Bewertung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs mit einem Platten-Reader-basierten Fluoreszenz-Assay

Summary

Die Bewertung des Sauerstoffverbrauchs liefert integrale Informationen über die Mitochondrienfunktion. Durch die Verwendung einer Phosphoreszenzsonde mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät können genaue und reproduzierbare Daten ohne spezielle Ausrüstung erhalten werden. Dieser Assay ermöglicht es jedem Labor, den Sauerstoffverbrauch isolierter Mitochondrien zu messen und die Atemkontrollverhältnisse zu berechnen.

Abstract

Mitochondrien erfüllen viele wichtige Funktionen, darunter die Zellatmung, die ATP-Produktion, die Kontrolle der Apoptose und die Funktion als zentraler Knotenpunkt der Stoffwechselwege. Daher kann die experimentelle Bewertung der mitochondrialen Funktionalität Aufschluss über Variationen zwischen verschiedenen Populationen oder Krankheitszuständen geben. Darüber hinaus ist es wertvoll zu beurteilen, ob isolierte Mitochondrien gesund genug sind, um mit Experimenten fortzufahren. Ein Merkmal, das häufig zum Vergleich der mitochondrialen Funktion in verschiedenen Proben herangezogen wird, ist die Rate des Sauerstoffverbrauchs. Der Sauerstoffverbrauch und die anschließende Berechnung des respiratorischen Kontrollverhältnisses in intakten Zellen oder aus Gewebe isolierten Mitochondrien können allen drei Zwecken dienen. Mit Mitochondrien, die aus der Leber von Pinselechsen isoliert wurden, in Verbindung mit einer phosphoreszierenden Sonde, die empfindlich auf die Schwankungen der Sauerstoffkonzentration einer Lösung reagiert, maßen wir den Sauerstoffverbrauch mit einem Fluoreszenzplatten-Reader. Diese Methode ist nicht nur schnell und effizient, sondern kann auch mit einer kleinen Menge an Mitochondrien und ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden. Das hier beschriebene Schritt-für-Schritt-Protokoll erhöht die Zugänglichkeit der mitochondrialen Funktionsbewertung für Forscher.

Introduction

Mitochondrien sind Organellen, etwa so groß wie Bakterien, die in eukaryotischen Zellen vorkommen. Sie sind einzigartige Organellen, da sie DNA enthalten und zwei Membranen haben, eine äußere und eine innere. Die äußere und die innere Membran der Mitochondrien sind durch einen Intermembranraum getrennt, und die innere Membran faltet sich um das innerste Kompartiment, die Matrix, zu Strukturen, die Cristae, genannt werden. Diese Crista vergrößern die Oberfläche der inneren Membran, so dass mehrere Prozesse, bei denen die Crista verwendet werden, gleichzeitig ablaufen können. Während Mitochondrien an vielen zellulären Funktionen beteiligt sind, wie z. B. der Kontrolle der Apoptose und der Beherbergung mehrerer Stoffwechselwege, ist ihre wichtige Rolle bei der Produktion von ATP für das Überleben der Zellen unerlässlich. Tatsächlich werden 90 % der Energie einer Zelle aus den Mitochondrien^{gewonnen 1}. Bei der ATP-Produktion entsteht eine elektrochemische Differenz zwischen der äußeren und der inneren Membran, die als mitochondriales Membranpotential (Δψ) bezeichnet wird und entsteht, wenn H⁺ -Ionen aus der Matrix in den Intermembranraum gepumpt werden. Die ATP-Produktion wird schließlich während der Oxidation von reduzierenden Äquivalenten durch Elektronenbewegung durch die mitochondriale Atmungskette (ETC) nutzbar gemacht. Der endgültige Elektronenakzeptor ist molekularer Sauerstoff (O₂). Wenn Sauerstoff verbraucht wird, baut sich die H⁺ -Konzentrationsdifferenz bis zu ihrem Maximum auf, woraufhin sich H⁺ -Ionen in ihrem Konzentrationsgradienten vom Intermembranraum zur Matrix bewegen, indem sie den ATP-Synthase-Komplex passieren. Die Bewegung von H^+- Ionen bewirkt eine Konformationsänderung der ATP-Synthase, und ADP wird in die Nähe von anorganischem Phosphat gebracht, um zu reagieren und ATP zu erzeugen. Schließlich wird ATP aus der mitochondrialen Matrix in das Zytosol transloziert und kann aufgrund der großen Menge an freier Energie, die bei der Hydrolyse seiner Phosphate freigesetzt wird, entweder gespeichert oder zur Erleichterung von Reaktionen verwendet werden. Dieser ganze Prozess wird als oxidative Phosphorylierung bezeichnet, und da Sauerstoff verbraucht wird, soll man sagen, dass die Mitochondrien^{atmen 2}.

