Eine optimierte Reverse-Poly-Transfektionstechnik auf Basis embryonaler Stammzellen der Maus zur schnellen Erforschung von Nukleinsäureverhältnissen

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur umgekehrten Polytransfektion von embryonalen Stammzellen der Maus während der Kultur mit 2i- und LIF-Medien. Diese Methode bietet eine höhere Durchführbarkeit und Effizienz als herkömmliche Vorwärtstransfektionsprotokolle und ermöglicht gleichzeitig eine Ein-Topf-Optimierung der Plasmidverhältnisse.

Abstract

Aufgrund ihrer relativen Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit ist die transiente Transfektion von Säugetierzelllinien mit Nukleinsäuren zu einer tragenden Säule in der biomedizinischen Forschung geworden. Während die meisten weit verbreiteten Zelllinien robuste Protokolle für die Transfektion in adhärenten zweidimensionalen Kulturen haben, lassen sich diese Protokolle oft nicht gut auf weniger untersuchte Linien oder solche mit atypischen, schwer zu transfizierenden Morphologien übertragen. Unter Verwendung von pluripotenten Stammzellen der Maus, die in 2i/LIF-Medien, einem weit verbreiteten Kulturmodell für die regenerative Medizin, gezüchtet wurden, skizziert diese Methode ein optimiertes, schnelles umgekehrtes Transfektionsprotokoll, das eine höhere Transfektionseffizienz erreichen kann. Unter Nutzung dieses Protokolls wird eine Polytransfektion mit drei Plasmiden durchgeführt, wobei die überdurchschnittlich hohe Effizienz bei der Plasmidabgabe genutzt wird, um einen erweiterten Bereich der Plasmidstöchiometrie zu untersuchen. Dieses umgekehrte Polytransfektionsprotokoll ermöglicht eine experimentelle Eintopfmethode, die es den Anwendern ermöglicht, die Plasmidverhältnisse in einem einzigen Well zu optimieren, anstatt über mehrere Co-Transfektionen hinweg. Durch die schnelle Erforschung der Auswirkungen der DNA-Stöchiometrie auf die Gesamtfunktion der gelieferten genetischen Schaltkreise minimiert dieses Protokoll den Zeit- und Kostenaufwand für die Transfektion embryonaler Stammzellen.

Introduction

Die Verabreichung von DNA und RNA in Säugetierzellen dient als Kernpfeiler der biomedizinischen Forschung¹. Eine gängige Methode zur Einführung exogener Nukleinsäuren (NA) in Säugetierzellen ist die transiente Transfektion ^2,3. Diese Technik beruht auf dem Mischen von NA mit kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenzien, die in der Lage sind, sie in die Empfängerzellen zu bringen. Typischerweise wird NA durch Vorwärtstransfektion abgegeben, bei der Zellen, die an einer zweidimensionalen Oberfläche haften, den Transfektionskomplex erhalten. Während die Vorwärtstr....

Protocol

1. Vorbereitung von Reagenzien für die mPSC-Kultur

1. N2-Ergänzung vorbereiten.
   1. Unter nicht sterilen Bedingungen werden die folgenden Stammlösungen (Schritt 1.1.1.1) in einem chemischen Sicherheitsabzug hergestellt. Geben Sie das feste Pulver jeder Chemikalie in ein vorgewogenes konisches 50-ml-Röhrchen. Wiegen Sie jedes Röhrchen nach Zugabe des Pulvers und fügen Sie eine angemessene Menge Lösungsmittel hinzu, um die folgenden Konzentrationen zu erreichen. Bereiten Sie für einen Medienstapel die angegebene Mindestmenge vor.
      HINWEIS: Die folgenden Reagenzien sind gefährlich und sollten in Übereinstimmung mit den örtlichen Chemikaliensi....

Results

Sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtstransfektionen beruhen auf der Wechselwirkung zwischen der Zellmembran und den eingehenden Transfektionsreagenz-DNA-Komplexen, die die Abgabe von NA an die Empfängerzellen ermöglichen. Wo sich diese Techniken unterscheiden, ist der Zustand der Zelle bei der Abgabe - während die DNA in der Regel bei der traditionellen Vorwärtstransfektion an adhärente Zellmonoschichten abgegeben wird, beruht die umgekehrte Transfektion stattdessen darauf, dass der Reagenz-DNA-Komplex in einer Einzelzells.......

Discussion

Ein Hauptgrund für die weit verbreitete Einführung von Transfektionsprotokollen ist ihre Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit; Diese Protokolle erfordern jedoch eine Optimierung in experimentellen Kontexten. Nicht erwähnt sind die Standardtests, die erforderlich sind, wenn zum ersten Mal versucht wird, eine neue Zelllinie zu transfizieren. Erstens ist die Wahl des Transfektionsreagenzes entscheidend, da kommerziell erhältliche Reagenzien keine Einheitsgröße sind und in der Effizienz der NA-Verabreichungsfähigkeit je nac.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 Ergänzung	ThermoFisher Wissenschaftlich
Beta-Mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific
BSA-Fraktion V (7,5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Standardisierungskügelchen für Durchflusszytometrie	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatine	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX Ergänzung	ThermoFisher Wissenschaftlich
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamin 2000	Invitrogen	11668-019	Transfektionsreagenz
Neurobasale Medien	ThermoFisher Scientific
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesteron	MilliporeSigma	P8783	Chemische Gefahr - beachten Sie die örtlichen Sicherheitsrichtlinien, stellen Sie sicher, dass die richtige PSA getragen wird, und arbeiten Sie mit der festen Pulverform nur in einem chemischen Abzug
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemische Gefahr - beachten Sie die örtlichen Sicherheitsrichtlinien, stellen Sie sicher, dass die richtige PSA getragen wird, und arbeiten Sie mit der festen Pulverform nur in einem chemischen Abzug.
Rekombinante mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Natriumselenit	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemische Gefahr - beachten Sie die örtlichen Sicherheitsrichtlinien, stellen Sie sicher, dass die richtige PSA getragen wird, und arbeiten Sie mit der festen Pulverform nur in einem chemischen Abzug
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientsp;