Das vorliegende Protokoll beschreibt Schritt-für-Schritt-Anweisungen für die Durchführung intrathekaler Injektionen bei neugeborenen Mäusen zur Geneditierung und Medikamentenabgabe.
Methodenartikel
Intrathekale Injektion von neugeborenen Mäusen zur Genomeditierung und Medikamentenverabreichung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die intrathekale Injektion ist ein häufig eingesetztes Verfahren sowohl in Kinder- als auch in Erwachsenenkliniken und dient als wirksames Mittel zur Verabreichung von Medikamenten und Behandlungen. Durch die direkte Abgabe von Medikamenten und Behandlungen in die Zerebrospinalflüssigkeit des Zentralnervensystems werden mit dieser Methode höhere lokalisierte Arzneimittelkonzentrationen erreicht und gleichzeitig systemische Nebenwirkungen im Vergleich zu anderen Wegen wie intravenösen, subkutanen oder intramuskulären Injektionen reduziert. Ihre Bedeutung geht über das klinische Umfeld hinaus, da die intrathekale Injektion eine wichtige Rolle in präklinischen Studien spielt, die sich auf die Behandlung neurogenetischer Störungen bei Nagetieren und anderen Großtieren, einschließlich nichtmenschlicher Primaten, konzentrieren. Trotz ihrer weit verbreiteten Anwendung stellt die intrathekale Injektion bei jungen, insbesondere neugeborenen Welpen, aufgrund ihrer geringen Größe und Zerbrechlichkeit erhebliche technische Herausforderungen dar. Die erfolgreiche und zuverlässige Verabreichung von intrathekalen Injektionen bei neugeborenen Mäusen erfordert akribische Liebe zum Detail und sorgfältige Berücksichtigung verschiedener Faktoren. Daher besteht ein entscheidender Bedarf an einem standardisierten Protokoll, das nicht nur Anweisungen enthält, sondern auch wichtige technische Überlegungen und gute Laborpraktiken hervorhebt, um die Verfahrenskonsistenz sowie die Sicherheit und das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten.
Um diesen ungedeckten Bedarf zu decken, präsentieren wir ein detailliertes und umfassendes Protokoll für die Durchführung intrathekaler Injektionen speziell bei neugeborenen Welpen am postnatalen Tag 1 (P1). Durch Befolgen der Schritt-für-Schritt-Anleitung können Forscher sicher intrathekale Injektionen bei neugeborenen Welpen durchführen, was die genaue Verabreichung von Medikamenten, Antisense-Oligos und Viren für Genersatz- oder Genom-Editing-basierte Behandlungen ermöglicht. Darüber hinaus wird die Bedeutung der Einhaltung guter Laborpraktiken betont, um das Wohlergehen der Tiere zu erhalten und zuverlässige Versuchsergebnisse zu gewährleisten. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit intrathekalen Injektionen bei neugeborenen Mäusen anzugehen und letztendlich Fortschritte auf dem Gebiet der neurogenetischen Forschung zu ermöglichen, die darauf abzielt, potenzielle therapeutische Interventionen zu entwickeln.
Einleitung
Die intrathekale (IT) Injektion ist ein gängiges klinisches Verfahren zur Verabreichung von Medikamenten, zur Entnahme von Liquor cerebrospinalis und zur Aufrechterhaltung des intrakraniellen Drucks sowohl bei pädiatrischen als auch bei erwachsenen Patienten in Kliniken 1,2. Die Verabreichung von Medikamenten durch intrathekale Injektion ist ein wirksamer Ansatz zur Erhöhung der Medikamentenkonzentrationen im Zentralnervensystem (ZNS) bei gleichzeitiger Minimierung der systemischen Exposition. Folglich erhöht diese Methode die therapeutische Wirksamkeit und reduziert Nebenwirkungen, insbesondere bei temperaturempfindlichen Medikamenten mit kurzer Halbwertszeit3.
