken vor und montieren Sie sie auf positiv geladene Objektträger. Entparaffinieren Sie die Abschnitte wie in den Schritten 2.2.2 bis 2.2.6 beschrieben.
   2. Spülen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 3-5 min.
   3. Wenn der Antikörperhersteller eine Antigengewinnung empfiehlt, bereiten Sie Citratpuffer vor. Kombinieren Sie 9 ml Zitronensäurelösung (10,5 g Zitronensäure in 500 ml destilliertem Wasser) und 41 ml Natriumcitratlösung (14,7 g Natriumcitrat in 500 ml destilliertem Wasser).
   4. Führen Sie die Antigengewinnung durch, indem Sie Objektträger 20 Minuten lang in Citratpuffer in einen beheizten Reiskocher legen.
   5. Übertragen Sie Objektträger 10 Minuten lang in 3% Wasserstoffperoxid/1x PBS, um die Peroxidaseaktivität im Gewebe zu beseitigen.
      Anmerkungen: Machen Sie diese Lösung jedes Mal frisch und verwenden Sie nicht die Stammlösung von Wasserstoffperoxid, wenn sie älter als 3-4 Monate ist.
   6. Spülabschnitte in 1x PBS.
   7. Blockabschnitte mit Blockierpuffer (2% BSA, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) für 1 h. Dias kurz in 1x PBS ausspülen.
   8. Fügen Sie den Gewebeschnitten einen primären Antikörper hinzu. Bereiten Sie Primärantikörper in verdünntem Blockierungspuffer vor. Objektträger 2 Stunden bei 37 ^°C oder über Nacht bei 4 ^°C inkubieren.
   9. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 1x PBS. Wiederholen Sie dies 3x.
   10. Inkubieren Sie das Gewebe mit biotinylierten Sekundärantikörpern für 1-2 h.
   11. Bereiten Sie Diaminobenzidin (DAB)-Lösung basierend auf dem Protokoll des Herstellers vor und tauchen Sie die Objektträger 2-10 Minuten lang in die Lösung. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in Wasser.
   12. Streichen Sie die Abschnitte durch Eintauchen in Hämatoxylin für 10-15 Minuten. Fließendem Wasser aussetzen, bis es klar ist. Tauchen Sie Objektträger schnell in Alkohol und spülen Sie Objektträger in Wasser ab.
   13. Dehydrieren Sie Objektträger in abgestuftem Ethanol, indem Sie Objektträger 4-5x pro Lösung schnell in 70 % Ethanol, 95 % Ethanol und dann 100 % Ethanol tauchen. Objektträger 2 Minuten lang in einem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis inkubieren. Inkubieren Sie Objektträger in einer zweiten Charge eines Lösungsmittels auf D-Limonen-Basis für 2 Minuten.
   14. Dia mit einem Einbettmedium auf Xylolbasis einbinden.
   15. Untersuchen Sie Objektträger mit Hellfeldmikroskopie.
   16. Für Immunfluoreszenz lassen Sie die Schritte 3.3.10-3.3.15 aus. Inkubieren Sie stattdessen Gewebe mit speziesspezifischen Sekundärantikörpern, die in Blockierungspuffer verdünnt sind, für 1-2 h.
   17. Rutschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in PBS aus. Wiederholen Sie dies 3x.
   18. Montieren Sie Objektträger mit 1x PBS/Glycerin.
   19. Untersuchen Sie Objektträger mit Fluoreszenzmikroskopie.
4. Alternative Methode zur Färbung von Mastzellen: Toluidinblau-Färbung
   1. Bereiten Sie Toluidinblau-Stammlösung vor, indem Sie 1 g Toluidinblau O in 100 ml 70%igem Ethanol auflösen.
   2. Bereiten Sie 1% ige Natriumchlorid (NaCl)-Lösung vor, indem Sie 0,5 g NaCl in 50 ml destilliertem Wasser auflösen. Zum Auflösen mischen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf ca. 2,0-2,5 ein.
      HINWEIS: Diese NaCl-Lösung muss bei jeder Färbung frisch gemacht werden.
   3. Bereiten Sie Toluidinblau-Arbeitslösung vor, indem Sie 5 ml Toluidinblau-Stammlösung zu 45 ml der 1%igen NaCl-Lösung hinzufügen. Gut mischen und darauf achten, dass der pH-Wert etwa 2,3 beträgt.
      HINWEIS: Ein pH-Wert von mehr als 2,5 führt zu einer Färbung mit weniger Metachromasie. Machen Sie diese Lösung jedes Mal frisch, wenn eine Färbung durchgeführt wird.
   4. Entparaffinieren Sie 4-5 μm-Abschnitte, die auf positiv geladenen Objektträgern montiert sind, wie in den Schritten 2.2.2-2.2.6 beschrieben. Waschen Sie entparaffinisierte Abschnitte 2 Minuten lang unter fließendem Wasser.
   5. Färbeabschnitte in toluidinblauer Arbeitslösung für 2-3 min. In destilliertem Wasser 2 Min. waschen.
   6. Dehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie 10x in 95%iges Ethanol tauchen. Tauchen Sie 10x in 100% Ethanol. Tauchen Sie die Objektträger noch 10 Mal in frisches 100%iges Ethanol.
   7. Objektträger 2 Minuten lang in einem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis inkubieren. Inkubieren Sie Objektträger in einer zweiten Charge eines Lösungsmittels auf D-Limonen-Basis für 2 Minuten.
   8. Montieren Sie Deckgläser mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis, während das Objektträger noch mit einem Lösungsmittel auf D-Limonen-Basis benetzt ist.
      HINWEIS: Verwenden Sie kein Eindeckmedium auf Wasserbasis.
   9. Untersuchen Sie Objektträger mit Hellfeldmikroskopie. Identifizieren Sie Mastzellen durch das Vorhandensein von dunkelvioletten Körnchen in ihrem Zytoplasma. Andere Zelltypen sind hellblau gefärbt.

4. Spezielle Färbungen zur Diagnose von MPNSTs und zum Ausschluss alternativer Diagnosen

1. Das histologische Erscheinungsbild von humanen MPNSTs ist sehr variabel und mehrere verschiedene Tumorarten haben ein ähnliches Erscheinungsbild wie MPNSTs²⁸. Da MPNSTs von der Schwann-Zelllinie abgeleitet sind, bestimmen Sie, ob der Tumor von einem peripheren Nerv oder innerhalb eines vorhandenen gutartigen PN entsteht, durch grobe Untersuchung oder hellfeldmikroskopische Untersuchung von H&E-gefärbten Schnitten. Obwohl MPNSTs gelegentlich nicht in Verbindung mit einem peripheren Nerv oder PN gefunden werden (normalerweise aufgrund einer versehentlichen Trennung vom Nerv während der Dissektion, Zerstörung des bereits vorhandenen PN durch MPNST-Überwucherung oder weil die Läsion metastasiert ist), suchen Sie nach der Assoziation des Tumors mit einem Nerv oder PN, da die Diagnose weniger wahrscheinlich ist, wenn der Tumor nicht mit einem Nerv oder PN assoziiert ist.
2. Bereiten Sie 4-5 μm-Schnitte aus Paraffinblöcken vor, die potenzielle MPNSTs enthalten, und montieren Sie sie wie in Schritt 2.2.1 beschrieben auf positiv geladene Objektträger. Entparaffinieren Sie die Abschnitte wie in den Schritten 2.2.2 bis 2.2.6 beschrieben.
3. Führen Sie eine Immunhistochemie mit dem in Tabelle 2 angegebenen Antikörperpanel durch, wie in den Schritten 3.3.1 bis 3.3.15 beschrieben.
4. Untersuchen Sie die Immunfärbungen durch Hellfeldmikroskopie. Da MPNSTs eine Schwannsche Differenzierung zeigen, suchen Sie nach einheitlicher oder fleckiger Immunreaktivität für S100β, Nestin und Sox10. Wenn die Tumoren für diese drei Marker nicht positiv sind, beziehen Sie sich auf Tabelle 2 , um die Diagnose zu stellen.
   HINWEIS: MPNSTs von Mensch und Maus können eine divergente Differenzierung aufweisen. Zum Beispiel zeigen einige menschliche MPNSTs eine fokale Rhabdomyoblastendifferenzierung (diese Varianten werden als maligne Triton-Tumoren bezeichnet); obwohl diese Neoplasien für die Schwannschen Marker gefärbt sind, exprimieren sie auch Muskelmarker wie Desmin, MyoD1 und Myogenin. Die Immunreaktivität für diese letzteren Marker sollte die Forscher nicht davon abhalten, den Tumor als MPNST zu diagnostizieren. Obwohl mehrere Mausmodelle, die das SS18-SSX-Fusionsgen bedingt exprimieren, etabliert wurden, um die Pathogenese des Synovialsarkoms²⁹ zu modellieren, sind nach unserem besten Wissen keine Synovialsarkommodelle bekannt, die spontan das äquivalente Fusionstranskript erzeugen. Folglich suchen wir nicht nach SS18-SSX-Fusionstranskripten in GEM-Tumoren und verlassen uns stattdessen auf immunhistochemische Profile.

5. Einstufung der MPNSTs

1. Stellen Sie fest, ob eine Tumornekrose, ein Kennzeichen von MPNSTs des WHO-Grades IV, vorliegt. Achten Sie bei MPNSTs Grad IV auf eine ausgeprägte Hyperzellularität, eine lebhafte mitotische Aktivität (≥4 Mitosen pro 10 Hochleistungsfelder (40x)) und zytologische Atypien.
   1. Wenn keine Nekrose vorliegt, beurteilen Sie den Tumor, um festzustellen, ob Hyperzellularität, lebhafte mitotische Aktivität und zytologische Atypie vorliegen. Wenn diese Merkmale alle in Abwesenheit von Nekrose vorhanden sind, stufen Sie den Tumor als WHO-Grad-III-MPNST ein.
   2. WHO-Grad-II-Tumoren sind durch eine erhöhte Zellularität gekennzeichnet, jedoch in geringerem Maße als WHO-MPNSTs der Grade III und IV. Die Kerne von Tumorzellen in einem MPNST des WHO-Grades II zeigen eine erhöhte Größe (mehr als die 3-fache Größe der Tumorzellkerne bei Neurofibromen) und Hyperchromasie. Eine erhöhte mitotische Aktivität (<4 Mitosen pro 10 Hochleistungsfelder) ist mit WHO-Grad-II-Tumoren verbunden, aber keine Voraussetzung dafür.
      HINWEIS: Da höhergradige Tumoren typischerweise von niedriggradigen Tumoren fortschreiten, können niedriggradige und hochgradige Regionen im selben MPNST vorhanden sein. In diesem Fall wird der Grad des Tumors durch die höchstgradige Region bestimmt.
      HINWEIS: Unter Humanpathologen herrscht Kontroverse darüber, ob das oben beschriebene WHO-Bewertungssystem die Patientenergebnisse vorhersagt, und einige dieser Pathologen ziehen es stattdessen vor, MPNSTs einfach als minderwertig oder hochgradig zu klassifizieren. Nach diesem Schema weisen hochgradige MPNSTs eine ausgeprägte zytologische Atypie, eine lebhafte mitotische Aktivität (>5 Mitosen pro 10 Hochleistungsfelder) und eine ausgeprägte Hyperzellularität mit oder ohne Nekrose auf. Niedriggradige MPNSTs haben keine Nekrose, zeigen aber mitotische Aktivität, zytologische Atypie und Zellularität, die zwischen einem hochgradigen MPNST und einem atypischen neurofibromatösen Neoplasma mit unbekanntem biologischem Potenzial (ANNUBP) liegt. Wir bevorzugen das oben beschriebene System, da die Unterscheidung zwischen einem ANNUBP und einem minderwertigen MPNST für Ermittler, die nicht lange Erfahrung mit diesen Entitäten haben, eine Herausforderung darstellen kann.

6. Vorbereitung von Kulturen von P 0-GGFβ3 MPNST-Zellen der frühen Passage

1. Kultivierung von P 0-GGFβ3-Tumorzellen aus frischem Tumorstück 2 in der frühen Passage (Schritt 1.5, Abbildung 1A). Halten Sie von diesem Zeitpunkt an sterile Bedingungen aufrecht.
   1. Dissoziieren Sie den Tumor, indem Sie ihn in kleine (2-4 mm) Stücke schneiden und in DMEM10 (Dulbeccos minimales essentielles Medium) mit 10% fötalem Kälberserum, 2 μmol/L Forskolin und 10 nmol/L Neuregulin 1β (NRG1β) in 100-mm-Gewebekulturschalen zerkleinern.
   2. Lassen Sie die Zellen bei 37 ^°C in 5% CO₂ aus den zerkleinerten Gewebefragmenten herauswachsen, bis die Platten zusammenfließen. Wechseln Sie alle 3-4 Tage das Medium.
   3. Teilen Sie die Zellkultur. Entfernen Sie das Medium aus dem 100-mm-Geschirr und spülen Sie die Zellen mit PBS. Entfernen und entsorgen Sie gehacktes Gewebe. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin für 2-5 Minuten bei Raumtemperatur hinzu. Um die Zellablösung zu fördern, klopfen Sie vorsichtig auf die Platte und prüfen Sie sie mit einem Lichtmikroskop auf Ablösung. Verlängern Sie die Trypsin-Inkubation nach Bedarf.
   4. Neutralisieren Sie Trypsin durch Zugabe von 2 ml DMEM10. Die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen und Pelletzellen bei 500 × g für 5 min umfüllen. Entfernen Sie das Medium und geben Sie 5 ml frisches DMEM10 in das Pellet.
   5. Verteilen Sie die Zellsuspension auf zwei bis vier 100-mm-Schalen, die DMEM10 enthalten. Teilen Sie die Zellen nicht länger als fünf Passagen (Schritte 6.1.3 und 6.1.4) und halten Sie sie in DMEM ohne Forskolin und NRG1β. Denken Sie daran, die Zellen an Durchgang 2 für die zukünftige Verwendung einzufrieren.

7. Überprüfung der Identität von MPNST-Zellen der frühen Passage durch Immunzytochemie

1. Legen Sie sterile 18 mm #1,5 runde Glasdeckgläser in die Vertiefungen von sterilen 6-Well-Gewebekulturschalen.
   1. Geben Sie die Poly-L-Lysin/Laminin-Lösung in einem Volumen in die Vertiefungen, das ausreicht, um das Deckglas zu bedecken. Verschließen Sie die Platte mit Plastikfolie, um die Verdunstung zu minimieren. Über Nacht bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Deckgläser am nächsten Morgen 3x mit sterilem PBS.
      HINWEIS: Wir haben versucht, MPNST-Zellen mit früher Passage auf unbeschichteten Deckgläsern zu plattieren, und haben festgestellt, dass die Zellen ohne Poly-L-Lysin/Laminin-Beschichtung nicht gut haften.
   2. Platten Sie 10.000 Zellen auf das Deckglas, indem Sie vorsichtig 2 ml der Zellsuspension in Wachstumsmedien in jede Vertiefung geben, die das Deckglas enthält. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einem Gewebekultur-Inkubator.
   3. Am nächsten Morgen spülen Sie die Deckgläser 2 x 5 Minuten lang mit PBS aus.
   4. Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 18 min bei Raumtemperatur fixieren.
   5. Spülen Sie die Deckgläser 3 x 5 min mit PBS aus. Verschließen Sie die Platte auf Wunsch mit Plastikfolie und lagern Sie sie zu diesem Zeitpunkt bei 4 °C.
   6. Machen Sie frische 50 mM NH₄Cl in PBS. Aldehyde durch Inkubation von Deckgläsern in 50 mM NH₄Cl in PBS für 10 min bei Raumtemperatur abschrecken.
   7. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie Deckgläser in 0,3% Triton X-100 in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Deckgläser 3 x 5 min mit PBS waschen.
   8. Blockieren Sie die unspezifische Bindung durch Inkubieren von Deckgläsern in Blockierungspuffer (1 x PBS mit 1 % Rinderserumalbumin, 0,2 % fettfreier Trockenmilch und 0,3 % Triton X-100) für 1 h bei Raumtemperatur.
   9. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die die im Muttertumor vorhandenen MPNST-Marker erkennen (typischerweise S100β, Nestin und Sox10), verdünnt auf die vorgegebene optimale Verdünnung im Blockierungspuffer. Die Platte mit Plastikfolie umwickeln und über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
   10. 3 x 5 min mit PBS waschen, um den ungebundenen Primärantikörper zu entfernen. Fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper, verdünnt in Blockierungspuffer, zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Vor Licht schützen.
   11. 3 x 5 min mit PBS waschen. Deckgläser in 1-5 μg Hoechst-Farbstoff 10 min inkubieren. Weiter vor Licht schützen.
   12. Deckgläser mit PBS 5 Min. waschen. Montieren Sie Objektträger mit 1:1 1x PBS/Glycerin. Aufnahme mit einem Fluoreszenzmikroskop.

8. Allotransplantat von Tumorzellen der frühen Passage zum Nachweis der Tumorigenität

1. Züchten Sie P 0-GGFβ3 MPNST-Zellen in der frühen Passage von DMEM10 auf 80% Konfluenz. Spülen Sie die Zellen einmal mit der ausgewogenen Salzlösung von Hanks (HBSS) bei Raumtemperatur. Behandeln Sie die Zellen 30 s bis 1 min lang mit einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung, um sie vom Substrat zu entfernen. Fügen Sie 5 ml DMEM10 pro 1 ml eines nicht-enzymatischen Zelldissoziationsreagenzes hinzu.
   HINWEIS: Die zelluläre Dissoziation kann viel länger dauern, bis zu 10-20 Minuten. Bitte beachten Sie das Protokoll des Herstellers.
   HINWEIS: Züchten Sie keine Zellen bis zum Zusammenfluss, da dies die Wirksamkeit des Transplantats verringert.
   1. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Schleudern Sie die Zellen bei 5 × g für 5 min herunter und resuspendieren Sie sie in einer Konzentration von 1-2 × 10⁶ Zellen pro 100 μl DMEM10. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis sie für die Injektion bereit sind.
   2. Betäuben Sie NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ) Mäuse in der Induktionskammer eines Isofluran-Verdampfers. Legen Sie das Tier auf den Bauch und sterilisieren Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol. Lassen Sie die Stelle vor der Injektion an der Luft trocknen. Lassen Sie die Zellen vor der Injektion auf Raumtemperatur kommen.
   3. Injizieren Sie 1-2 x 10⁶ Zellen subkutan in die rechte Flanke. Legen Sie die Maus allein in einen bettfreien Käfig und lassen Sie sie sich erholen. Stellen Sie sicher, dass sich nur ein Teil des Käfigs auf einem Heizkissen befindet, um Unterkühlung zu vermeiden. Dies bietet eine Zone, in die sich die Maus bewegen kann, wenn sie überhitzt wird.
      HINWEIS: Wir transplantieren mindestens drei Mäuse mit jeder frühen Passagekultur, da einige Transplantate möglicherweise nicht benötigt werden.
   4. Lassen Sie das Transplantat 15-60 Tage lang wachsen; Bewerten Sie die Tiergesundheit 3x wöchentlich und zeichnen Sie bei jeder Untersuchung Körperzustandswerte auf, einschließlich Gewicht und Verhaltensänderungen. Beenden Sie Mäuse, die die maximal zulässige Transplantatgröße erreicht haben, oder sterbende Mäuse mit Kohlendioxid-Euthanasie, gefolgt von einer Zervixluxation. Rekordalter beim Tod in Tagen. Wenn Tumore äußerlich sichtbar werden, notieren Sie die Tumorabmessungen (Länge, Breite und Höhe).
      HINWEIS: Unserer Erfahrung nach transplantieren verschiedene MPNST-Kulturen mit unterschiedlicher Effizienz und unterscheiden sich in der Zeit, die für das Transplantatwachstum benötigt wird. Tiere dürfen nicht über die von der IACUC genehmigte maximal zulässige Tumorgröße und/oder den humanen Endpunkt hinausgehen.
2. Entnehmen Sie den Tumor, fixieren Sie ihn in 4% Paraformaldehyd, betten Sie ihn in Paraffin ein und führen Sie H&E-Färbungen durch, wie in den Abschnitten 2.1-2.2.9 beschrieben, um zu überprüfen, ob es sich bei dem Allotransplantat um einen Tumor und nicht um ein reaktives Gewebe handelt. Falls erforderlich, immunfärben Sie das Transplantat für die Marker, die im Muttertumor vorhanden waren.

Results

Abbildung 2 zeigt Beispiele für grob offensichtliche Neoplasien, die bei P 0-GGFβ3-Mäusen auftreten. Tumoren, die mit bloßem Auge leicht zu erkennen sind, können als Massen gesehen werden, die sich in Körperregionen ausdehnen, wie in Abbildung 2A (Pfeil) dargestellt. Bei der Bestimmung, ob es sich bei dem Neoplasma möglicherweise um einen peripheren Nervenscheidentumor handelt, muss unbedingt festgestellt werden, dass der Tumor mit einem peripheren Nerv assoziiert ist. In diesem Fall zeigt ein MRT-Scan (Abbildung 2B), dass der Tumor mit dem Ischiasnerv (Pfeilspitze) assoziiert ist; Diese Assoziation wurde bestätigt, nachdem die Maus eingeschläfert und der Tumor seziert wurde. Es ist zu beachten, dass eine große Größe nicht unbedingt darauf hinweist, dass der Tumor bösartig ist. In diesem Fall zeigte eine histologische Untersuchung des Tumors (Abbildung 2C), dass es sich um ein Neurofibrom handelte. Am häufigsten werden grob offensichtliche Tumore jedoch erst bei der Autopsie der Maus identifiziert. Abbildung 2D zeigt einen großen, fleischigen MPNST, der im Plexus brachialis dieses Tieres entstand.