Der Aufbau und die Stärke von Δψ, die reduzierte Menge an O₂ (sogenannter Sauerstoffverbrauch) sowie die Bildung von ATP können als Hinweise auf die Zellgesundheit verwendet werden. Mitochondriale funktionelle Studien, wie z. B. die Messung von Δψ, des Gesamt-ATP-Gehalts und der Produktion sowie des Sauerstoffverbrauchs, können entweder durch traditionelle biochemische Methoden oder durch Fluoreszenz und Lumineszenz in plattenbasierten Assays quantifiziert werden. Zum Beispiel kann das mitochondriale Membranpotential zwischen verschiedenen Proben mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Tetramethylrhodaminethylester verglichen werden, der spezifisch an Mitochondrien bindet. Die ATP-Erzeugung kann überwacht werden, indem einer Reaktion, deren Änderungen mit der ATP-Konzentration korrelieren, ein lumineszierendes Protein hinzugefügt wird. Die Quantifizierung der Sauerstoffverbrauchsraten oder absoluten Atmungsraten während der OXPHOS kann helfen, die Ursachen für Ungleichheiten in der mitochondrialen Funktion und im Energiestoffwechsel aufzuklären. Die Bewertung des Sauerstoffverbrauchs kann zur Berechnung der Atemkontrollverhältnisse (RCRs) verwendet werden. RCR-Werte beschreiben die Fähigkeit der Mitochondrien, ATP als Reaktion auf den Einstrom von ADP zu bilden, was die Hauptfunktion der Mitochondrien ist. RCR-Werte geben Aufschluss über den Gesamtzustand isolierter Mitochondrien und ermöglichen den Vergleich des Ansprechens auf verschiedene experimentelle Behandlungen. Unterschiede in den RCR-Werten können eine mitochondriale Dysfunktion darstellen oder auf einen biologischen Unterschied zwischen verschiedenen Mitochondrien hinweisen, die aus zwei oder mehr Quellen isoliert wurden. Ein weiteres wichtiges Maß für die Funktion in isolierten Mitochondrien ist die mitochondriale Effizienz, definiert als Mol ATP, die pro Mol O₂ synthetisiert werden, oder das P/O-Verhältnis³.

Angesichts der Menge an Informationen, die durch die Messung mitochondrialer Parameter gesammelt werden können, und der verschiedenen Fälle, in denen diese Informationen genutzt werden können, kann die Fähigkeit, funktionelle Daten effizient zu sammeln, in vielen verschiedenen Forschungsbereichen nützlich sein. Messungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs werden seit Jahrzehnten mit sehr spezifischen Instrumenten durchgeführt – mit einer Clark-Elektrode, die durch die für die Durchführung von Messungen erforderliche Probengröße begrenzt werden kann, und in jüngerer Zeit mit hochentwickelten Instrumenten, die die mitochondriale Atmung und mehrere andere Parameter messen können, aber unerschwinglich sein können. Dieses Protokoll ist ein angepasster alternativer Ansatz unter Verwendung einer sauerstoffempfindlichen Phosphoreszenzsonde (MitoXpress)^4,5. Das Sondensignal wird mit einem Plattenleser im zeitaufgelösten Fluoreszenzmodus für kontinuierliche Messungen über die Zeit detektiert. Die Phosphoreszenz hat im Vergleich zur Fluoreszenz eine größere Energiedifferenz zwischen dem absorbierten und dem emittierten Photon und eignet sich daher besser für die kontinuierliche Überwachung von Signaländerungen. Dies ermöglicht es fast jedem Labor, diese Messungen durchzuführen, nicht nur diejenigen, die sich auf den mitochondrialen Stoffwechsel konzentrieren oder sich hochspezialisierte Geräte leisten können. Das Modellsystem, das wir verwenden, besteht aus isolierten Mitochondrien von drei Baumeidechsen, zwei Elternarten und einer introgressiven Art (mit Kern-DNA von einer Elternart und Mitochondrien von der anderen – Hybriden). Diese Eidechsen wurden ausgewählt, weil wir die Hypothese aufstellten, dass es metabolische und energetische Konsequenzen für Hybride mit unterschiedlichen nuklearen und mitochondrialen DNA-Quellen gibt. Wir haben ein kommerziell erhältliches Assay-Kit mit einem Multi-Mode-Platten-Reader verwendet, der den Zugang zu dieser Art von Assay für mehr Forscher und Forschungsbereiche verbessern kann.

Protocol

Die Eidechsen wurden durch CO₂ -Erstickung eingeschläfert, gefolgt von einer sofortigen Enthauptung in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Office of Animal Laboratory Welfare und den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee von Elon.

1. Isolierung der Mitochondrien⁶

HINWEIS: Halten Sie alle Lösungen (Tabelle 1) und die Proben während dieser Schritte auf Eis.

1. Nehmen Sie die Leber, wiegen Sie sie und spülen Sie sie dann mit ~3 mL eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x, -/-) aus.
2. Zerkleinern Sie die Leber in 1 mL L-MIB mit einer frischen Rasierklinge.
3. Bringen Sie das Gesamtvolumen des Gewebes plus L-MIB auf 2 ml und unterbrechen Sie die Leberzellen mechanisch für vier Durchgänge mit einem Dounce Homogenisator.
4. Das Homogenat bei 300 × g (37 °C, 10 min) schleudern.
5. Den Überstand in eine frische Tube umfüllen und auf Eis legen.
6. Das Pellet in 2 mL L-MIB resuspendieren, rehomogenisieren und erneut bei 300 × g (37 °C, 10 Minuten) schleudern.
7. Kombinieren Sie die Überstände aus beiden Schleudern und zentrifugieren Sie bei 10.000 × g (37 °C, 10 min).
8. Resuspendieren Sie das Pellet in ~0,350 mL L-MIB.
9. Bestimmen Sie die Gesamtproteinmenge (mg Mitochondrien/ml L-MIB), die als Näherung für den mitochondrialen Gehalt verwendet werden^{soll 4,5,6}.

2. Sauerstoffverbrauch

1. Alle verwendeten Lösungen (Tabelle 1) werden in den folgenden Schritten im Wasserbad auf 30 °C erwärmt.
2. Verdünnen Sie die Mitochondrien in LEB auf 6 mg/ml, basierend auf den Ergebnissen des Proteinkonzentrationsassays in Schritt 1.9.
3. Richten Sie den Assay in einer sterilen, schwarzwandigen, durchsichtigen 96-Well-Bodenplatte ein (Tabelle 2).
   1. Geben Sie 50 μl der Probe (L-EB-Puffer oder Mitochondrienprobe) in die entsprechenden Vertiefungen.
   2. Fügen Sie 50 μl Behandlung hinzu (L-EB, Glutamat/Malat oder Glutamat/Malat mit ADP).
   3. Verdünnen Sie das Sondenmaterial 1:10 in L-EB und geben Sie dann 100 μl der Fluoreszenzsonde in jede Vertiefung.
   4. Geben Sie vorsichtig 50 μl Schweröl in jede Vertiefung, um Fremdsauerstoff auszuschließen.
4. Lesen Sie Fluoreszenzmessungen von der Unterseite der Platte bei 380/650 nm Anregung/Emission alle 1,5 min für 45 min. Verwenden Sie den kinetischen Modus mit einer Zeitverzögerung von 30.000 μs und einem Messfenster von 100 μs.