In präklinischen Studien, in denen neue Medikamente und Behandlungen mit Nagetiermodellen getestet werden, ist es unerlässlich, eine zuverlässige Methode der Arzneimittelverabreichung anzuwenden, die eine höhere Präzision und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bietet 4,5. Für präklinische Studien, in denen neue Behandlungen für neurogenetische und neurologische Entwicklungsstörungen untersucht werden, ist eine frühzeitige Behandlung für erste Proof-of-Concept-Studien von entscheidender Bedeutung, da frühere Interventionen in der Regel zu günstigeren Ergebnissen führen 6,7,8.
Im Vergleich zu herkömmlichen intrazerebroventrikulären (ICV) Injektionen bergen IT-Injektionen deutlich geringere Risiken, da sie eine direkte Penetration durch die Großhirnrinde überflüssig machen. Dieser Vorteil reduziert die potenzielle Schädigung des regionalen kortikalen Gewebes und der umgebenden Nerven erheblich. Darüber hinaus ermöglichen IT-Injektionen eine mindestens fünffache Erhöhung des verabreichbaren Medikamentenvolumens durch eine einzige Injektion, was die Durchführbarkeit wiederholter Verabreichungen erheblich verbessert. Aufgrund der geringen Größe und Zerbrechlichkeit neugeborener Mäuse ist die Durchführung intrathekaler Injektionen bei neugeborenen Welpen jedoch technisch anspruchsvoll und erfordert spezielle Techniken, Ausrüstung und sorgfältige Handhabung.
Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung intrathekaler Injektionen bei P1-Neugeborenen. Die wichtigsten Überlegungen und guten Laborpraktiken werden hier betont, um die Konsistenz der Verabreichung sowie die Sicherheit und das Wohlbefinden der Tiere während des Eingriffs zu gewährleisten. Durch die Befolgung dieses Protokolls können Forscher Experimente mit Präzision und Reproduzierbarkeit durchführen und gleichzeitig potenzielle Risiken oder Beschwerden für die Tiere minimieren.
Protokoll
Die beschriebenen Verfahren und Protokolle entsprachen den Richtlinien des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Darüber hinaus wurden die Verfahren vom Animal Care and Use Committee der Yale University School of Medicine genehmigt. Für die vorgestellte Studie wurden neugeborene männliche und weibliche Wildtyp-Mäuse (WT) C57BL/6J verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Vorbereitung des Arbeitsbereichs
- Bereiten Sie zuerst die folgenden Gegenstände vor: nasses Eis für die Kryoanästhesie, einen leeren Käfig, um die Jungtiere vom Muttertier zu trennen, ein Präpariermikroskop, eine Lichtquelle, eine saubere Oberfläche zum Platzieren des Tieres während der Injektion, Wattestäbchen, ein Heizkissen, eine 25/10 μl-Spritze und eine 34 G/ 0,375"/ 12 DEG-Nadel (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Kryo-Anästhesie für Mäusewelpen mit Nasseis ist ein optionaler Schritt, der die Handhabung erleichtern, die Bewegung der Welpen reduzieren und mögliche Tierbeschwerden minimieren soll. Dieser Kryoanästhesieschritt kann auch den Vorteil haben, den intrakraniellen Druck zu senken und volumenbedingte Komplikationen zu reduzieren 9,10. - Bringen Sie die Welpen in einen separaten Käfig weg vom Muttertier, während Sie sie anfassen.
- Wiegen Sie jeden Welpen und dokumentieren Sie sein Gewicht.
- Wischen Sie die Rückseite der Maus mit Gaze und Ethanol ab. Bestätigen Sie den Zwischenwirbelraum oder mindestens die Mittellinie des Wirbelkanals (die bei P1-Welpen rot erscheinen sollte) mit dem Präpariermikroskop (Ergänzendes Video 1).
2. Ablauf der Injektion
- Um einen einzelnen Welpen zu betäuben, legen Sie ihn vorsichtig für 3-5 Minuten auf eine wasserdichte Barriere wie eine Latexhülle oder Aluminiumfolie auf ein Eisbad. Es ist wichtig, das Tier nicht über einen längeren Zeitraum auf dem Eis zu lassen, da dies potenzielle Risiken für hypothermiebedingte Komplikationen wie Kammerflimmern, Gewebehypoxie und metabolische Azidose bergen könnte.
