Das vorliegende Protokoll beschreibt das Verfahren zur Analyse der Darmflora unter Verwendung der Illumina-basierten 16S rRNA-Gensequenzierung und bietet einen Rahmen für die Bewertung der Wirksamkeit von Kräuterabkochungen.
Methodenartikel
Auswirkungen von Desmodium caudatum auf gastrointestinale Hormone und Darmflora bei Ratten mit Gastritis
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Um die Auswirkungen von Desmodium caudatum auf Gastritis und Darmflora bei Ratten vorläufig zu untersuchen, wurde ein chronisches Gastritis-Rattenmodell mit der klassischen Natriumsalicylat-Methode etabliert. Achtzehn SPF-Ratten wurden in drei Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe (Gruppe C), die Modellgruppe (Gruppe M) und die Behandlungsgruppe (Gruppe T). Pathologische Abschnitte der Magenwand wurden Ratten in jeder Gruppe entnommen. Darüber hinaus wurden die Konzentrationen von Gastrin und Malondialdehyd im Serum von Ratten in jeder Gruppe mittels ELISA bestimmt. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von D. caudatum auf die Darmflora von Ratten mit Gastritis durch einen detaillierten Vergleich der Darmbakteriengemeinschaften in den drei Gruppen unter Verwendung der Illumina-basierten 16S rRNA-Gensequenzierung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Abkochung von D. caudatum den Malondialdehydgehalt reduzieren und den Gastringehalt erhöhen konnte. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Abkochung von D. caudatum die Vielfalt und Fülle der Darmflora verbessert und einen positiven Einfluss auf die Behandlung von Gastritis ausübt, indem sie die Darmflora reguliert und wiederherstellt.
Einleitung
Die chronische Gastritis (CG), eine der häufigsten klinischen Erkrankungen, ist gekennzeichnet durch chronische und anhaltende entzündliche Veränderungen des Magenschleimhautepithels, das häufig und wiederholt von verschiedenen pathogenen Faktoren angegriffen wird1. Die Inzidenzrate von CG steht an erster Stelle unter allen Arten von Magenerkrankungen und macht 40 % bis 60 % der ambulanten Versorgungsrate in der Klinik für Gastroenterologieaus 2. Darüber hinaus steigt die Inzidenzrate im Allgemeinen mit dem Alter, insbesondere bei Personen mittleren Alters und älter3. Zweifellos verringert CG die Lebensqualität der Menschen erheblich und unterstreicht die dringende Notwendigkeit, neue Therapeutika zu entdecken.
Zahlreiche Studien haben berichtet, dass das Auftreten und die Entwicklung von CG mit der Sekretion von gastrointestinalen Hormonen wie Gastrin (GAS) zusammenhängen4,5. GAS, ein häufiges gastrointestinales Peptidhormon im Verdauungstrakt, stimuliert die Zellen zur Sekretion von Magensäure, indem es die Freisetzung von Histamin aus Eosinophilen fördert. Darüber hinaus verbessert es die Ernährung und Blutversorgung der Magenschleimhaut und fördert die Proliferation der Magenschleimhaut und der Scheitelzellen6. Daher kann Gastrin als Indikator zur Bewertung des Entwicklungsniveaus von CG verwendet werden. Darüber hinaus können Lipidperoxidationsprodukte, die durch reaktive Oxide ausgelöst werden, Entzündungszellen aktivieren, was zu CG führt. Malondialdehyd (MDA), ein Lipidperoxidationsmarker, ist ein häufig verwendeter Indikator zur Messung des Grades des oxidativen Stresses. Es spiegelt bis zu einem gewissen Grad den Gehalt an freien Radikalen in der Magenschleimhaut wider. Der MDA-Spiegel kann auf den Angriff von ungesättigten Fettsäuren in der lokalen Magenschleimhaut hinweisen, der durch freie Radikale verursacht wird 7,8.
Die Darmmikroökologie besteht aus Millionen von Mikroorganismen, die sich im Darm des Wirts befinden und eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des Wirts und der Regulierung der Immunität des Wirts spielen. Eine gesunde Darmflora, die sich durch hohen Reichtum, Vielfalt und stabile Mikrobiota-Funktion auszeichnet, wirkt als Schutzbarriere gegen das Eindringen pathogener Mikroorganismen, indem sie am Stoffwechsel beteiligt ist. Störungen der Darmflora machen Menschen anfälliger für akute und chronische Magen-Darm-Erkrankungen 9,10. In den letzten Jahren hat sich die Mikrobiota-Therapie bei Magen-Darm-Erkrankungen rasant weiterentwickelt und eine signifikante Wirksamkeit gezeigt11. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Berücksichtigung der Darmflora entscheidend ist, um Magen-Darm-Erkrankungen zu verstehen und anzugehen.
Als unverzichtbarer Bestandteil des Schatzes der traditionellen chinesischen Medizin haben volksmedizinische Materialien eine große Bedeutung für die klinische Praxis und die Modernisierung der nationalen Medizin. Die Wurzeln und die ganzen Teile von Desmodium caudatum (Thunb.) DC. wird seit längerer Zeit häufig zur Linderung von Magenbeschwerden in der Gegend von Beichuan Qiang in der Stadt Mianyang eingesetzt. Einige Artikel weisen auf die wissenschaftliche Grundlage für die Behandlung von Magen-Darm-Erkrankungen mit D. caudatum hin und zitieren seine Wirkungen wie Hämostase, Antioxidation und Magen-Darm-Schutz 12,13,14. Aufgrund des Mangels an eingehender Forschung wurde jedoch kein klinischer pharmakodynamischer Mechanismus etabliert. Dieser Artikel zielt darauf ab, die Auswirkungen von D. caudatum bei der Behandlung von Gastritis auf der Grundlage von gastrointestinalen Hormonen und Darmflora zu untersuchen und eine Grundlage für seine rationale klinische Anwendung zu schaffen.
Protokoll
Die Verfahren für die Pflege und Verwendung von Tieren wurden von der Ethikkommission der Mianyang Normal University genehmigt, und alle relevanten institutionellen und behördlichen Vorschriften bezüglich der ethischen Verwendung von Tieren wurden strikt befolgt. Für die vorliegende Studie wurden SPF-Ratten (Kunming-Arten, sowohl männlich als auch weiblich, mit einem Gewicht von 180-220 g) verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle). Alle Tiere wurden in einer pathogenfreien Umgebung untergebracht und hatten ad libitum Zugang zu Nahrung.
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie eine 5%ige Natriumsalicylatlösung vor, indem Sie 2,5 g Natriumsalicylatpulver (siehe Materialtabelle) mit einer elektronischen Waage abwiegen. Lösen Sie das Pulver in einer kleinen Menge destilliertem Wasser auf und verdünnen Sie es auf ein Gesamtvolumen von 50 ml.
- Bereiten Sie den Sud von D. caudatum (12,8 g/kg) vor. 128 g D. caudatum (siehe Materialtabelle) werden gewogen, in einen Rundkolben mit 1000 ml destilliertem Laborwasser gegeben und auf ein Endvolumen von 100 ml konzentriert.
2. Gruppierung und Verwaltung
- Teilen Sie die Ratten in verschiedene Gruppen ein und verabreichen Sie intragastrisch die erforderlichen Lösungen.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden 18 Ratten (9 Männchen, 9 Weibchen) in drei Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe (Gruppe C), die Modellgruppe (Gruppe M) und die Behandlungsgruppe (Gruppe T) mit 6 Ratten in jeder Gruppe. Die Kontrollgruppe erhielt Kochsalzlösung und die Modellgruppe erhielt 5 Wochen lang eine 5%ige Natriumsalicylatlösung in einer Dosis von 10 ml/kg/Tag15. Die Behandlungsgruppe wurde 5 Wochen lang mit einer 5%igen Natriumsalicylatlösung in einer Dosis von 10 ml/kg/Tag vorbehandelt, gefolgt von der Verabreichung des D. caudatum-Suds in einer Dosierung von 1 ml/100 g für 10 Tage15,16. - Am letzten Tag des Versuchs wird der Kot der Ratten in trockenen und sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit der Schwanztragemethode17 gesammelt und in einem Ultratiefkühlschrank mit flüssigem Stickstoff eingefroren.
- Nach dem Ende der Probenahme werden die Ratten durch Zervixluxation getötet (gemäß institutionell genehmigten Protokollen). Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Schere, um die Bauchschlagader freizulegen.
- Führen Sie die Nadel (23-25 G) fast parallel in die Bauchaorta ein, sammeln Sie das Serum und bewahren Sie es in einem Ultratiefkühlschrank auf. Nehmen Sie die Mägen aus der Bauchhöhle16 und weichen Sie sie zur Konservierung in einer 10%igen Formalinlösung ein.
HINWEIS: In Gruppe M wird das Modell der chronischen Gastritis als erfolgreich angesehen, wenn die Magenschleimhaut erweitert und verstopft ist und eine reguläre Drüsenmorphologieaufweist 15, während eine geringe Menge an entzündlicher Zellinfiltration in der Lamina propria beobachtet wird.
- Führen Sie die Nadel (23-25 G) fast parallel in die Bauchaorta ein, sammeln Sie das Serum und bewahren Sie es in einem Ultratiefkühlschrank auf. Nehmen Sie die Mägen aus der Bauchhöhle16 und weichen Sie sie zur Konservierung in einer 10%igen Formalinlösung ein.
3. Pathologischer Schnitt der Magenwand
- Entnehmen Sie die Magenwandproben von Ratten in jeder Gruppe für pathologische Schnitte. Führen Sie anschließend eine routinemäßige Hämatoxylin-Eosin-Färbung durch, um die pathologischen Veränderungen zu beobachten und zu analysieren18.
4. Bestimmung der Magen-Darm-Hormone im Serum
- Weisen Sie in der Serumprobe den Gehalt an Gastrin (GAS) und Malondialdehyd (MDA)19 mittels ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers nach (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie einen Mikroplatten-Reader für die Analyse.
5. Extraktion von fäkaler Gesamt-DNA und PCR-Amplifikation und -Aufreinigung
- Führen Sie eine mikrobielle DNA-Extraktion mit dem handelsüblichen DNA-Isolierkit durch (siehe Materialtabelle) und bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit mit dem UV-Vis-Spektralphotometer16. Beurteilen Sie anschließend die DNA-Integrität durch 1% Agarose-Gelelektrophorese18.
- Amplifizieren Sie das 16S-rRNA-Gen des Bakteriums mit den Primern 338F (5′-ACT, CCT, ACG, GGA, GGC, AGC, AGC, AG-3′) und 806R (5′-GAC, TAC, HVG, GGG, GTW, TCT, AT-3′) unter Verwendung eines Thermocycler-PCR-Systems17. Die Primer werden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Befolgen Sie das PCR-Programm: Denaturierung (3 min, 95 °C), gefolgt von 27 Zyklen (30 s, 95 °C; 30 s, 55 °C; 45 s, 72 °C) und einer abschließenden Verlängerung (10 min, 72 °C). Führen Sie PCR-Reaktionen mit den folgenden Komponenten durch: 4 μl 5× DNA-Polymerase-Puffer, 2 μl 2,5 mM dNTPs, 0,8 μl jedes Primers (5 μM), 0,4 μl DNA-Polymerase und 10 ng Template-DNA (siehe Materialtabelle). - Extraktion, Reinigung und Quantifizierung der PCR-Produkte sequentiell mit 2 % Agarosegel, handelsüblichem DNA-Gel-Extraktionskit bzw. Fluorometer17.
6. Sequenzierung
HINWEIS: Schritt 6 und Schritt 7 werden nach den zuvor veröffentlichten Methoden20,21 durchgeführt.
- Nutzen Sie die Illumina-Plattform für die Sequenzierung.
HINWEIS: Ein Ende des DNA-Fragments ergänzt die Basis des in den Chip eingebetteten Steckers und befestigt ihn auf dem Chip. Das andere Ende ergänzt zufällig die Basis einer anderen angrenzenden unterirdischen Fuge und bildet eine "Brücke". - Führen Sie eine PCR-Amplifikation durch, um DNA-Cluster zu erzeugen. Linearisieren Sie DNA-Verstärker in Einzelstränge.
- Einführung einer veränderten DNA-Polymerase neben Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTPs) mit vier verschiedenen Fluoreszenzmarkern. Synthetisieren Sie nur eine Base pro Zyklus.
- Verwenden Sie einen Laser, um die Oberfläche der Reaktionsplatte zu scannen und die Nukleotidtypen zu bestimmen, die während der Erstreaktion jeder Matrizensequenz polymerisiert werden.