3. Datenanalyse

1. Exportieren Sie die Rohdatendatei vom Plattenlesegerät als .xls Datei.
2. Öffnen Sie die Datei, kopieren Sie die Rohdaten, fügen Sie sie in eine neue Registerkarte ein, und beschriften Sie die Zeilen und Spalten entsprechend.
3. Plotten Sie den L-EB-Puffer nur auf die Kontrollprobe und L-EB + G/M als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) über die Zeit.
   HINWEIS: Diese Linien sollten relativ flach sein, da keine Mitochondrien vorhanden sind und daher keine Änderung der Sauerstoffkonzentration festgestellt werden sollte.
4. Plotten Sie die Abtastwerte L-EB + G/M als RFU über die Zeit.
5. Bestimmen Sie, wo die Messwerte konsistenter werden und für die Kontrollen abflachen.
   HINWEIS: Hier sollte die Datenanalyse für experimentelle Proben beginnen (markiert durch Pfeile in Abbildung 1A). Es kann 10-15 Minuten dauern, bis die Reaktionen abflachen und ihr Maximum erreichen.
6. Erstellen Sie einen neuen Plot, der nur die Daten nach dem in Schritt 3.5 festgelegten Zeitpunkt enthält (sogenannte "getrimmte" Daten) und fügen Sie die am besten angepasste Linie hinzu, um die zu analysierenden Rohdaten zu visualisieren.
7. Berechnen Sie den durchschnittlichen RFU-Wert der getrimmten Nur-Puffer-Daten der Steuerung (gelb hervorgehoben). Dieser Wert wird als minimaler RFU-Wert als Ausgangswert in der folgenden Sauerstoffberechnung verwendet.
8. Berechnung des Sauerstoffverbrauchs (μM_{Ø 2}/min)
   1. Kopieren Sie den linearen Bereich der Rohdaten aus Schritt 3.6 (d. h. die getrimmten Daten) und fügen Sie ihn ein, um die Sauerstoffkonzentration in den mitochondrialen Proben bei der G/M + ADP-Behandlung zu jedem Zeitpunkt 7,8,9,10 zu bestimmen.
   2. Verwenden Sie Gleichung (1)⁵ , um die Sauerstoffkonzentration zu jedem Zeitpunkt zu bestimmen. [O₂]_a ist die Sauerstoffkonzentration in luftgesättigtem Puffer (235 mM bei 30 °C). I(t), Ia und Io sind das Fluoreszenzsignal der Probe + Sonde zum Zeitpunkt t (z. B. Probe + G/M + ADP), das in Schritt 3.7 berechnete durchschnittliche Signal der Sonde in luftgesättigtem Puffer bzw. das maximale Signal in sauerstoffarmem Puffer (eingestellt auf das maximal erreichbare Signal).
      (1)
   3. Zeichnen Sie die in Schritt 3.8.2 _berechneten [O₂]t-Werte in Abhängigkeit von der Zeit und fügen Sie eine lineare Trendlinie zusammen mit der Gleichung der am besten angepassten Linie hinzu.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Steigung jeder Linie als Sauerstoffverbrauchsrate. Duplikate oder Triplikate für jede Stichprobe können aggregiert und für den Vergleich der Verbrauchsrate verwendet werden.
9. Berechnen Sie die RCR, indem Sie die mitochondriale Atmung mit und ohne ADP dividieren, die die Zustände 3 bzw. 2 darstellen.

Results

Die Sauerstoffverbrauchsrate und die mitochondriale RCR wurden aus den Mitochondrien von drei verschiedenen Eidechsen unter Verwendung eines Assay-Kits mit einer phosphoreszierenden Sauerstoffsensorsonde und einem Standard-Fluoreszenzplatten-Reader bestimmt. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die Sonde in diesem Kit direkt mit dem Sauerstoffverbrauch korreliert, wobei die Phosphoreszenz durch molekularen Sauerstoff gelöscht wird und das Fluoreszenzsignal zunimmt, wenn der Sauerstoffgehalt aufgrund der mitochondrialen Atmung sinkt ^7,11. Die RFU-Werte werden sowohl für Kontroll- als auch für experimentelle Proben im Laufe der Zeit aufgezeichnet und dann analysiert. Die RFU-Messwerte für Kontrollvertiefungen (nur Puffer, Puffer mit Glutamat/Malat und Puffer mit Glutamat/Malat + ADP) wurden gegen die Zeit aufgetragen, um festzustellen, dass Änderungen der Fluoreszenz in experimentellen Probenvertiefungen auf das Vorhandensein von Mitochondrien zurückzuführen sind. Darüber hinaus ermöglicht die Glutamat/Malat + ADP-Kontrolle die Ausgangsmenge an Sauerstoff während der Datenerfassung. Experimentelle Proben, die isolierte Mitochondrien enthielten, wurden ebenfalls in derselben Grafik wie die Kontrollen dargestellt.