HINWEIS: Die Dauer von 3-5 Minuten kann von Fall zu Fall variieren. Beurteilen Sie die Anzeichen einer Anästhesie, wie z. B. die Unempfindlichkeit auf ein Zehenklemmen, um die angemessene Dauer zu bestimmen. - Während sich das Tier auf dem Eis befindet, laden Sie die Spritze mit 10 μl der Arzneimittelformulierung, des Viruspräparats oder der künstlichen Rückenmarksflüssigkeit usw.
HINWEIS: Ziehen Sie während der Lernphase die Möglichkeit in Betracht, die gleiche Menge gemischten 1% Fast Green-Farbstoffs mit den Liefermaterialien zu injizieren (siehe Materialtabelle). Dies kann bei der Visualisierung des Injektionsprozesses helfen und beim Erlernen und Verfeinern der Technik helfen. Welpen, denen Fast Green Dye oder ähnliche Materialien injiziert wurden, sollten kurz nach der Injektion gemäß dem genehmigten Protokoll eingeschläfert werden, da diese Materialien bei Tieren zu Entzündungsreaktionen oder anderen Nebenwirkungen führen können. - Sobald das Tier vollständig betäubt ist, was durch reduzierte oder fehlende Körperbewegungen bestätigt wird, positionieren Sie die Welpen vorsichtig unter dem Mikroskop.
- Mit dem linken Zeigefinger und Daumen tasten Sie vorsichtig den Zwischenwirbelraum entlang der Mittellinie ab, der sich zwischen den beidseitigen Beckengürteln befindet (Ergänzungsvideo 1). Drehen Sie die Basis des Schwanzes vorsichtig leicht, um die Mittellinie der Wirbelsäule zu identifizieren.
- Stellen Sie die Nadelfase vor der Injektion auf den Kopf des Tieres ein.
- Führen Sie die Nadel vorsichtig ein und kippen Sie sie an der Stelle, an der sich die Vertiefung schneidet, leicht in einem Winkel von 70°-80°, wobei Sie sicherstellen, dass die Spritze mit der zentralen Sagittalebene ausgerichtet bleibt. Wenn die Nadel den Knochen berührt, verringern Sie den Winkel allmählich auf ca. 30° und schieben Sie die Nadel dann etwa 2 mm in den Zwischenwirbelraum vor.
HINWEIS: Die Fähigkeit der Nadel, den gesamten Körper leicht anzuheben, ist ein Zeichen für einen erfolgreichen Eintritt in den intraduralen Raum. - Injizieren Sie langsam bis zu 10 μl Volumen innerhalb von 50-60 s. Lassen Sie die Nadel nach Abschluss der Lieferung 10-20 s lang an Ort und Stelle. Ziehen Sie die Nadel mit einer sanften Drehung zurück, um ein Auslaufen zu vermeiden.
HINWEIS: Das Kleinhirn wird grün, bevor die Nadel zurückgezogen wird. Außerdem ist der langsame Druck entscheidend, um einen Anstieg des intrakraniellen Drucks im Zusammenhang mit der Entbindung zu verhindern und mögliche Komplikationen zu minimieren. Basierend auf unserer Erfahrung mit Injektionen bei mehr als 500 Welpen ist die Abgabe eines Volumens von 10 μl über 50-60 s optimal.
3. Nach der Injektion
- Tragen Sie ein Wattestäbchen auf die Injektionsstelle auf, wenn Blut ausläuft oder Blut vorhanden ist.