- Spalte die "Fluoreszenzgruppe" und die "Terminationsgruppe" chemisch, um das klebrige 3'-Ende wiederherzustellen. Fahren Sie anschließend mit der Polymerisation des zweiten Nukleotids fort.
- Erhalten Sie die Sequenz der Template-DNA-Fragmente, indem Sie die in jeder Runde gesammelten Fluoreszenzsignalergebnisse analysieren.
7. Verarbeitung von Sequenzierungsdaten
- Kürzen Sie zunächst die Lesevorgänge von Fastq-Rohdaten an jedem Standort mit einem Wert < Q20 und eliminieren Sie Lesevorgänge mit unsicheren Grundlagen. Erlauben Sie außerdem zwei Fehlanpassungen in genau aufeinander abgestimmten Zündhütchen. Führen Sie anschließend die Sequenzen mit einer Überlappung >10 bp zusammen.
- Clustern Sie operative taxonomische Einheiten (OTUs) mit 97% Ähnlichkeit mit UPARSE und entfernen Sie chimäre Sequenzen mit UCHIME20,21.
- Verwenden Sie den RDP-Klassifikator-Algorithmus, um die Taxonomie jeder 16S-rRNA-Gensequenz anhand der Silva (SSU123) 16S-rRNA-Datenbank unter Verwendung einer Konfidenzschwelle von 70 % zu analysieren.
- Führen Sie eine Alpha-Diversitätsanalyse und eine Beta-Diversitätsanalyse mit Mothur bzw. Qiime durch (siehe Materialtabelle).
8. Statistische Auswertung
- Analysieren Sie die Daten in dieser Studie mit einer statistischen Analysesoftware (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen und verwenden Sie den LSD-Test (Least Significant-Difference) für Vergleiche zwischen zwei Gruppen.
- Betrachten Sie P < 0,05 in allen Vergleichen als statistisch signifikant. P < 0,01 wird als äußerst signifikant angesehen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse des pathologischen Abschnitts der Magenwand sind in Abbildung 1 dargestellt. Im Vergleich zu Gruppe C zeigte Gruppe M eine leichte Magenwandatrophie und eine leichte Entzündung. Im Vergleich zu Gruppe M zeigte Gruppe T jedoch keine offensichtliche Entzündung, Darmmetaplasie oder Atrophie. Dies deutet darauf hin, dass die Abkochung von D. caudatum die Gastritis wirksam verbessern kann.
Die Ergebnisse des gastrointestinalen Hormontests im Serum sind in Abbildung 2 dargestellt. Der Gehalt an Malondialdehyd (MDA) war in Gruppe M signifikant höher als in Gruppe C. Nach der Behandlung mit D. caudatum-Abkochung war es signifikant reduziert. In Bezug auf den Gehalt an Gastrin (GAS) zeigte Gruppe M signifikant niedrigere Werte als Gruppe C, aber Gruppe T zeigte einen signifikanten Anstieg. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Abkochung von D. caudatum den Spiegel der gastrointestinalen Hormone zur Behandlung von Gastritis regulieren kann.
Die Alpha-Diversitätsanalyse, wie in Tabelle 1 und Abbildung 3 gezeigt, zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Gemeinschaften der Gruppe M und der Gruppe T. Die Anzahl der Bakterien in Gruppe C und Gruppe T ist höher als die in Gruppe M, was darauf hindeutet, dass die Anzahl und Art der Darmbakterien bei Ratten nach der Behandlung allmählich auf ein normales Niveau tendiert.
Analyse der Spezieszusammensetzung
Gemäß Abbildung 4A zeigt das Gemeinschaftsdiagramm, dass Lactobacillus und norank_f__Muribaculaceae den größten Anteil in Gruppe C ausmachen. Gruppe M enthält eine höhere Häufigkeit von Clostridium_sensu_stricto_1 und etwas Helicobacter. Die Zusammensetzung der Gemeinschaft der Gruppe T ähnelt eher der der Gruppe C, wobei wichtige Komponenten Lactobacillus und Romboutsia sind. Darüber hinaus zeigt die Spearman-Korrelations-Heatmap (Abbildung 4B) in Kombination mit dem Circos-Diagramm (Abbildung 4C) signifikante Unterschiede in der Florazusammensetzung zwischen Gruppe C und Gruppe M, mit deutlichen Variationen in der dominanten Flora. Nach der Behandlung neigt die Gruppe T dazu, in einen normalen Florazustand zurückzukehren. Darüber hinaus zeigt Abbildung 5 extreme Unterschiede in der Zusammensetzung der Gemeinschaft zwischen Gruppe M und Gruppe C, wobei signifikante Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung der Darmflora bei Ratten mit Gastritis auftreten. Nach der Behandlung gibt es Ähnlichkeiten in der Zusammensetzung der Flora zwischen Gruppe C und Gruppe T sowie einige Ähnlichkeiten zwischen Gruppe T und Gruppe M. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Abkochung von D. caudatum die Darmflora von Ratten mit Gastritis in einen normalen oder nahezu normalen Zustand versetzen könnte.