Abbildung 1A zeigt, dass die RFUs im Laufe der Zeit aus einer Stichprobe isolierter Mitochondrien zunehmen, im Gegensatz zu den relativ flachen RFU-Werten der Kontrollen. Da die Reaktionen Zeit brauchen, um sich auszugleichen, werden die ersten etwa 10 Messwerte, bis die Messwerte der Kontrollprobe nicht mehr so verrauscht sind und sich einpendeln, aus dem Datensatz entfernt (Ergänzende Tabelle S1 und Ergänzende Abbildung S1). Als nächstes werden die verbleibenden Werte aus der Mitochondrienprobe, die mit Glutamat/Malat + ADP behandelt wurde, unter Verwendung von Gleichung (1) in die Sauerstoffkonzentration zu jedem Zeitpunkt umgewandelt (siehe Protokollschritt 3.2) und dann über die Zeit aufgetragen. Abbildung 1B zeigt das Ergebnis der experimentellen Stichprobe in Abbildung 1A (Kreuze), bei der der^R2-Wert sehr nahe bei 1 liegt und die Steigung der Linie berechnet werden kann. Die Steigung der Linie ist negativ, da mit zunehmendem Sauerstoffverbrauch die Gesamtsauerstoffkonzentration in dieser Probe abnimmt. Derselbe Vorgang wird für dieselben mitochondrialen Proben wiederholt, die mit Glutamat/Malat ohne ADP behandelt wurden, um Sauerstoffverbrauchsraten zu erhalten (Ergänzende Tabelle S2 und Ergänzende Abbildung S2). Dann kann die mitochondriale Atmung mit und ohne ADP, die die Zustände 3 bzw. 2 repräsentieren, zur Berechnung der RCR für jeden Probentyp verwendet werden (Ergänzende Abbildung S2). Beim direkten Vergleich zeigt die durchschnittliche RCR zwischen den drei verschiedenen Baumeidechsenarten, dass die RCR des Hybriden mit introgressierten Mitochondrien signifikant niedriger ist als die der beiden Elterntypen (Abbildung 1C). Hybrid-Eidechsen-Mitochondrien wiesen Sauerstoffverbrauchsraten auf, die zwischen den beiden Elterntypen lagen (Abbildung 2).

