Die Nahrungsquelle für Caenorhabditis elegans im Labor sind lebende Escherichia coli. Da Bakterien metabolisch aktiv sind, stellen sie eine Störvariable in metabolischen und medikamentösen Studien an C. elegans dar. Ein detailliertes Protokoll zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien mit Paraformaldehyd ist hier beschrieben.
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Methodenartikel
Methodik zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien für die Caenorhabditis elegans-Forschung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Caenorhabditis elegans ist ein gängiger Modellorganismus für die Erforschung von Genetik, Entwicklung, Alterung, Stoffwechsel und Verhalten. Da C. elegans sich von lebenden Bakterien ernährt, kann die Stoffwechselaktivität ihrer Nahrungsquelle Experimente verwirren, die nach den direkten Auswirkungen verschiedener Eingriffe auf den Wurm suchen. Um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels zu vermeiden, haben die Forscher von C. elegans mehrere Methoden zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien eingesetzt, darunter ultraviolette (UV)-Bestrahlung, Hitzeabtötung und Antibiotika. Die UV-Behandlung hat einen relativ geringen Durchsatz und kann nicht in der Flüssigkultur eingesetzt werden, da jede Platte auf eine erfolgreiche bakterielle Abtötung untersucht werden muss. Eine zweite Behandlungsmethode, die Hitzeabtötung, wirkt sich negativ auf die Textur und die Nährstoffqualität der Bakterien aus, was zum Entwicklungsstillstand von C. elegans führt. Schließlich kann die Behandlung mit Antibiotika die Physiologie von C. elegans direkt verändern und das Bakterienwachstum verhindern. Dieses Manuskript beschreibt eine alternative Methode zur metabolischen Inaktivierung von Bakterien mittels Paraformaldehyd (PFA). Bei der PFA-Behandlung werden Proteine in Bakterienzellen vernetzt, um die Stoffwechselaktivität zu verhindern und gleichzeitig die Zellstruktur und den Nährstoffgehalt zu erhalten. Diese Methode hat einen hohen Durchsatz und kann in Flüssigkulturen oder festen Platten verwendet werden, da das Testen einer Platte mit PFA-behandelten Bakterien auf Wachstum die gesamte Charge validiert. Die metabolische Inaktivierung durch PFA-Behandlung kann verwendet werden, um die verwirrenden Auswirkungen des bakteriellen Stoffwechsels auf Studien zur Arzneimittel- oder Metaboliten-Supplementierung, Stressresistenz, Metabolomik und Verhalten bei C. elegans zu eliminieren.
Einleitung
Caenorhabditis elegans wurde ursprünglich 1965 als Modellorganismusvorgeschlagen 1 und hat sich seitdem in Studien zu Genetik, Entwicklung, Verhalten, Altern und Stoffwechsel 2durchgesetzt. Aufgrund ihrer großen Brutgröße und transparenten Kutikula eignet sich C. elegans besonders gut für das Hochdurchsatz-Screening mit fluoreszierenden Reportern3. Ihr kurzer Lebenszyklus, ihre hermaphroditische Vermehrung und ihre genetische Homologie mit dem Menschen machen C. elegans auch zu einem wertvollen Modellsystem für Studien zur Entwicklung4 und zur Alt....
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Protokoll
1. Bakterien-Inokulation
- Bereiten Sie Luria-Brühe (LB) zu, indem Sie 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid (NaCl) in 950 ml destilliertem Wasser auflösen.
- Stellen Sie den pH-Wert des LB auf 7,0 ein, indem Sie 5 M Natriumhydroxid (NaOH) hinzufügen. Dies sollte nur etwa 0,2 ml NaOH erfordern.
- Autoklavieren Sie das pH-angepasste LB-Medium in einem Flüssigkeitszyklus für 45 Minuten bei 15 psi. Lassen Sie die Lösung abkühlen und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
- Eine einzelne Bakterienkolonie wird in 100 ml LB in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht in ei....
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Ergebnisse
Ein detaillierter Workflow des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Es wurde eine Hochdurchsatzmethode entwickelt und optimiert, um die bakterielle Replikation (Abbildung 2A) und den Stoffwechsel (Abbildung 2B) für Stoffwechsel- und Wirkstoffstudien in der C. elegans-Forschung unter Verwendung von Paraformaldehyd16 konsistent zu inaktivieren. Ziel war es, die niedrigste PFA-Konzentration und di.......
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Diskussion
Vorteile der PFA-Abtötung im Vergleich zu anderen bakterienabtötenden Methoden
Die PFA-Behandlung ist eine Hochdurchsatzmethode, um den bakteriellen Stoffwechsel zu verhindern und gleichzeitig eine nahrhafte Nahrungsquelle für C. elegans zu erhalten. Die Abtötung von Bakterien durch PFA-Behandlung hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden. Im Gegensatz zur UV-Behandlung, bei der jede Platte auf eine erfolgreiche Abtötung getestet werden muss, kann eine einzelne Platte aus einer Charge P.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von NIH R21AG059117 und den Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research an der University of Michigan finanziert. SB wurde von T32AG000114 finanziert. ESK wurde von der NSF DGE 1841052 finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alufolie | Klammern | 2549291 | |
| Bunsenbrenner | VWR | 470121-700 | |
| Zelldichtemessgerät | Denville | 80-3000-45 | |
| Zentrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemischer Abzug | Labcono | 975050411384RG | |
| Kegelröhrchen (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Küvetten | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer-Kolben | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 | |
| Impföse | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Sammelflasche für flüssige Abfälle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesiumsulfat (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyd (32%) | Elektronenmikroskopie Wissenschaften | 15714-S | Paraformaldehyd – methanolfreie Lösung |
| Pipettierer | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Kunststoffschalen (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extrazelluläres Flussmittel-Assay-Kit und Zellkultur-Mikroplatte | Agilent | 101085-004 | |
| Serologische Pipetten (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker-Inkubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Natriumhydroxid (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Natriumphosphat Dibasisches wasserfreies (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Sammelschaufel für feste Abfälle | M& M Branchen | 5,0 Gallonen M1 Traditioneller Eimer | |
| Trypton | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Wägewaage | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Hefeextrakt | Genesee Scientific | 20-255 |
Referenzen
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O.
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Nachdrucke und Genehmigungen
