Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden

Zusammenfassung

Hepatozyten, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, können durch Zellsortierung aufgereinigt werden, wobei eine Kombination aus mitochondrialer und aktivierter Leukozytenzelladhäsionsmolekülfärbung (ALCAM, auch bekannt als CD166) verwendet wird.

Zusammenfassung

Humane embryonale Stammzellen (ES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) haben aufgrund ihrer unbegrenzten Proliferation und pluripotenten Eigenschaften potenzielle Anwendungen in der zellbasierten regenerativen Medizin zur Behandlung schwer erkrankter Organe. Die Differenzierung von humanen ES/iPS-Zellen in 100 % reine Zielzelltypen ist jedoch aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber der Umwelt eine Herausforderung. Die Tumorgenese nach einer Transplantation wird durch kontaminierte, proliferierende und undifferenzierte Zellen verursacht, so dass die Hochreinigungstechnologie für die sichere Realisierung der regenerativen Medizin unerlässlich ist. Um das Risiko der Tumorentstehung zu verringern, wurde eine Hochreinigungstechnologie für aus humanen iPS-Zellen gewonnene Hepatozyten entwickelt. Das Verfahren verwendet FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) unter Verwendung einer Kombination aus hohem mitochondrialem Gehalt und dem Zelloberflächenmarker ALCAM (aktiviertes Leukozytenzelladhäsionsmolekül) ohne genetische Veränderung. 97% ± 0,38% (n = 5) der gereinigten Hepatozyten mit dieser Methode zeigten eine Albuminproteinexpression. In diesem Artikel sollen detaillierte Verfahren für diese Methode vorgestellt werden, wie sie auf die aktuellste zweidimensionale Differenzierungsmethode für humane iPS-Zellen in Hepatozyten angewendet wird.

Einleitung

Embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen (ES bzw. iPS) gelten als vielversprechende Zellquellen für regenerative Therapien. Die Effizienz der Differenzierung dieser Zellen in spezifische Zielzelltypen kann jedoch variieren, selbst wenn die gleiche Zelllinie, das gleiche Protokoll und der gleiche Experimentator verwendet^werden 1,2,3,4. Diese Variabilität kann auf die hohe Empfindlichkeit menschlicher ES/iPS-Zellen gegenüber ihrer Umgebung zurückgeführt werden. Daher ist es derzeit schwierig, konsistent reine Zielzellen zu gewinnen. Um eine hochsichere regenerative Medizin zu erreichen, ist es von entscheidender Bedeutung, proliferative Zellen und undifferenzierte Stammzellen in therapeutischen Zellen zu eliminieren, und eine fortschrittliche Reinigungstechnologie für Zielzellen ist unerlässlich ^5,6,7.

Ein Zellsortierer ist ein Gerät, das einzelne Zellen sofort analysiert und lebende Zellen von Interesse basierend auf den Fluoreszenzsignalstärken sortiert und damit eine vielversprechende Lösung bietet. Dies kann durch die Antikörperfärbung von zelltypspezifischen Oberflächenmarkern oder durch die Verwendung zelltypspezifischer Reportergenexpressionen erreicht werden. Unter Verwendung dieser Technik gibt es mehrere Berichte über Methoden zur Reinigung von aus pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten ^8,9,10 und Hepatozyten^11,12. Hattori et al. entwickelten ein innovatives mitochondriales Aufreinigungsverfahren unter Verwendung eines Zellsortierers¹³. Unter Ausnutzung der Tatsache, dass Kardiomyozyten durch mitochondriale Aktivität einen hohen Energiebedarf haben, kann die Färbung der Zellen mit dem lebenden Mitochondrien-indikativen Farbstoff TMRM (Tetramethylrhodaminmethylester) zur Markierung und hochreinen Kardiomyozyten mittels FACS aus humanen ES-Zell-abgeleiteten Embryoidkörpern mit verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Das Fehlen von Tumorigenität wurde durch Teratombildungsassays mit den gereinigten Kardiomyozyten bestätigt. Darüber hinaus entdeckten Yamashita et al. unerwartet eine Methode zur Reinigung von Hepatozyten aus humanen ES-Zell-abgeleiteten Embryoidkörpern durch Isolierung von Fraktionen mit hoher mitochondrialer Aktivität und ALCAM-positiver Expression¹⁴. Die Begründung für diese Methode ist, dass Hepatozyten aufgrund ihres hohen Verbrauchs an ATP für den Nährstoffstoffwechsel und die Entgiftung auch eine relativ hohe Anzahl von Mitochondrien aufweisen¹⁵, und Hepatozyten exprimieren ALCAM, ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, das eine Rolle bei der Zelladhäsion und -migration spielt¹⁶.