Abbildung 1: Beispiele für die Ergebnisse des Sauerstoffverbrauchs-Assays. (A) Rohdaten von Nur-Puffer-Kontrollreaktionen und Reaktionen, einschließlich isolierter Mitochondrien, die mit Glutamat und Malat (G/M) behandelt wurden, mit oder ohne Zusatz von ADP. Die Fluoreszenz wurde über die Zeit überwacht. Wenn Sauerstoff verbraucht wird, nimmt die Fluoreszenz zu. Reine Pufferreaktionen (G/M, gekennzeichnet durch Kreise, und G/M + ADP, gekennzeichnet durch Dreiecke) und Mitochondrien mit G/M-Behandlung (gekennzeichnet durch Quadrate) zeigten keine Veränderung. Mitochondrien, die mit G/M + ADP behandelt wurden (gekennzeichnet durch Pluszeichen), verbrauchten Sauerstoff. (B) Veränderungen der Sauerstoffkonzentration im Laufe der Zeit, berechnet auf der Grundlage der Rohdaten für Mitochondrien, die mit G/M + ADP behandelt wurden, die in A dargestellt sind. (C) RCR-Werte für Mitochondrien von drei verschiedenen Eidechsenarten, gemessen bei Raumtemperatur. Diese Figur ist eine Reproduktion von Haenel und Del Gaizo Moore¹². Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von ANOVAs in R durchgeführt. Abkürzungen: G = Glutamat; M = Malat; RCR = respiratorisches Kontrollverhältnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Sauerstoffverbrauch der Mitochondrien von drei Arten von Eidechsen. Boxplots zeigen den Median der Sauerstoffverbrauchsraten als Balken und die Mittelwerte als Punkt. Die Elterntypen, Urosaurus graciosus und Urosaurus ornatus, unterschieden sich deutlich voneinander. Die introgressierte Form (Hybrid) war zwischen den Elterntypen und unterschied sich nicht signifikant von beiden. Diese Figur ist eine Reproduktion von Haenel und Del Gaizo Moore¹². Abkürzungen: Ug= Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Zusammensetzung der im Protokoll verwendeten Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Plattenkarte für den Sauerstoffverbrauchs-Assay. Für jede Probe sind mindestens 6 Vertiefungen beiseite zu legen (3 Kontrollvertiefungen: nur L-EB, L-EB mit G/M-Behandlung, L-EB mit G/M + ADP-Behandlung; 3 Versuchsvertiefungen/Proben: Mitochondrien mit L-EB-Behandlung, L-EB + G/M und L-EB G/M +ADP-Behandlung). Wenn möglich, führen Sie jede experimentelle Stichprobe in doppelter oder dreifacher Ausführung aus. Abkürzungen: G = Glutamat; M = Malat; L-EB = Eidechsen-spezifischer experimenteller Puffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Datenplots. (A) Darstellung aller Rohdaten für den Vergleich von Proben und Kontrollen. (B) Darstellung der umrandeten Rohdaten aus hervorgehobenen Spalten in der ergänzenden Tabelle S1, die zeigt, dass nur die Vertiefungen, die Proben von Mitochondrien enthielten, einen nennenswerten Anstieg der RFUs aufwiesen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Sauerstoffverbrauch und Atemkontrollverhältnisse. (A) Darstellung der Sauerstoffverbrauchsdaten aus der ergänzenden Tabelle S1 zur Bestimmung der Werte für Zustand 2 und Zustand 3 durch Ermittlung der Gleichungen der am besten angepassten Linien. (B) Berechnung des RCR-Verhältnisses unter Verwendung der Steigungen der Linien in (A), die den Zustand 2 und den Zustand 3 darstellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: Repräsentatives Beispiel für Rohdaten. Hervorgehobene Spalten sind Daten, die für Abbildungen und Berechnungen verwendet werden (d. h. gekürzte Daten). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S2: Repräsentatives Beispiel für getrimmte Daten und anschließende Berechnungen des Sauerstoffverbrauchs. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Messung der mitochondrialen Funktion ist nützlich beim Vergleich verschiedener Proben, z. B. Krankheits- und Nicht-Krankheitszustände, verschiedener Gewebetypen desselben Tieres oder zwischen verschiedenen Probentypen. Den späteren Vergleich nutzten wir, um unsere Hypothese zu testen, dass hybride Baumeidechsen, die Mitochondrien introgressiert haben, eine metabolische Konsequenz haben. Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, die Funktion der Mitochondrien experimentell zu bestimmen, einschließlich der Quantifizierung von Δψ, des Gesamt-ATP-Gehalts, der ATP-Produktion sowie der Atemkontrolle und des Sauerstoffverbrauchs. Messungen des Sauerstoffverbrauchs isolierter Mitochondrien können mit speziellen Geräten wie einer Clark-Elektrode oder den ausgefeilteren Seahorse XFs durchgeführt werden. Diese Methoden können jedoch entweder durch die für die Durchführung von Messungen erforderliche Stichprobengröße einschränkend oder kostspielig sein. Multimode-Platten-Reader, die Fluoreszenz lesen können, sind zu einem Standardgerät in zellbiologischen und biochemischen Laboren geworden. Ein alternativer Ansatz zur quantitativen Analyse des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs besteht daher darin, ein kommerziell erhältliches Kit mit einem Fluoreszenzplatten-Reader zu verwenden. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt, wie der Sauerstoffverbrauch gemessen und die Berechnungen durchgeführt werden. und wirtschaftlich in isolierten Mitochondrien. Die genaue Messung der Fähigkeit von Mitochondrien, ATP zu produzieren, wenn sie mit ADP versorgt werden, was als Atmung des Zustands 3 bezeichnet wird, ermöglicht einen direkten Vergleich von OXPHOS zwischen Proben, und Unterschiede können auf funktionelle Unterschiede hinweisen. Darüber hinaus zeigt die Atmung des Zustands 3 auch die Qualität der isolierten Mitochondrien an, was bestimmen kann, ob ein Isolierungsverfahren funktioniert hat und/oder die Probe gut genug ist, um in anderen Assays verwendet zu werden. Die RCR-Werte, die unter Verwendung der Werte von Zustand 2 (nur Glutamat und Malat, um Δψ zu bilden) und Zustand 3 (Glutamat und Malat plus ADP, damit Δψ für die ATP-Produktion verwendet werden kann) berechnet werden, liefern eine weitere Information zum Vergleich und über die Gesundheit der isolierten Mitochondrien. Die vorgestellten Daten zeigen, dass die in diesem Artikel vorgestellte Methode dazu beitragen kann, Variationen zwischen verschiedenen Probentypen zu entschlüsseln und Sauerstoffverbrauchsraten und RCR-Werte zu messen, ohne dass hochspezialisierte Geräte erforderlich sind, wodurch diese Arten von Messungen leichter zugänglich gemacht werden.