Abbildung 3 zeigt repräsentative Beispiele für MPNSTs und Neurofibrome von P 0-GGFβ3-Mäusen, die nach den in Protokollabschnitt 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Abbildung 3A-J zeigt zehn Beispiele für unabhängig voneinander auftretende MPNSTs aus unserer P 0-GGFβ3-Mauskolonie. Beachten Sie, dass das histologische Erscheinungsbild von MPNSTs sehr variabel sein kann, selbst zwischen MPNSTs, die unabhängig voneinander im selben Tier auftreten. Diese histologische Variabilität verdeutlicht, warum wir die Diagnose von P 0-GGFβ3 MPNSTs routinemäßig mit immunhistochemischen Färbungen bestätigen. Wir möchten auch darauf hinweisen, dass andere, scheinbar nicht verwandte Tumortypen sporadisch mit geringer Häufigkeit in einigen Inzucht-Mausstämmen auftreten (z. B. haben wir mehrmals Lymphome in P 0-GGFβ3-Mäusen gefunden, die das Transgen auf einem C57BL/6J-Hintergrund tragen), was die Bedeutung der Immunhistochemie zur Bestätigung von Tumordiagnosen weiter unterstreicht. Trotz der Variabilität ihres histologischen Erscheinungsbildes waren alle zehn in Abbildung 3A-J dargestellten Tumoren immunreaktiv für S100β und Nestin und negativ für Marker anderer Tumorarten. Abbildung 3K zeigt ein repräsentatives Bild einer ordnungsgemäß entkalkten Wirbelsäule und des zugehörigen Gewebes. Beachten Sie, dass das Rückenmark, die Nervenwurzeln, der Wirbelkörper und die Skelettmuskulatur alle ihre richtige anatomische Beziehung zueinander beibehalten. Abbildung 3L ist ein Bild des Wirbelkörpers und des darüber liegenden Rückenmarks. Da dieses Gewebe richtig entkalkt ist, hat sich der Knochen leicht geschnitten, ohne zu zerkleinern oder zu falten, und das Knochenmark ist in den Markräumen leicht zu erkennen. Wenn das Gewebe nicht richtig entkalkt worden wäre, hätte es sich an der Mikrotomklinge verfangen und wäre aus dem Schnitt herausgerissen worden, was benachbarte Gewebe (Rückenmark, Spinalnervenwurzeln und Skelettmuskulatur) erheblich geschädigt hätte. Abbildung 3M zeigt ein repräsentatives Bild eines Neurofibroms, das in einer dorsalen Nervenwurzel in einer P 0-GGFβ3-Maus auftritt. Beachten Sie, dass dieser Tumor weniger zellulär ist als die in Abbildung 3A-J gezeigten MPNSTs. Die Schlüsseldiagnose für Neurofibrome ist, dass sie aus einer komplexen Mischung aus neoplastischen Schwann-Zellen und nicht-neoplastischen Mastzellen, Makrophagen, Fibroblasten und perineuralen Elementen bestehen, die den Nerv infiltrieren und Axone auseinander spreizen.

Abbildung 4 zeigt Beispiele für die Färbungen, die für die Erstidentifizierung eines plexiformen Neurofibroms und die Unterscheidung zwischen einem plexiformen Neurofibrom und einem MPNST am nützlichsten sind. Abbildung 4A zeigt die S100β-Immunreaktivität in einem P 0-GGFβ3-plexiformen Neurofibrom. Beachten Sie, dass die S100β-Immunreaktivität nur in einer Subpopulation von Zellen offensichtlich ist, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass Neurofibrome aus einer Mischung neoplastischer Schwann-Zellen und anderer nicht-neoplastischer Elemente (Fibroblasten, Mastzellen, Makrophagen, perineurialähnliche Zellen, eine schlecht definierte CD34-immunreaktive Zellpopulation und Gefäße) bestehen. Leider unterscheidet die fleckige S100β-Färbung nicht zwischen plexiformen Neurofibromen und MPNSTs, da die S100β-Färbung in MPNSTs lückenhaft sein kann (H&E-Färbung ist für diesen Zweck nützlich; da MPNSTs jedoch typischerweise zellulärer sind als plexiforme Neurofibrome [siehe Abbildung 3]). Neoplastische Schwann-Zellen sind auch immunreaktiv für das intermediäre Filamentnestin, wie in dem in Abbildung 4B dargestellten P 0-GGFβ3-MPNST gezeigt. Neoplastische Schwann-Zellen zeigen auch häufig eine nukleäre Immunreaktivität für den Transkriptionsfaktor Sox10, wie in einem MPNST in Abbildung 4C gezeigt. Merkmale, die für die Unterscheidung zwischen plexiformen Neurofibromen und MPNSTs nützlich sind, sind das Vorhandensein von Mastzellen und eine ausgeprägte Immunreaktivität für den Ki67-Proliferationsmarker. Abbildung 4D zeigt eine Unna-Färbung, die an einem P 0-GGFβ3 plexiformen Neurofibrom durchgeführt wurde, um das Vorhandensein von Mastzellen hervorzuheben, die durch die markante metachromatische violette Färbung ihrer zytoplasmatischen Granula leicht zu erkennen sind. Mastzellen sind in MPNSTs nicht vorhanden. Im Gegensatz dazu ist die Ki67-Immunreaktivität bei plexiformen Neurofibromen praktisch nicht vorhanden, wie in dem in Abbildung 4E gezeigten P 0-GGFβ3-Tumor zu sehen ist. Die nukleäre Ki67-Markierung ist typischerweise in einem sehr hohen Anteil von Tumorzellen vorhanden, wie im mikroskopischen MPNST zu sehen ist, das im Trigeminusganglion einer P 0-GGFβ3-Maus entsteht (Abbildung 4F).

Abbildung 5 zeigt Beispiele für die Färbungen, die wir durchführen, um die zelluläre Zusammensetzung von Neurofibromen in einem neu entwickelten GEM-Modell vollständig zu charakterisieren. Obwohl die in dieser Abbildung gezeigten Färbungen bei menschlichen dermalen Neurofibromen erhalten wurden, sind sie im Aussehen identisch mit dem, was wir bei GEM-Tumoren gesehen haben. Die Immunreaktivität für CD117 (c-Kit) ist in Mastzellen innerhalb von Neurofibromen vorhanden und hat daher eine Verteilung, die der bei Unna-Färbungen sehr ähnlich ist (siehe Abbildung 3A). Makrophagen sind auch in Neurofibromen verstreut vorhanden, wie beim Pan-Makrophagen-Marker Iba1 zu sehen ist (siehe Abbildung 5D); Dazu gehören Unterklassen von Makrophagen, die für CD163 und CD86 immunreaktiv sind (siehe Abbildung 5B bzw. Abbildung 5C). Ein Teil des Schwannschen Elements in Neurofibromen zeigt auch eine nukleäre Immunreaktivität für Sox10. Fibroblasten können durch ihre Immunreaktivität für TCF4 hervorgehoben werden. In Abbildung 5G markiert CD31 die vaskulären Elemente innerhalb des Neurofibroms, während CD34, wie in Abbildung 5H gezeigt, eine rätselhafte dendritische Population von Zellen markiert, von denen angenommen wurde, dass sie entweder eine Subpopulation von residenten Gewebemakrophagen³⁰ oder eine neue Population von Nervenscheidenzellen sind, die weder Schwann-Zellen noch Fibroblasten³¹ sind.