HINWEIS: In den meisten Fällen sollte es keine geben. Aus unserer Erfahrung sind Welpen, die mit Spuren von Leckagen oder Blut behandelt wurden, immer noch verwendbar, aber bei der Datenanalyse kann die Berücksichtigung einer reduzierten Dosis von Medikamenten oder Behandlungen erforderlich sein. - Legen Sie den Welpen auf ein Heizkissen und warten Sie 10-15 Minuten, bis sich die Welpen vollständig erholt und wieder aufgewärmt haben. Beobachten Sie die Welpen sorgfältig, um sicherzustellen, dass sie wachsam sind und sich aktiv bewegen, bevor Sie sie in ihren Heimatkäfig zurückbringen. Eine angemessene Erholung einer Maus wird durch die Wiederherstellung der rosa Hautfarbe, erhöhte spontane Körperbewegungen und reaktionsschnelle Reaktionen auf Berührungen angezeigt.
- Setzen Sie den Welpen zurück in den Heimkäfig und stellen Sie sicher, dass der Welpe richtig mit Einstreu, Nestchen oder beidem bedeckt ist. Dadurch wird sichergestellt, dass der Welpe die notwendige mütterliche Fürsorge von der Mutter erhält.
- Beurteilen Sie das allgemeine Erscheinungsbild und die Aktivität täglich für mindestens 3 Tage nach der Injektion. Ein krankes Auftreten und eine verminderte Aktivität können die Möglichkeit einer Infektion, behandlungsbedingter Nebenwirkungen oder anderer Komplikationen usw. erhöhen. Wenden Sie sich bei Bedarf an einen Tierarzt.
Ergebnisse
Eine erfolgreiche intrathekale Injektion führte sofort zu einer weit verbreiteten Verteilung der verabreichten Lösung, obwohl die tatsächliche Zellpenetration von der Art der verabreichten Medikamente und Materialien abhing. In dieser Studie verwendeten wir Fast Green, um die unmittelbaren Ergebnisse nach intrathekaler Injektion (IT) bei Wildtyp-Neugeborenen zu visualisieren (Abbildung 1A-K) und verglichen sie mit der konventionellen intrazerebroventrikulären (ICV) Injektion (Abbildung 1L-N). Die Langzeitergebnisse (10 Tage nach der Injektion) wurden auch mit YFP-Reportermäusen untersucht, die durch die Verabreichung von CRISPR/Cas9-basierter Geneditierung aktiviert wurden7. Die YFP-Expression wurde im Vergleich zu nicht CRISPR/Cas9-behandelten Mäusen im gesamten Mäusegehirn weit verbreitet beobachtet (Abbildung 2). Die Expression von YFP wurde in der Mehrzahl der Zellen unter höherer Vergrößerung beobachtet. Bei mehr als 500 neugeborenen Welpen wurden Injektionen durchgeführt, und über 98 % der injizierten Welpen überlebten den Eingriff. Es wurden keine schädlichen Auswirkungen auf das langfristige Überleben und die Gesundheit der behandelten Welpen beobachtet (Ergänzende Abbildung 1).
Abbildung 1: Zeitliche und räumliche Verteilung des Fast Green-Farbstoffs in Mäusegehirnen. (A) Grobbeobachtung von Mäusen, Vergleich von injizierten und nicht injizierten Mäusen 5 Minuten nach intrathekaler Injektion. (B) Visualisierung der Verteilung des Farbstoffs Fast Green im Gehirn der Maus vor der Sektion. (C-E) Verteilung des Farbstoffs in präparierten Gehirnen 5 Minuten nach intrathekaler Verabreichung. (F-H) Verteilung des Farbstoffs in präparierten Gehirnen 30 Minuten nach intrathekaler Verabreichung. (I-K) Verteilung des Farbstoffs in präparierten Gehirnen 60 Minuten nach intrathekaler Verabreichung. (L-N) Zum Vergleich: die Verteilung des Farbstoffs in präparierten Gehirnen 40 min nach intrazerebroventrikulärer Verabreichung. Maßstabsleiste: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Langzeiteffekte der intrathekal verabreichten CRISPR/Cas9-Geneditierung. Weit verbreitete Expression des YFP-Reporters im Gehirn von Mäusen nach intrathekaler Injektion von CRISPR/Cas9-Geneditierung: Kleinhirn (A-F), hinterer Kortex (D-F) und präfrontaler Kortex (G-I). Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Überlebenskurve von Mäusen mit Angelman-Syndrom nach intrathekaler CRISPR-Geneditierung. Überlebenskurve, die die Ergebnisse von Mäusen mit Angelman-Syndrom zeigt, die eine CRISPR-Geneditierung durch intrathekale Verabreichung erhalten, im Vergleich zu unbehandelten Mäusen und Wildtyp-Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Video 1: Intrathekales Injektionsverfahren bei neugeborenen Mäusen. Video, das den Prozess der Verabreichung intrathekaler Injektionen an neugeborene Mäuse demonstriert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Diskussion