Frühere hochaufreinigende Methoden für aus pluripotenten Stammzellen gewonnene Hepatozyten erforderten genetische Modifikationen, und nicht-genetische Aufreinigungsmethoden wiesen eine geringe Effizienz auf¹⁷. Die mitochondriale nicht-genetische Methode zeichnet sich dadurch aus, dass sie eine hohe Reinheit erreicht. Wenn hepatische Vorläuferzellen benötigt werden, können CD133- und CD13- oder Dlk1-basierte Methoden^18,19 gewählt werden. Obwohl die Genauigkeit der Genom-Editing-Technologie fortgeschritten ist, kann das potenzielle Risiko unvorhergesehener genomischer Veränderungen (z. B. Karzinogenese) nicht vollständig ausgeschlossen werden. Methoden, die auf mitochondrialer Aktivität basieren, ohne genetische Veränderungen zu beinhalten, können frei von solchen Risiken sein.

Als Ergebnis der Untersuchung verschiedener mitochondrialer Indikatoren in neonatalen Kardiomyozyten von Ratten wurde beobachtet, dass TMRM innerhalb von 24 Stunden vollständig verschwand, während andere Farbstoffe mindestens 5 Tage lang blieben¹³. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass TMRM und JC-1 die Zellviabilität nicht beeinflussten, wenn sie mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet wurden, während andere Farbstoffe unterschiedliche Auswirkungen auf die Zellviabilität zeigten¹³. TMRM weist eine höhere Sicherheit auf.

Bisher wurden mehrere zweidimensionale (2D) Differenzierungsmethoden entwickelt, die im Vergleich zur dreidimensionalen (3D) Embryoidkörperbildung effizientere Ansätze zur Induktion der Differenzierung darstellen. Dies liegt daran, dass differenzierungsinduzierende Verbindungen oder Zytokine den Zellen einheitlich auf einer 2D-Ebene und nicht in einem 3D-Raum verabreicht werden können. In dieser Studie wurde die zuvor beschriebene Methode²⁰ modifiziert, um die Differenzierung in humane iPS-Zell-abgeleitete Hepatozyten zu induzieren. Im Folgenden werden die Verfahren zur zeitgemäßen 2D-Differenzierung und -Reinigung von Hepatozyten, die aus humanen iPS-Zellen gewonnen werden, detailliert beschrieben.

Protokoll

In dieser Studie wurden kommerziell hergestellte humane iPS-Zellen (Stamm 253G1) verwendet (siehe Materialtabelle).

1. Erhaltung humaner iPS-Zellen

1. Humane iPS-Zellen werden unter feederfreien Bedingungen im AK02-Medium auf Kulturschalen aufbewahrt, die mit 0,25 μg/cm² iMatrix-511 beschichtet sind (siehe Materialtabelle).

2. Leberdifferenzierung von humanen iPS-Zellen in 2D-Kulturen

HINWEIS: In Abbildung 1A finden Sie den Tagesablauf der Leberdifferenzierung. Verwenden Sie während des gesamten Prozesses 6-Well-Kulturplatten und geben Sie 2 ml des dafür vorgesehenen Wasch- oder Kulturmediums in jede Vertiefung. Halten Sie den Zellkulturzustand bei 100 % Luftfeuchtigkeit, 5 % CO₂ und 20 % O₂ bei 37 °C aufrecht.

1. Jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml Basalmembranmatrix (verdünnt 1/25 in PBS ()) beschichten und 1 h bei 37 °C inkubieren.
2. Humane iPS-Zellen werden mit einer Dichte von 20.000-30.000 Zellen/cm² unter Verwendung von AK02N-Medium, das mit einem 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632) ergänzt wird, in die beschichtete Schale gebracht (siehe Materialtabelle). Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag ohne Y-27632 und kultivieren Sie es für weitere 2 Tage.
3. Waschen Sie die Zellen einmal mit RPMI-1640 Medium. Initiieren Sie die Endodermdifferenzierung, indem Sie das Medium durch RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% B27 Insulin + 1% Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin) ersetzen, ergänzt mit 3-6 μM CHIR-99021 und 100 ng/ml Activin A für 24 h (siehe Materialtabelle).
4. Ersetzen Sie das Medium durch RPMI-B27-Glu, ergänzt mit 50 ng/mL Activin A für 24 h.
5. Um die Differenzierung der hepatischen Vorläuferzellen zu induzieren, ersetzen Sie das Medium 5 Tage lang durch RPMI-B27-Glu, das mit 1 % Dimethylsulfoxid (DMSO) ergänzt ist.
6. Um die Hepatozytenreifung zu fördern, wechseln Sie zu Hepatozyten-Reifungsmedium: L-15-Medium von Leibovitz mit 10 μM Hydrocortison-21-hemisuccinat, 8,3 % Tryptosephosphat-Brühe, 100 nM Dexamethason (DEX), 50 μg/ml Natrium-L-Ascorbat, 0,58 % Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 8,3 % fötales Rinderserum (FBS), 2 mM Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin und 100 nM N-Hexanosäure-Try-Ile-(6)-aminohexansäureamid (Dihexa) (siehe Materialtabelle).
7. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage für 20 Tage. Sortieren Sie die Zellen etwa 27 Tage nach Beginn der Differenzierung.