Abbildung 6 ist enthalten, um den Vergleich von humanen plexiformen Neurofibromen und MPNSTs mit den Tumoren zu ermöglichen, die in P 0-GGFβ3-Mäusen beobachtet wurden, und um repräsentative Beispiele für einige der menschlichen Tumorarten zu liefern, die mit MPNSTs verwechselt werden können. Abbildung 6A zeigt ein plexiformes Neurofibrom, das im Plexus brachialis eines NF1-Patienten auftrat. während Abbildung 6B das MPNST des WHO-Grades IV zeigt, das in demselben plexiformen Neurofibrom auftrat. Abbildung 6B zeigt einige der charakteristischen Merkmale eines WHO-MPNST Grad IV, einschließlich ausgeprägter Hyperzellularität und zellulärer Atypie, lebhafter mitotischer Aktivität und Tumornekrose. Zum Vergleich zeigt Abbildung 6C einen MPNST des WHO-Grades II, der signifikante zelluläre Atypien aufweist, aber weniger hyperzellulär ist als der MPNST Grad IV und, obwohl Mitosen vorhanden sind, eine geringere mitotische Aktivität aufweist. Abbildung 6D zeigt ein Fibrosarkom mit seinem charakteristischen "Fischgräten"-Muster aus ineinander verwobenen Hüllen von Tumorzellen. Dieses Muster unterscheidet jedoch nicht unbedingt zwischen Fibrosarkomen und MPNSTs, da einige MPNSTs ein ähnliches Muster aufweisen. Darüber hinaus zeigt die in Abbildung 6E dargestellte Ansicht mit höherer Leistung eine zelluläre Morphologie, die derjenigen ähnelt, die in der in Abbildung 6B dargestellten MPNST der WHO Grad IV zu sehen ist. Abbildung 6F zeigt ein Leiomyosarkom. Im Gegensatz zu den meisten MPNSTs sind Leiomyosarkome immunreaktiv für Muskelmarker wie Aktin der glatten Muskulatur und Desmin. Die Aktin-Immunreaktivität der glatten Muskulatur kann jedoch von Tumor zu Tumor unterschiedlich sein, wobei einige Tumoren eine intensive gleichmäßige Immunreaktivität aufweisen (Abbildung 6G) und andere eine Immunreaktivität aufweisen, die eine zelluläre Variabilität innerhalb des Tumors zeigt (Abbildung 6H). Die Desmin-Immunreaktivität kann auch bei Leiomyosarkomen lückenhaft sein (Abbildung 6I). Melanome sind in der Morphologie sehr variabel, wobei einige Tumoren aus polygonalen Zellen bestehen (Abbildung 6J) und andere aus spindelförmigen Zellen, die die Morphologie von MPNST-Zellen nachahmen können. Melanome können von MPNSTs durch Immunreaktivität für Melanosomenmarker wie MART1 unterschieden werden (Abbildung 6K). Melanome sind jedoch wie MPNSTs häufig positiv für S100β und Sox10 (Abbildung 6L).

Abbildung 7 zeigt die pathologischen Merkmale von WHO-MPNSTs der Grade II, III und IV, die aus P0-GGFβ3-Mäusen isoliert wurden. Abbildung 8 zeigt repräsentative Bilder von P 0-GGFβ3-MPNST-Zellen mit niedriger (Abbildung 7A) und hoher (Abbildung 7B) Leistung. Die Tumorigenität dieser Zellen wird sowohl durch ihre Fähigkeit demonstriert, Kolonien zu bilden, wenn sie in weichem Agar suspendiert sind (Abbildung 7C), als auch durch die Bildung von Transplantaten, wenn sie subkutan in immundefizienten Mäusen allotransplantiert werden (Abbildung 7D).