Beschrieben wird ein schrittweises Verfahren zur intrathekalen Injektion bei neugeborenen Mäusen (P1), das zu einer weit verbreiteten Medikamentenverteilung in ihren Gehirnen führt. Im Vergleich zur üblichen intrazerebroventrikulären Injektionsmethode zur Verabreichung von Medikamenten an neugeborene Mäuse, bei der die Großhirnrindedurchstochen wird 11, vermeidet die intrathekale Injektion eine direkte Verletzung des neonatalen Mäusegehirns durch Nadelpenetration. Aufgrund der minimalen Invasivität kann die intrathekale Injektion bei Bedarf wiederholt durchgeführt werden, wodurch wiederholte Verabreichungen beim Menschen in einem klinischen Umfeld simuliertwerden 12.
Veränderungen des Hirndrucks sind häufig mit intrathekaler Injektion verbunden13, was aufgrund von Verhaltensänderungen bei den Welpen möglicherweise zur Abstoßung und Nahrungsverweigerung des Muttertiers führt. Akute Verhaltensänderungen oder ein verringertes Überleben bei injizierten Welpen wurden jedoch nicht beobachtet. Ebenso wurden ungewöhnliche oder abnormale Verhaltensweisen im Zusammenhang mit intrathekalen Injektionen bei Erwachsenen nicht bemerkt (Daten nicht gezeigt).
Mehrere technische Tipps haben möglicherweise zum Erfolg beigetragen und sind es wert, hervorgehoben zu werden. Die langsamere Einspritzrate ist wahrscheinlich ein wichtiger Faktor. Darüber hinaus kann die Kryoanästhesie den Hirndruck vor der Injektion senken, den Rückfluss während der intrathekalen Injektion minimieren und andere Komplikationen reduzieren. Schließlich kann sich auch die Präzision der Injektionsstelle auf die Erfolgsrate auswirken.
Um die beste Wirksamkeit durch intrathekale Verabreichung zu erzielen, ist es wichtig, den Eingriff so schnell wie möglich nach der Geburt der Welpen durchzuführen. Medikamente und andere Substanzen, die durch intrathekale Injektion verabreicht werden, gelangen in den intrathekalen Raum, d. h. in den Raum zwischen den Arachnoidal- und Pia-Mater-Schichten der Hirnhäute, die das Gehirn und das Rückenmark umgeben. Daher passieren die durch intrathekale Injektion verabreichten Medikamente diese Schichten der Hirnhäute12. Bei Nagetieren bestehen die Hirnhäute wie beim Menschen aus drei Schichten: der Dura mater, der Arachnoidea mater und der Pia mater14. Diese Membranen bilden sich während der Embryonalentwicklung und sind am postnatalen Tag 2 voll ausgereift (P2)15. Daher wird empfohlen, ein schnelles Genotypisierungsprotokoll zu verwenden, um die Welpen innerhalb weniger Stunden Versuchsgruppen zuzuordnen, insbesondere für Experimente mit Tiergenotypen, wie z. B. Gen-Editing-Experimente. Je früher die Welpen injiziert werden, desto besser ist das Ergebnis. Die Injektionen werden in der Regel innerhalb von 3 Stunden nach der Geburt abgeschlossen. Dieses Zeitfenster ermöglicht es den injizierten Medikamenten, den Fluss der Zerebrospinalflüssigkeit in das Hirnparenchym zu verfolgen, während die Ependymauskleidung noch unreif ist und weniger von der Größe der Arzneimittelpartikel betroffen ist. Es ist erwähnenswert, dass es Entwicklungsunterschiede zwischen Menschen und Mäusen gibt. P1-Neugeborene entsprechen dem späten Gestationsstadium der menschlichen Gehirnentwicklung16. Ergebnisse aus Experimenten an P1-Neugeborenenmäusen dienen als wertvoller Wirksamkeitsnachweis, aber Vorsicht ist geboten, wenn diese Ergebnisse in translationalen Studiendesigns auf den Menschen extrapoliert werden.