Analyse von Artenunterschieden
Aus dem Säulendiagramm zum Vergleich mehrerer Arten in Abbildung 6A ist zu erkennen, dass Norank_f_Muribaculaceae in Gruppe C reichlich vorhanden ist und sich signifikant von Gruppe M und Gruppe T unterscheidet. Nach der Behandlung zeigt die Zahl der Norank_f_Muribaculaceae in der Gruppe T einen steigenden Trend. Darüber hinaus zeigt Clostridium_sensu_stricto_1, das in Gruppe M reichlich vorhanden ist, Resilienz in rauen Umgebungen. Nach der Behandlung nimmt die Anzahl signifikant ab, was darauf hindeutet, dass die Abkochung von D. caudatum die Überlebensumgebung der Darmflora bis zu einem gewissen Grad verbessert. Andererseits zeigt die LEfSe-Analyse der mehrstufigen Artenhierarchie in Abbildung 6B 44 Arten mit signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen. Norank_f_muribaculaceae, Clostridium_sensu_stricto_1 und Romboutsia waren in Gruppe C, Gruppe M bzw. Gruppe T reichlich vorhanden.
Abbildung 1: Die Ergebnisse des pathologischen Schnitts der Magenwand. (A) Pathologischer Abschnitt des Magens in Gruppe C. (B) Pathologischer Abschnitt des Magens in Gruppe M. (C) Pathologischer Abschnitt des Magens in Gruppe T. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der Gehalt an Magen-Darm-Hormonen im Serum. (A) Balkenanalysediagramm der MDA (Malondialdehyd)-Bestimmungsergebnisse. (B) Balkenanalysediagramm der GAS-Bestimmungsergebnisse. *P < 0,05, **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Säulengramm des Diversitätsindex T. Roter Balken steht für Gruppe C, blau für Gruppe T, während grüner für Gruppe M steht.*P < 0,05, **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Analyse der Zusammensetzung der Gemeinschaft. (A) Analyse des Histogramms der Gemeinschaft. (B) Community-Heatmap-Analyse auf Gattungsebene. (C) Circos-Diagrammanalyse der Beziehung zwischen Proben und Arten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: PLS-DA-Analyse auf Gattungsebene. Rot steht für Gruppe C, Blau für Gruppe T und Grün für Gruppe M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Analyse von Speziesunterschieden. (A) Kruskal-Wallis H-Testbalkendiagramm. (B) Baumkarte von LefSe-Mehrebenenarten. Rot steht für Gruppe C, Blau für Gruppe T und Grün für Gruppe M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gruppe | Mittelwert | Standardabweichung |
| C | 3.5201 | 0.63641 |
| M | 3.2755 | 0.28494 |
| T | 3.5388 | 0.29945 |
Tabelle 1: Ergebnisse des Alpha-Diversitätsindex.
Diskussion
D. caudatum, eine häufig verwendete Volksmedizin der Qiang-Nationalität12, hat eine signifikante Wirksamkeit bei der Behandlung von Magen-Darm-Erkrankungen gezeigt. Mit dem Fortschritt der modernen pharmakologischen Forschung wird das Ungleichgewicht der Flora, das sich aus dem Ungleichgewicht der gastrointestinalen Mikroökologie ergibt, als Schlüsselfaktor für akute und chronische Magen-Darm-Erkrankungen identifiziert22,23. Bestimmte Mikroorganismen im Darmtrakt spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des dynamischen Gleichgewichts im Körper, und Hormone im Serum spiegeln den physiologischen und pathologischen Zustand des Körpers wider. Daher konzentriert sich die Studie auf die Darmflora und Magen-Darm-Hormone.