Abbildung 1: Arbeitsablauf zur Verarbeitung von Tumoren und anderen Geweben von P 0-GGFβ3-Mäusen. (A) Grob sichtbare Tumoren werden entnommen und in drei Portionen segmentiert, um 1) die Fixierung in 4% Paraformaldehyd, gefolgt von Immunhistochemie und Histochemie, 2) die Etablierung einer Tumorzellkultur in der frühen Passage und/oder genomische Analysen und 3) das Schockgefrieren mit flüssigem Stickstoff für die Protein-, DNA- oder RNA-Isolierung. (B) Nach der Entfernung des Tumors wird der Körper der Maus in 4% Paraformaldehyd fixiert und die inneren Organe entfernt. Diese Organe werden für die histologische Untersuchung entnommen, um mikroskopische Hinweise auf Neubildungen und andere pathologische Prozesse zu identifizieren. (C) Nach der Entfernung der inneren Organe werden die Extremitäten (Kopf, Gliedmaßen, Schwanz) und die Haut aus dem Schlachtkörper entfernt. Die Wirbelsäule, die angrenzenden Rippen und der angrenzende Skelettmuskel werden mit 0,3 M EDTA/4% Paraformaldehyd (pH 8,0) entkalkt. Die entkalkten Gewebe werden dann paraffineingebettet und Abschnitte des Gewebes für die immunhistochemische und histochemische Untersuchung vorbereitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder von grob offensichtlichen Neurofibromen und MPNSTs in P 0-GGFβ3-Mäusen. (A) P 0-GGFβ3-Maus mit einem großen grob sichtbaren Tumor auf der rechten Flanke (Pfeil). (B) Ein MRT-Scan dieser Maus zeigt, dass der Tumor mit dem Ischiasnerv (Pfeilspitze) verbunden ist und dass er durch die darüber liegende Faszie gewachsen ist, um sich innerhalb der subkutanen (Pfeil, Massentumormasse) auszudehnen. (C) Die mikroskopische Untersuchung dieses Tumors zeigt, dass es sich trotz seiner Größe um ein Neurofibrom handelt. (D) Großfleischiger MPNST, der im Plexus brachialis einer P 0-GGFβ3-Maus entstand. Maßstabsleiste = 100 μm. (C). Abkürzungen: MPNSTs = maligne periphere Nervenscheidentumoren; MRT = Magnetresonanztomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder von MPNSTs, entkalkter Wirbelsäule und Neurofibromen, die gemäß Protokollabschnitt 1 erstellt wurden. (A-J) Exzidierte und H&E-gefärbte P 0-GGFβ3 MPNSTs zeigen histologische Variabilität. Alle Bilder sind unabhängig voneinander entstehende MPNSTs. Trotz dieser histologischen Variabilität zeigten alle diese Tumoren eine angemessene Markierung für die in Tabelle 1 angegebenen MPNST-Marker. Maßstabsbalken = 200 μm. (K) Repräsentatives Bild eines H&E-gefärbten Querschnitts der entkalkten Wirbelsäule. In diesem Bild sind die folgenden Strukturen leicht zu visualisieren: das Rückenmark; Wirbelknochen; die Spinalganglien an der dorsalen Spinalnervenwurzel; und paravertebraler Skelettmuskel. Vergrößerung 4x. (L) Ein in K gezeigtes Bild des Rückenmarks und des Wirbels mit höherer Leistung zeigt das richtige Aussehen des Knochens nach der Entkalkung mit dieser Methodik. Vergrößerung 10x. (M) Repräsentatives Bild eines Neurofibroms der dorsalen Nervenwurzel in einer P_{0-GGFβ3-Maus}. Vergrößerung 40x. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: MPNSTs = maligne periphere Nervenscheidentumoren; H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Diagnostische Färbung zur Erstidentifizierung von plexiformen Neurofibromen und deren Abgrenzung von MPNSTs. (A) Immunfärbungen für S100β in einem P 0-GGFβ3 plexiformen Neurofibrom. Beachten Sie, dass eine intensive Braunfärbung für dieses Antigen nur in einer Untergruppe von Zellen in diesem Tumor vorhanden ist, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass Neurofibrome aus neoplastischen Schwann-Zellen und mehreren anderen nicht-neoplastischen Zelltypen bestehen. (B) Immunfluoreszenzbild eines P 0-GGFβ3 MPNST, gefärbt für das intermediäre Filamentnestin (rot) und gegengefärbt mit Bisbenzimid (blau, Kernfärbung). (C) MPNST gefärbt für den Transkriptionsfaktor Sox10. Intensive Immunreaktivität (braun) ist in den Kernen einer Untergruppe von Tumorzellen offensichtlich. (D) Hochleistungsansicht eines P 0-GGFβ3 plexiformen Neurofibroms nach einer Unna-Färbung. Diese Färbung erzeugt eine metachromatische (violette) Färbung des Granulats in Mastzellen. Plexiforme Neurofibrome können von MPNSTs unterschieden werden, da letztere keine Mastzellen haben. (E,F) Ki67-Immunhistochemie in (E) einem P 0-GGFβ3 plexiformen Neurofibrom und (F) einem P_0-GGFβ3 MPNST. Beide Abschnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt (blaue Kernfärbung), wobei die Ki67-Immunreaktivität in diesen Immunperoxidase-Färbungen als braune Kernfärbung erkennbar ist. Beachten Sie, dass im plexiformen Neurofibrom keine braune Kernfärbung erkennbar ist, während die meisten Tumorzellkerne im MPNST positiv sind. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzung: MPNST = maligner peripherer Nervenscheidentumor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Repräsentative Bilder von Immunfärbungen, die zur Identifizierung der Subpopulationen von Zellen verwendet werden, aus denen Neurofibrome bestehen. Diese immunfluoreszierenden Bilder eines humanen dermalen Neurofibroms wurden gefärbt für (A) CD117 (c-Kit; ein Marker für Mastzellen), (B) CD163 (M2-Makrophagen), (C) CD86 (M1-Makrophagen), (D) Iba1 (Pan-Makrophagen-Marker), (E) Sox10 (Schwann-Zell-Marker), (F) TCF4 (Fibroblasten-Marker), (G) CD31 (Gefäßmarker) und (H) CD34 (markiert eine ausgeprägte, wenig verstandene Subpopulation von Zellen bei Neurofibromen). Vergrößerung 60x, Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Repräsentative Bilder von plexiformen Neurofibromen, MPNSTs und einigen anderen menschlichen Tumorarten, die bei der Differentialdiagnose eines MPNST berücksichtigt werden. (A) Plexiformes Neurofibrom, das im Plexus brachialis eines NF1-Patienten auftritt und die insgesamt geringere Zellularität und das gutartige Erscheinungsbild dieses Neoplasmas zeigt. Obwohl dies in H&E-gefärbten Schnitten nicht leicht sichtbar ist, ist eine komplexe Mischung von Zelltypen vorhanden. Mitosen sind nicht zu sehen. Vergrößerung: 40x. (B) Ein MPNST des WHO-Grades IV, der aus dem in A dargestellten plexiformen Neurofibrom entstand. Beachten Sie den viel höheren Grad an Zellularität. Der Pfeil zeigt eine mitotische Figur an, und das Sternchen kennzeichnet eine Region der Tumornekrose im oberen rechten Teil dieses mikroskopischen Feldes. Vergrößerung: 40x. (C) Ein MPNST der WHO-Klasse II. Dieser Tumor hat einen geringeren Grad an Zellularität als der in B dargestellte MPNST des WHO-Grades IV. Es gibt jedoch mehr Kernatypien und Hyperchromasie als bei dem in A dargestellten plexiformen Neurofibrom. Der Pfeil zeigt eine der gelegentlichen mitotischen Figuren, die in diesem Neoplasma angetroffen wurden. Vergrößerung: 63x. (D) Eine Low-Power-Ansicht eines Fibrosarkoms vom Erwachsenentyp, die das "Fischgräten"-Muster (die verwobenen Hüllen von Tumorzellen) veranschaulicht, das typischerweise bei diesem Tumortyp zu sehen ist. Leider ist die Fischgrätenarchitektur auch in einigen menschlichen MPNSTs anzutreffen und kann daher nicht zur Unterscheidung zwischen Fibrosarkomen und MPNSTs verwendet werden. Vergrößerung: 20x. (E) Eine Ansicht des Fibrosarkoms mit höherer Vergrößerung in D. Beachten Sie die Ähnlichkeit zwischen der zellulären Morphologie in diesem Fibrosarkom und der zellulären Morphologie, die im in B gezeigten MPNST des WHO-Grades IV offensichtlich ist. Vergrößerung: 40x. (F) Hochleistungsbild eines Leiomyosarkoms, das eine zelluläre Morphologie zeigt, die in den Variationsbereich von MPNSTs fällt. Vergrößerung: 40x. (G) Immunfärbungen für Aktin der glatten Muskulatur im Leiomyosarkom dargestellt in F. Beachten Sie, dass die Tumorzellen eine gleichmäßige intensive Immunreaktivität für dieses Antigen zeigen. Vergrößerung: 40x. (H) Immunfärbungen für Aktin der glatten Muskulatur bei einem anderen Leiomyosarkom. Bei diesem Tumor gibt es eine größere Variabilität im Grad der Immunreaktivität, wobei einige Zellen intensiver gefärbt sind als andere. Es ist nicht ungewöhnlich, dass die Immunreaktivität für dasselbe Antigen in einem Tumor einheitlich vorhanden ist und nur in einer Untergruppe von Tumorzellen in einem anderen Neoplasma vorhanden ist. Vergrößerung: 40x. (I) Immunfärbung für Desmin bei einem dritten Leiomyosarkom. In diesem Tumor ist nur eine Untergruppe von Tumorzellen intensiv immunreaktiv für dieses Antigen. (J) Metastasierendes Melanom. Melanome sind berüchtigt für ihre sehr variable Morphologie, die von quaderförmig bis spindelförmig reichen kann; Tumoren mit der letzteren Morphologie werden am ehesten mit MPNSTs verwechselt, insbesondere angesichts der Tatsache, dass sowohl Melanome als auch MPNSTs eine S100β- und Sox10-Immunreaktivität aufweisen können. Vergrößerung: 40x. (K) Immunreaktivität für den Melanommarker MART1 im in J. Vergrößerung: 40x. (L) Nukleäre Immunreaktivität für den Transkriptionsfaktor Sox10 im Melanom in J. Vergrößerung: 40x, Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzung: MPNST = maligner peripherer Nervenscheidentumor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Repräsentative Bilder von WHO-MPNSTs der Klassen II-IV P 0-GGFβ3. (A) Mikroaufnahmen mit niedriger und (B) hoher Leistung eines MPNST der WHO-Klasse II. Beachten Sie, dass die Zellularität niedriger ist als das in Panel C dargestellte MPNST des WHO-Grades III und dass die Kerne der Tumorzellen in D hyperchromatischer (dunkler) sind als die in Panel B gezeigten. (C) Mikroaufnahmen mit niedriger und (D) hoher Leistung eines MPNST der WHO-Klasse III. Dieser Tumor zeigte >4 mitotische Figuren pro 10 Hochleistungsfelder, mit Zellen, die dichter gepackt und hyperchromatischere, atypische Kerne waren. (E) Low- und (F) High-Power-Ansichten eines WHO-MPNST der Klasse IV. Beachten Sie den Fokus der Nekrose im unteren mittleren Teil von Tafel F. Geringer Stromverbrauch = 20x. Hoher Stromverbrauch = 40x, Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Repräsentative Bilder von P 0-GGFβ3-MPNST-Zellen in der frühen Passage und ihrer Tumorigenität, wie sie durch Wachstum in Weichagar und ihre Fähigkeit, als Allotransplantate zu wachsen, demonstriert werden. (A) Phasenkontrastbilder mit niedriger und (B) hoher Leistung von P_{0-GGFβ3-MPNST-Zellen} aus der frühen Passage. (C) P 0-GGFβ3 MPNST-Zellen, die in Weichagar gezüchtet und mit Sudanschwarz gefärbt wurden; die Kolonien sind als schwarze Puncta im Agar erkennbar. (D) Hämatoxylin- und Eosin-gefärbtes Bild eines Tumors, der sich bildete, nachdem P 0-GGFβ3 MPNST-Zellen subkutan in eine immundefiziente Maus transplantiert wurden, wie im Protokoll beschrieben. (E) Proliferation von P 0-GGFβ3-MPNST-Zellen in der frühen Passage über einen Zeitraum von 5 Tagen, bestimmt durch ein Celigo-Bildzytometer. Geringer Stromverbrauch = 10x, hoher Stromverbrauch = 40x; Maßstabsbalken = 100 μm für alle Panels Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Name	Verwendung	Reaktivität/Klasse der Spezies
CD117	Vorverdünnt	Kaninchen monoklonal
CD163	1:200	Maus-Monoklonl
CD31	1:50	Kaninchen polyklonal
CD34	1:2000	Kaninchen monoklonal
CD86	1:1000	Kaninchen monoklonal
Zytokeratin	1 μg/ml	Maus monoklonal
Desmin	1:50	Maus monoklonal
Iba1	1:500	polyklonales Kaninchen
Ki-67	1:50	Kaninchen monoklonal
MART1	1 μg/ml	Maus monoklonal
Nestin	1:1,000	Maus monoklonal
PMEL	1:100	Rabbot monoklonal
S100B	1:200	Kaninchen polyklonal
SMA	1:100	Maus monoklonal
Sox10	1:10	Maus monoklonal
TCF4/TCFL2	1:100	Kaninchen monoklonal

Tabelle 1: Antikörper zur Diagnose von plexiformen Neurofibromen und bösartigen peripheren Nervenscheidentumoren. Antikörper, die zur routinemäßigen Identifizierung von plexiformen GEM-Neurofibromen (S100β, Sox10, CD117, Ki67), zur Diagnose von MPNSTs und zur vollständigen Beurteilung anderer Zelltypen in Neurofibromen verwendet werden. Abkürzung: MPNST = maligner peripherer Nervenscheidentumor.