In diesem Protokoll isolierten wir frisch Mitochondrien aus Eidechsen, und der Sauerstoffverbrauch wurde mit einem MitoXpress Xtra Hs-Assay nach dem Protokoll des Herstellers bestimmt und gemäß Hynes et ^al.4 und Will et ^al.5 modifiziert. Eidechsen reichten von 3,3 g bis 5,1 g in der Gesamtkörpermasse mit einem Durchschnitt von 0,170 g Lebergewebe/Eidechse. was ~0,350 ml konzentrierte, rohe Mitochondrien ergab. Die isolierten Mitochondrien wurden im Sauerstoffverbrauchsassay mit 6 mg/ml Protein verwendet. Wenn die mitochondriale Proteinkonzentration, wie in Protokollschritt 1.7 bestimmt, niedrig ist, kann die Probe bei 10.000 × g erneut geschleudert und das Pellet in einem kleineren Volumen L-MIB resuspendiert werden. Es sollte auch beachtet werden, dass wir erfolgreich nur 4 mg/ml für kleine Leberproben verwendet haben oder wenn nicht die gesamte Leber verfügbar war.

Um einen Gas- und Temperaturausgleich der Proben zu Beginn des Assays zu gewährleisten, sollten alle Lösungen, die in Protokollabschnitt 2 verwendet werden, in einem Wasserbad auf 30 °C vorgewärmt werden. Im Protokollabschnitt 3 werden die Änderungsraten des gelösten Sauerstoffs (mM/min) aus den anfänglichen Steigungen der abnehmenden Sauerstoffkonzentrationsprofile für jede Probe extrapoliert (Protokollschritt 3.3; Ergänzende Tabelle S1 und Ergänzende Abbildung S1). Die Stichprobe + G/M-Behandlungsraten repräsentieren die mitochondriale Atmung des Zustands 2, während die Stichprobe mit G/M + ADP-Behandlungsraten die mitochondriale Atmung des Zustands 3 darstellt. Daher werden RCRs für jede Probe berechnet, indem die Werte des Zustands 3 durch die Werte des Zustands 2 für jede Probe dividiert werden (Ergänzende Tabelle S2).

Der Sauerstoffverbrauch kann entweder zwischen einzelnen Proben verglichen werden, wie hier gezeigt, oder zwischen verschiedenen Behandlungen in einer Probe. Im letzteren Fall können zusätzliche Kontrollen erforderlich sein, wie z. B. eine reine Fahrzeugkontrolle mit und ohne Mitochondrien, um die Möglichkeit auszuschließen, dass die chemische Behandlung selbst nicht mit der phosphoreszierenden Sonde interagiert. Darüber hinaus können die gesammelten Sauerstoffverbrauchs- und RCR-Daten in Verbindung mit Daten verwendet werden, die aus denselben Proben mit anderen Assays gesammelt wurden. Sobald die Mitochondrien isoliert sind, können sie in mehreren Assays verwendet werden, um ein vollständigeres Bild ihrer Funktion zu erhalten¹². Die Messung von Δψ, des Gesamt-ATP-Gehalts und der ATP-Umsatzrate sind einige der Assays, die kombiniert wurden. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von ETC-, OXPHOS- und ATP-Synthase-Inhibitoren in den Assays ein noch umfassenderes Verständnis der verschiedenen mitochondrialen Probentypen, was alle Schlussfolgerungen aus den generierten Daten untermauert.