Diese Technik wird durch ein begrenztes Zeitfenster für die Verabreichung und den Bedarf an hochqualifizierten Experimentatoren herausgefordert. Eine hohe Sterblichkeit kann mit dem Verfahren verbunden sein, wenn es dem Versuchsleiter an Erfahrung mangelt. Der enge Zeitrahmen erfordert jedoch ein erhöhtes Maß an Präzision und Wiederholbarkeit innerhalb und zwischen den Studien. Darüber hinaus können mit angemessener Übung die Kompetenz und Erfolgsquote dieser Methode erheblich verbessert werden.
Wenn die Injektionen korrekt durchgeführt werden, wird das Überleben der injizierten Welpen in erster Linie durch die mütterliche Versorgung beeinflusst. Es wird empfohlen, Pflegeweibchen für Ihre Ziele vorzubereiten. Wenn die anvisierten Welpen am Nachmittag des Injektionstages keinen Milchfleck auf dem Bauch haben, sollten sie sofort zur Pflegehündin gebracht werden. Weibliche Mäuse erkennen ihre Babys am Geruch. Daher ist es wichtig, während und nach dem Eingriff zu vermeiden, dass ungewohnte Gerüche von Experimentatoren oder nicht verwandten Muttertieren auf die Welpen übertragen werden. Die Notwendigkeit des Einsatzes von Pflegeweibchen sollte jedoch für einzelne Experimente bewertet werden. Es wird auch empfohlen, den Eingriff in einem gut belüfteten Raum, idealerweise in einem biologischen Abzug, durchzuführen. Das Mischen der Welpen mit der Einstreu und den Exkrementen des Muttertiers ist ebenfalls hilfreich. Nach der ersten Überprüfung nach dem Eingriff wird empfohlen, die Störung des Damms für mindestens 3 Tage zu minimieren, um Stress zu reduzieren. Wie bei jedem chirurgischen Eingriff sollte das Risiko einer Infektion nach dem Eingriff berücksichtigt werden. Daher sollte während der Injektion die strikte Einhaltung der guten Laborpraxis für sterile Verfahren eingehalten werden. Es ist zu beachten, dass der intrathekale Druck höher ist als die äußere Umgebung und einen natürlichen Schutz vor Infektionen bietet. Die Erfahrung zeigt, dass die Rate der Infektionen nach der Injektion selten ist. Es wird jedoch empfohlen, das allgemeine Erscheinungsbild und die Aktivität von Welpen mindestens 3 Tage nach der Injektion täglich zu überwachen, um Anzeichen und Symptome einer Infektion oder anderer Komplikationen zu erkennen. In besonderen Fällen kann eine Konsultation des Veterinärdienstes gerechtfertigt sein, anstatt Welpen mit erheblichen Komplikationen einzuschläfern.
Offenlegungen
YHJ ist Mitbegründer von Couragene, aber kein Interessenkonflikt für dieses Projekt.
Danksagungen
XNL wird von der Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoctoral Fellowship unterstützt. YHJ wird auch von FAST und NIH Grant R01HD110195 und R01MH117289 unterstützt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J Mäuse | Das Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digitalmikroskop | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heizkissen | RWD | 69020 | |
| Nadeln | Hamilton | 6PK (34/0.375"/4/12DEG)S | |
| Spritze | Hamilton | 1702RN | |
| Spritzenfilter | Sigma | SLGVM33RS |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