		S100β	Nestin	Sox10	MART1	PMEL	Desmin	Aktin der glatten Muskulatur	Zytokeratin	SS18-SSX Fusion
Hersteller-Art.-Nr.		50-90%, in der Regel fokal	Positiv1	~30%	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ
Fibrosarkom		Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ
Leiomyosarkom		Selten	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	50-100%	Positiv	~40%	Negativ
Epitheloid-Sarkom		Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Positiv	Negativ
Melanom		Positiv	Positiv	85%	Positiv	Positiv	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ
Monophasisches Synovialsarkom		~30%	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Negativ	Positiv	Positiv

Tabelle 2: Marker zur Feststellung der Tumoridentität beim Menschen. Diese immunhistochemischen und histochemischen Marker werden zusammen mit einer Bewertung der tumormikroskopischen Morphologie verwendet, um MPNSTs von anderen Neoplasien zu unterscheiden, die sie nachahmen. Die Differentialdiagnose, die typischerweise für humane MPNSTs in Betracht gezogen wird, umfasst das Fibrosarkom vom Erwachsenentyp, das Epitheloidsarkom, das Leiomyosarkom, das monophasische Synovialsarkom und das Melanom. Fibrosarkome vom adulten Typ haben mikroskopisch ein Fischgrätenmuster und färben sich für Vimentin, aber nicht für S100β. Leiomyosarkome, aber keine MPNSTs, sind immunreaktiv für Desmin; Leiomyosarkome haben auch Kerne mit einer bemerkenswert stumpfen Morphologie. Epitheloidsarkome, aber keine MPNSTs, sind immunreaktiv für Cytokeratin. Melanome können wie MPNSTs S100β-positiv sein, sind aber auch immunreaktiv für MART-1 und PMEL. Abkürzung: MPNST = maligner peripherer Nervenscheidentumor. ¹Kombination von S100β und Nestin hochprädiktiv für MPNST.

Discussion

Die hier vorgestellten histologischen und biochemischen Methoden bieten einen Rahmen für die Diagnose und Charakterisierung von GEM-Modellen des Neurofibroms und der MPNST-Pathogenese. Im Laufe der Jahre haben wir festgestellt, dass diese Methoden sehr nützlich sind, um die Pathologie von peripheren Nervenscheidentumoren zu beurteilen, die in GEM-Modellen auftreten 21,25,26. Während die hier skizzierten Protokolle nützlich sind, um zu bestimmen, wie genau Tumore in den GEM-Modellen die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke rekapitulieren, gibt es einige Einschränkungen bei diesen Strategien, die anerkannt werden sollten. Zunächst zeigen P 0-GGFβ3-Mäuse eine fast vollständige Penetranz ihres Tumorphänotyps, was es relativ einfach macht, eine große Anzahl von Mäusen mit Neurofibromen und MPNSTs 21,25,26 zu erhalten, die für genomische Studien und genomweite shRNA-Screenings verwendet werden können. Die hohe Penetranz des Phänotyps in diesem Modell macht P 0-GGFβ3-Mäuse auch für präklinische Studien sehr nützlich. Es sollte jedoch anerkannt werden, dass dies nicht bei allen GEM-Krebsmodellen der Fall sein wird. Aus diesem Grund haben wir betont, wie wichtig es ist, den Anteil der Tiere zu bestimmen, bei denen die Entwicklung von Tumoren vorhergesagt werden kann. Bei der Arbeit mit einem Tiermodell, das seltener Tumore entwickelt, haben wir festgestellt, dass es vorteilhaft ist, bildgebende Verfahren wie Magnetresonanztomographie oder Positronenemissionstomographie zu verwenden, um Tiere mit Tumoren definitiv zu identifizieren, die in präklinische Studien oder andere Studien aufgenommen werden können. Dieser Ansatz kann jedoch unerschwinglich sein, wenn wiederholte Scans erforderlich sind. Aus diesem Grund haben wir auch betont, wie wichtig es ist, die durchschnittliche Überlebenszeit des GEM-Modells von Interesse²⁶ zu ermitteln - das Verständnis, wann ein Tier voraussichtlich einen Tumor entwickelt, reduziert die Anzahl der Scans, die erforderlich sind, um Tiere mit dem gewünschten Phänotyp und die damit verbundenen Kosten zu identifizieren.

Es ist auch wichtig zu erkennen, dass ein großer Tumor bei einer Maus eigentlich immer noch eine eher kleine Menge Gewebe ist. In diesem Protokoll empfehlen wir einen Prozess, bei dem das Tumorgewebe in Drittel geteilt wird, wobei Teile der Histologie/Immunhistochemie, der Etablierung von Zellkulturen für die frühe Passage und der Isolierung von Biomolekülen (Proteine, RNA, DNA) von Interesse gewidmet sind. Die Tumorgröße variiert jedoch, und wenn der Tumor recht klein ist, kann dies dazu führen, dass nicht genügend Gewebe vorhanden ist, um sich auf diese Weise zu teilen. In diesem Fall muss der Prüfarzt feststellen, ob die Tumordiagnose oder eine andere Verwendung von Tumorgewebe Vorrang hat³². Unter diesen Umständen ist unsere Voreingenommenheit, dass wir eine richtige Diagnose haben müssen, um zu verstehen, womit wir arbeiten, bevor wir uns auf andere Experimente einlassen. Wir haben festgestellt, dass Tumordiagnosen in der Regel mit weniger als einem Drittel des Neoplasmas leicht gestellt werden können. Bei kleinen Tumoren entfernen wir stattdessen in der Regel ein kleines Fragment des Tumorgewebes, wickeln es in Histologiegewebe ein und legen es in eine Gewebekassette, um sicherzustellen, dass das Gewebe während der Verarbeitung nicht verloren geht. Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er dazu führen kann, dass der Prüfer das Neoplasma unterbewertet, wenn eine WHO-Einstufung gewünscht wird. Dies liegt daran, dass bei Krebserkrankungen häufig niedrig- und höhergradige Regionen nebeneinander existieren und wenn eine sehr kleine Probe entnommen wird, hängt der erhaltene Grad davon ab, woher die Tumorprobe entnommen wurde.