Ein weiterer Parameter, der in isolierten Mitochondrien gemessen werden kann, ist die mitochondriale Effizienz, die definiert ist als das P/O-Verhältnis der synthetisierten ATP-Mole pro Mol O ^{2 3}. P/O-Verhältnisse könnten in einer Erweiterung dieses Protokolls berechnet werden, indem man den Mitochondrien des Zustands 3 erlaubt, das in der Reaktion zugeführte ADP zu erschöpfen, und dann ein Aliquot des ADP-Substrats hinzufügt, gefolgt von einer Hemmung der ATP-Synthase durch die Zugabe von Oligomycin. Diese zusätzlichen Schritte ermöglichen die Berechnung des Zustands 4, der auftritt, wenn Mitochondrien weiterhin Sauerstoff verbrauchen und ein starkes Δψ aufrechterhalten, um maximales ATP zu erzeugen, Informationen über die Leckigkeit der Mitochondrien liefert (wenn H⁺-Ionen ohne Verwendung der ATP-Synthase in die Matrix zurückkehren und daher Δψ abbauen), was letztendlich auf eine Dysfunktion der Mitochondrien hinweist. Darüber hinaus können Messungen des Zustands 4 auch zeigen, ob der ADP/ATP-Translokator, der neu gebildetes ATP aus der Matrix bewegt und gleichzeitig das ADP-Substrat einbringt, funktionsfähig ist und ob ein Leck von ADP und ATP über die Membranen auftritt. Die Zugabe von Oligomycin, das die ATP-Synthase hemmt, ist eine Kontrolle, um festzustellen, ob die Mitochondrien aufgrund einer tatsächlichen Funktionsstörung undicht sind. Während die Messung von Zustand 4, so dass das P/O-Verhältnis berechnet werden konnte, den Rahmen der Informationen sprengte, die wir zum Vergleich zwischen den drei mitochondrialen Probentypen suchten, handelt es sich um ein weiteres Stück Daten über die mitochondriale Funktion und könnte als Erweiterung dieses Protokolls durchgeführt werden. Schließlich ist es erwähnenswert, dass Mitochondrien aus Zellen in Kultur und aus verschiedenen Geweben einer Maus oder Ratte (z. B. Leber, Herz, Rückenmark) isoliert werden können. Anpassungen der MIB- und EB-Formulierungen sowie der Isolationsprotokolle können erforderlich sein 4,13,14,15,16. Darüber hinaus könnte dieser Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers mit ganzen, intakten Zellen durchgeführt werden. Daher ist die vorgestellte Methode nicht auf Eidechsen oder Lebermitochondrien beschränkt, so dass sie für eine breite Palette von experimentellen Modellen in vielen verschiedenen wissenschaftlichen Teildisziplinen geeignet ist.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well-Bodenplatten schwarz/optisch	Thermo Fisher	265301	Unbehandelte schwarze Wandplatten mit klarem Boden.
ADP	Sigma	A2754	Verdünnung 100 & Mikro; M Ware mit EB unmittelbar vor dem Gebrauch.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Stellen Sie 2 mg/ml Brühe in Wasser für den Proteinassay her.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	Stellen Sie sicher, dass das PBS ohne Mg2+ oder Ca2+ Ionen ist.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
L-Glutaminsäure	Sigma	G1251
L-Glutaminsäure Kaliumsalz	Sigma	S372226
L-Apfelsäure	Sigma	M8304
L-Apfelsäure-Monokaliumsalz	Sigma	49601
MitoXpress Sauerstoffverbrauchskit	Agilent	MX-200-4	Kit enthält Sondenmaterial und HS-Mineralöl.
MOPS	Sigma	M3183
Protien Assay Farbstoff (5x)	BioRad	500-0006	Jeder Proteinassay kann ersetzen.
R Version 3.3	R Core Development Team 2016
Thermomax Mikroplatten-Reader EnSpire Multi-Mode Platten-Reader und Software	PerkinElmer		Standard Fluoreszenzplatten-Reader
Trisma	base Sigma	T6066	Jede Version der Tris-Basis kann verwendet werden.