Die 16S rRNA-Hochdurchsatz-Gensequenzierung ist eine primäre Methode zum Nachweis von Darmmikroorganismen. Es ermöglicht den Nachweis von Mikroorganismentypen und -funktionen in gesammelten Proben und ermöglicht eine genaue und quantitative Analyse jeder Art von Darmmikroorganismen. In den letzten Jahren hat sich die 16S rRNA-Hochdurchsatz-Gensequenzierung rasant entwickelt und wird häufig für die Analyse der mikrobiellen Vielfalt in verschiedenen ökologischen Umgebungen eingesetzt 24,25,26.
Die Auswirkungen von D. caudatum auf die Darmflora von Ratten mit Gastritis wurden durch einen detaillierten Vergleich der Darmbakteriengemeinschaften in drei Gruppen untersucht, der auf der Illumina-basierten 16S rRNA-Gensequenzierung basierte. Moderne wissenschaftliche Untersuchungen zeigen, dass Lactobacillus, norank_f__Muribaculaceae, Romboutsia und Bifidobacterium Probiotika sind, die jeweils spezifische gesundheitliche Vorteile haben, wie z. B. die Verringerung des Risikos mehrerer bösartiger Tumoren, die Produktion von Vitamin K mit entzündungshemmendem Potenzial, die Förderung des Polysaccharidstoffwechsels und die Verbesserung von Durchfall und Verstopfung 27,28,29. Clostridium_sensu_stricto_1, ein pathogenes Bakterium bei Darmverletzungen, kann Entzündungen und Bakteriämie verursachen und ist eng mit Blut- und Magen-Darm-Tumoren verbunden30. Chronische Gastritis und atrophische Gastritis tragen signifikant zu Magentumoren bei31.
Die Beta-Analyse zeigt signifikante Veränderungen des Gehalts an Lactobacillus, norank_f__Muribaculaceae, Romboutsia, Bifidobacterium und Clostridium_sensu_stricto_1 nach der Behandlung. Der Gehalt an Lactobacillus, norank_f__Muribaculaceae und Romboutsia nahm signifikant zu, während Bifidobacterium und Clostridium_sensu_stricto_1 nach der Behandlung mit D. caudatum signifikant abnahmen. Darüber hinaus deutet das Gemeindediagramm darauf hin, dass die Zusammensetzung der Gemeinschaft von Gruppe T der von Gruppe C ähnlicher ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass D. caudatum die Prävalenz von Gastritis bei Ratten verbessern könnte. Die spezifischen Mechanismen, die hinter der Verringerung des Gehalts des Probiotikums Bifidobacterium durch D. caudatum stehen, bedürfen jedoch weiterer Forschung.
Die ELISA-Kit-Methode besitzt eine hohe Sensitivität, eine starke Spezifität, eine einfache Bedienung und eine Eignung für kleine Probengrößen32. In dieser Studie wurde es verwendet, um den Gehalt an Malondialdehyd (MDA) und Gastrin (GAS) im Rattenserum nachzuweisen. MDA spiegelt den Grad der Lipidperoxidation wider und zeigt indirekt das Ausmaß der Zellschädigung an. Bei Ratten mit Gastritis war der MDA-Spiegel signifikant höher als bei normalen Ratten, was auf eine Schädigung der Magenparietalzellen hindeutet. Die Behandlung mit D. caudatum senkte den MDA-Spiegel signifikant, was auf sein Potenzial bei der Behandlung von Gastritis hinweist. Umgekehrt erhöhte D. caudatum den reduzierten GAS-Spiegel und trug zur Reparatur oder Behandlung von Gastritis bei.
Es gibt jedoch Einschränkungen sowohl bei der 16S rRNA-Hochdurchsatz-Gensequenzierung als auch bei der ELISA-Kit-Methode. Bei der 16S-rRNA-Hochdurchsatz-Gensequenzierung kann eine niedrige Auflösung die Unterscheidung von Stämmen oder Gattungen mit sehr ähnlichen Sequenzen erschweren, was zu Schwierigkeiten bei der Klassifizierung auf höheren taxonomischen Ebenen wie Gattung, Familie oder Stamm33 führt. Für die ELISA-Kit-Methode sind in der Regel Probenvorbehandlungsschritte wie Verdünnung und Waschen erforderlich, was zu potenziellen Fehlern und Variabilität führt34.