Die Protokolle, die wir zur Feststellung der Identität von peripheren Nervenscheidentumoren beschreiben, stützen sich stark auf die Immunhistochemie. Während es gelegentlich alternative Ansätze gibt, die für einige Zelltypen verwendet werden können (z. B. die Durchführung von Unna-Färbungen zur Identifizierung von Mastzellen), gilt dies nicht einheitlich für die meisten Zelltypen, die in Neurofibromen und MPNSTs vorhanden sind. Daher muss mit großer Sorgfalt festgestellt werden, dass die immunhistochemischen Verfahren, die verwendet werden, richtig optimiert wurden. Unserer Erfahrung nach können mehrere Probleme die diagnostische Immunhistochemie beeinträchtigen. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass der Prüfer eine Verdünnungsserie mit einem Primärantikörper durchführt, den er noch nie zuvor verwendet hat. Darüber hinaus sollte eine Verdünnungsreihe durchgeführt werden, wenn eine neue Charge eines zuvor optimierten Antikörpers^{verwendet wird 33}. Es muss auch darauf geachtet werden, dass frische Chargen von Reagenzien zur Verfügung stehen. Unserer Erfahrung nach sind Wasserstoffperoxid und DAB im Alter besonders anfällig dafür, nicht richtig zu funktionieren, was dazu führen kann, dass der Prüfer unangemessen entscheidet, dass ihre Flecken negativ sind.

Die immunhistochemischen Profile, die wir für plexiforme Neurofibrome, MPNSTs und die verschiedenen Arten von Neoplasien beschreiben, die bei der Differentialdiagnose von MPNSTs berücksichtigt werden, sind diejenigen, denen wir am häufigsten begegnet sind 21,25,26,34. Da jedoch eine divergente Differenzierung bei MPNSTs und diesen anderen Malignomen nicht ungewöhnlich ist, kann der Untersucher auf Färbeprofile stoßen, die sich etwas von dem unterscheiden, was wir hier beschreiben. Aus diesem Grund empfehlen wir dringend, dass das Team, das ein neues GEM-Modell der Tumorgenese charakterisiert, einen erfahrenen Human- oder Veterinärpathologen umfasst. In diesem Protokoll haben wir die WHO-Einstufung auf GEM und menschliche MPNSTs angewendet. Wir bevorzugen dieses Bewertungssystem, da die Bewertungskriterien relativ gut definiert sind und leicht zwischen menschlichen und Maus-MPNSTs^{verglichen werden können 2,28}. Wir möchten jedoch darauf hinweisen, dass die WHO-Einstufungskriterien von Pathologen nicht einheitlich akzeptiert werden. Dies liegt daran, dass nicht klar ist, ob die drei WHO-Grade, die auf MPNSTs angewendet werden, die klinischen Ergebnisse bei Patienten vorhersagen. Aus diesem Grund ziehen es viele Pathologen vor, MPNSTs einfach als niedriggradige oder hochgradige Malignome zu klassifizieren. Mit diesem Ansatz gelten etwa 85 % der MPNSTs als hochgradige Malignome, die durch eine lebhafte mitotische Aktivität, ausgeprägte zelluläre Atypien und Hyperchromasie gekennzeichnet sind, die von Tumornekrose begleitet sein können. Niedriggradige MPNSTs zeigen weniger Zellularität, Hyperchromasie und mitotische Aktivität.

Wir haben festgestellt, dass die Allotransplantation von MPNST-Zellen in der frühen Passage ein einfaches Mittel ist, um die Tumorigenität dieser Kulturen zu überprüfen. Einige Probleme sollten jedoch berücksichtigt werden, wenn die Zellen kein Allotransplantat³² bilden. Unserer Erfahrung nach ist die überwiegende Mehrheit der MPNST-Zellen in der frühen Passage zwar auf ein Allotransplantat gestoßen, aber wir sind gelegentlich auf frühe Passagekulturen gestoßen, die dies nicht tun. Trotz dieses Versagens zeigten die vergleichende genomische Hybridisierung (aCGH) und die Sequenzierung des gesamten Exoms, dass diese Kulturen der frühen Passage mehrere genomische Anomalien aufwiesen, die darauf hindeuteten, dass es sich um Tumorzellen handelte^25,26. Wir haben auch frühe Passagekulturen gefunden, die nicht gesund sind, in der Regel, weil die Kulturen zusammenfließen durften, bevor sie für die Veredelung geerntet wurden. Zellen, die durch grobe Handhabung beschädigt wurden (z. B. zu lange mit nicht-enzymatischer Zelldissoziationslösung inkubiert, die übermäßig oft auf und ab pipettiert wurde), schneiden beim Transplantieren ebenfalls schlecht ab. Wir möchten auch darauf hinweisen, dass die von uns angegebenen Zeiten für die Etablierung von Transplantaten eine Schätzung sind, die auf unserer Erfahrung basiert. Gelegentlich sind wir auf frühe Passagekulturen gestoßen, die erfolgreich Allotransplantate etablieren, aber länger brauchen, um dies zu tun.

Die oben skizzierten Ansätze bieten eine umfassende Möglichkeit, Schlüsselaspekte eines neu entwickelten GEM-Modells für Neoplasien des peripheren Nervensystems zu charakterisieren und Neurofibrome und MPNSTs, die diese Tiere entwickeln, richtig zu diagnostizieren. Die Methoden, die wir für die Etablierung von MPNST-Kulturen für die frühe Passage und die Verwendung dieser Kulturen für die Allotransplantation skizzieren, liefern auch klare Hinweise auf die Tumorigenität von Neoplasien, die in GEM-Modellen identifiziert wurden. Wir möchten betonen, dass wir bei der Etablierung früher Passagekulturen nicht die Selektion einzelner Klone durchführen. Obwohl wir anerkennen, dass eine gewisse Selektion unvermeidlich ist, wenn Tumorzellen in Kulturen platziert werden, deuten diese ersten Ergebnisse darauf hin, dass die in frühen GEM-MPNST-Kulturen identifizierten Mutationen denen des Muttertumors sehr ähnlich bleiben. Mit aCGH haben wir jedoch auch festgestellt, dass das fortgesetzte Tragen dieser frühen Passagenkulturen für längere Passagen zu genomischen Veränderungen führt, die von dem abweichen, was in den früheren Passagen dieser Tumorzellen zu sehen ist.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Gewebekulturplatten	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidin (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6-Well-Platten	Corning Costar	3516
Essigsäure	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Sekundär (Ziege Anti-Maus)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Sekundär (Ziege Anti-Maus)	Invitrogen	A21043 oder A11004
Alexa Fluor 568 Sekundär (Ziege Anti-Kaninchen)	Invitrogen	A11036
Ammoniumchlorid (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Rinderserumalbumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Zellschaber	Sarstedt	83.183
Zellabstreifer	Corning	25-056-CI
Kreisdeckglas	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (Lösungsmittel auf d-Limonen-Basis)	Decon Laboratories	5989-27-5
Kritiksäure	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	Klon D33 (M0760)
Diaminobensizdin (DAB) Lösung	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fötales Kälberserum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerin	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hämatoxylin	Fisherbrand	245-677
Hämazytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Salzsäure	Fisher Scientific	A144-212
Wasserstoffperoxid	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Maus auf Maus	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Pferd Anti-Kaninchen	Vektor Laboratorien	MP-7401
Inkubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2-Inkubator
Isofluran	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Zellsignalisierung	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Flüssiger Stickstoff
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Mikrotom
Nestin	Millipore	Mensch: MAD5236 (10C2), Mensch: MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	Im eigenen Haus	Made by S.L.C. (auch erhältlich als 396-HB-050/CF bei R& D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnologie	sc-67
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mäuse	Jackson Laboratory	5557
Fettfreie Trockenmilch	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ 3 Mäuse	Hauseigenes
Paraffinwachs	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyd (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylol-Eindeckmedium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH-Messgerät	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysin-Hydrobromid	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Tragbares Isofluranzgerät	VetEquip Inhalationsanästhesiesysteme
PVA-DABCO (wässriges Eindeckmedium)	Millipore Sigma	10981100ML
Reiskocher	Buche Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (jetzt GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	Klon 1A4
Natriumchlorid	Fisher	Scientific S640
Natriumcitrat (Dihydrat)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Histologieform
Superfrost Plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Signalübertragung der Zellen	(CH48H11) #2569
Gewebekassette
Toluidin Blau	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31