Diese Studie legt nahe, dass D. caudatum Gastritis behandeln kann, indem es gastrointestinale Hormone und die Darmflora reguliert, und gibt Einblicke in seine breiten klinischen Anwendungen. Zukünftige Forschungen sollten sich jedoch mit anderen Magen-Darm-Hormonen, den Mechanismen der Regulierung der Darmflora und den beteiligten wirksamen Chemikalien befassen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die wichtigsten F&E-Projekte des Wissenschafts- und Technologieministeriums der Provinz Sichuan (2020YFS0539) finanziert.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alpha-Diversitätsanalyse | Mothur 1.30.2 | ||
| AxyPrep Desoxyribonukleinsäure (DNA) Gel-Extraktionskit | Axygen Biosciences | AP-GX-50 | |
| Beta-Diversitätsanalyse | Qiime 1.9.1 | ||
| Kryo-Kühlschrank | Forma-86C ULT-Gefrierschrank | ||
| Desmodium caudatum | Das Krankenhaus für traditionelle chinesische Medizin von Beichuan Qiang Autonomer Kreis | ||
| E.Z.N.A. Boden-Kit | Omega Bio-tek | D5625-01 | |
| Illumina MiSeq Platform | Illumina Miseq PE300/NovaSeq PE250 | ||
| Multiskan Spectrum | spectraMax i3 | ||
| OTU Clustering | Uparse 7.0.1090 | ||
| OTU statistics | Usearch 7.0 | ||
| PCR Gerät | TransGen AP221-02 | ||
| PCR Gerät | ABI GeneAmp 9700 | ||
| QuantiFluor-ST doppelsträngig DNA-System (dsDNA) | Promega Corp. | ||
| Annotation zur Sequenzklassifizierung | RDP Classifier 2.11 | ||
| Natriumsalicylat | Sichuan Xilong Chemical Co., Ltd | 54-21-7 | |
| SPF Ratten | Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd | ||
| SPSS 18.0 | IBM |
Referenzen
- Marginean, C. M., et al. The importance of accurate early diagnosis and eradication in Helicobacter pylori infection: pictorial summary review in children and adults. Antibiotics (Basel). 12 (1), 60(2022).
- Sipponen, P., Maaroos, H. I. Chronic gastritis. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 50 (6), 657-667 (2015).
- Wang, D. J. Methodological quality and reporting quality evaluation of chinese medicine diagnosis and treatment guidelines for chronic gastritis in China. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (7), 2776-2783 (2022).
- Burkitt, M. D., Varro, A., Pritchard, D. M. Importance of gastrin in the pathogenesis and treatment of gastric tumors. World Journal of Gastroenterology. 15 (1), 1-16 (2009).
- Hayakawa, Y., Chang, W., Jin, G., Wang, T. C. Gastrin and upper GI cancers. Current Opinion in Pharmacology. 31, 31-37 (2016).
- Zhang, C. Z., He, M. X., Jin, L. W., Liu, W. D. Effect of aluminum phosphate gel combined with atropine on patients with acute gastritis and its effect on serum gastrin and malondialdehyde levels. International Journal of Digestive Diseases. 40 (2), 137-140 (2020).
- Wang, Y. K., et al. Levels of malondialdehyde in the gastric juice: its association with Helicobacter pylori infection and stomach diseases. Helicobacter. 23 (2), e12460(2018).
- Turkkan, E., et al. Does Helicobacter pylori-induced inflammation of gastric mucosa determine the severity of symptoms in functional dyspepsia. Journal of Gastroenterology. 44 (1), 66-70 (2009).
- Liu, Y., Cai, C., Qin, X. Regulation of gut microbiota of Astragali Radix in treating for chronic atrophic gastritis rats based on metabolomics coupled with 16S rRNA gene sequencing. Chemico-Biological Interactions. 365, 110063(2022).
- Gai, X., et al. Heptadecanoic acid and pentadecanoic acid crosstalk with fecal-derived gut microbiota are potential non-invasive biomarkers for chronic atrophic gastritis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 1064737(2023).
- Sgambato, D., et al. Gut microbiota and gastric disease. Minerva Gastroenterologica e Dietologica. 63 (4), 345-354 (2017).
- Li, J., et al. Pharmacogenetic study of Desmodium caudatum. Anais Da Academia Brasileira De Ciencias. 91 (2), e20180637(2019).
- Xu, Q. N., et al. Phenolic glycosides and flavonoids with antioxidant and anticancer activities from Desmodium caudatum. Natural Product Research. 35 (22), 4534-4541 (2021).
- Li, W., et al. Anti-inflammatory and antioxidant activities of phenolic compounds from Desmodium caudatum leaves and stems. Archives of Pharmacal Research. 37 (6), 721-727 (2014).
- Shao, X. H., Wang, J. G. Establishment of chronic atrophic gastritis in a rat model. Journal of Zhangjiakou Medical Collage. 19 (2), 11-13 (2002).
- Yu, C., et al. Dysbiosis of gut microbiota is associated with gastric carcinogenesis in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 126, 110036(2020).
- Chen, R., et al. Fecal metabolomics combined with 16S rRNA gene sequencing to analyze the changes of gut microbiota in rats with kidney-yang deficiency syndrome and the intervention effect of You-gui pill. Journal of Ethnopharmacology. 224, 112139(2019).
- Li, Q., et al. Magnetic anchoring and guidance-assisted endoscopic irreversible electroporation for gastric mucosal ablation: a preclinical study in canine model. Surgical Endoscopy. 35 (10), 5665-5674 (2021).
- Xu, H., et al. Therapeutic assessment of fractions of Gastrodiae Rhizoma on chronic atrophic gastritis by 1H NMR-based metabolomics. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112403(2020).
- Zhang, B. N., et al. Effects of Atractylodes lancea extracts on intestinal flora and serum metabolites in mice with intestinal dysbacteriosis. Proteome Science. 21 (1), 5(2023).
- Tian, H., et al. The therapeutic effects of Magnolia officinalis extraction on an antibiotics-induced intestinal dysbacteriosis in mice. Current Microbiology. 77 (9), 2413-2421 (2020).
- Wang, J., et al. Tumor and microecology committee of China anti-cancer association. Chinese expert consensus on intestinal microecology and management of digestive tract complications related to tumor treatment (version 2022). Journal of Cancer Research and Therapeutics. 18 (7), 1835-1844 (2022).
- Xu, W., Xu, L., Xu, C. Relationship between Helicobacter pylori infection and gastrointestinal microecology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 938608(2022).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 5029(2019).
- Callahan, B. J., et al. High-throughput amplicon sequencing of the full-length 16S rRNA gene with single-nucleotide resolution. Nucleic Acids Research. 47 (18), e103(2019).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Huang, D., et al. Characteristics of intestinal flora in patients with gastric cancer based on high throughput sequencing technology. Chinese Journal of Clinical Research. 35 (3), 303-306 (2022).
- Shi, Y., Luo, J., Narbad, A., Chen, Q. Advances in lactobacillus restoration for β-lactam antibiotic-induced dysbiosis: a system review in intestinal microbiota and immune homeostasis. Microorganisms. 11 (1), 179(2023).
- Grigor'eva, I. N. Gallstone disease, obesity and the Firmicutes/Bacteroidetes ratio as a possible biomarker of gut dysbiosis. Journal of Personalized Medicine. 11 (1), 13(2020).
- Thorne, G. M. Diagnosis of infectious diarrheal diseases. Infectious Disease Clinics of North America. 2 (3), 747-748 (1988).
- Banks, M., et al. British society of gastroenterology guidelines on the diagnosis and management of patients at risk of gastric adenocarcinoma. Gut. 68 (9), 1545-1575 (2019).
- Roy-Lachapelle, A., et al. Evaluation of ELISA-based method for total anabaenopeptins determination and comparative analysis with on-line SPE-UHPLC-HRMS in freshwater cyanobacterial blooms. Talanta. 223, 121802(2021).
- Shahi, S. K., et al. Microbiota analysis using two-step PCR and next-generation 16S rRNA gene sequencing. Journal of Visualized Experiments. (152), e59980(2019).
- Huang, R., et al. Blocking-free ELISA using a gold nanoparticle layer coated commercial microwell plate. Sensors (Basel). 18 (10), 3537(2018).
Nachdrucke und Genehmigungen