3. Zellvorbereitung für die Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen iPS-Zellen gewonnen wurden

1. Waschen Sie hepatische differenzierte Zellen mit 2 ml PBS (-) pro Well.
2. Fügen Sie 1 ml Enzymlösung pro Vertiefung hinzu, die 0,1 % Kollagenase, 0,083 % Trypsin, 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632), 20 μM Ciclosporin A und 50 μg/ml Natrium-L-Ascorbat in Ads-Puffer (116 mM NaCl, 12,5 mM NaH₂PO₄, 20 mM HEPES, 5,4 mM KCl, 5,6 mM Glukose und 0,8 mM MgSO4; pH 7,35) enthält (siehe Materialtabelle). Die Zellen werden von den Platten gelöst, indem sie sie ca. 2 h lang bei 37 °C horizontal drehen.
3. Nachdem Sie unter einem Mikroskop bestätigt haben, dass die Zellen abgetrennt und gerundet sind, dispergieren Sie sie durch vorsichtiges Pipettieren in einzelne Zellen und sammeln Sie sie in einem 50-ml-Röhrchen.
4. Zellen bei 200 x g für 5 min bei 18 °C zentrifugieren, um sie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einem Aspirator.
5. Färben Sie die Mitochondrien der Zellen, indem Sie sie in 5 ml Hepatozyten-Reifungsmedium dispergieren, das 100 nM TMRM (Tetramethylrhodamin, Mehlester) enthält (siehe Materialtabelle). 30 min bei 37 °C inkubieren und dabei vor Licht schützen, indem in Alufolie eingewickelt werden.
6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 18 °C, um sie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand.
7. Resuspendieren Sie die Zellen mit 1-5 ml kaltem Ads-Puffer mit 2% FBS.
8. Zählen Sie die Zellzahl mit einer 0,4%igen Trypanblau-Lösung und einer Zellzählplatte.
9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C, um sie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand.
10. Verdünnen Sie einen Anti-ALCAM-Antikörper (Primärantikörper, siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:50 in Ads-Puffer und fügen Sie 100 μl des verdünnten Antikörpers pro 10⁶ Zellen hinzu. Färben Sie die Zellen 50 Minuten lang auf Eis. Bereiten Sie Zellen vor, die nicht mit dem primären Antikörper als Negativkontrolle gefärbt sind.
11. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem Ads-Puffer mit 2% FBS.
12. Verdünnen Sie ein Alexa Fluor 488 Esel-Anti-Ziegen-IgG (Sekundärantikörper, siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:100 in Ads-Puffer und fügen Sie 100 μl des verdünnten Antikörpers pro 10⁶ Zellen hinzu. Färben Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis. Färben Sie Zellen, die nicht mit dem Primärantikörper gefärbt wurden, mit dem Sekundärantikörper.
13. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem Ads-Puffer mit 2% FBS.
14. Resuspendieren Sie die Zellen in Ads-Puffer und filtern Sie sie durch ein Schnappkappen-Zellsieb (35 μm Netz), kurz bevor Sie nach FACS sortieren, um große Zellklumpen und Ablagerungen zu entfernen.

4. FACS-Analysen und Sortierung von aus humanen iPS-Zellen gewonnenen Hepatozyten

1. Richten Sie die FACS-Maschine für die Zellensortierung gemäß den Anweisungen des Herstellers ein (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Düsengröße von 85 μm oder 100 μm und einen ND-Filter von 2,0 für Hepatozyten. Verwenden Sie den FITC-Kanal zum Nachweis von Alexa Flour 488 für ALCAM und den PE-Kanal zum Nachweis von TMRM-Fluoreszenz für Mitochondrien.
2. Passen Sie die Spannungen FSC (Vorwärtsstreuung) und SSC (Seitenstreuung) an, um die Zellpopulation richtig zu visualisieren.
3. Passen Sie die Spannungen der FITC- und PE-Leuchtstoffkanäle an. Beginnen Sie mit unbeschrifteten Zellen, und zentrieren Sie die Zellpopulation am unteren Rand jedes Kanaldiagramms. Stellen Sie sicher, dass die beschrifteten Zellen im Diagramm richtig positioniert sind.
4. Verwenden Sie eine gängige Gating-Strategie, um Dubletten zu eliminieren: Gate die wichtigsten FSC-A vs. SSC-A-Population (Abbildung 2A), gefolgt von FSC-H vs. -W und dann SSC-H vs. -W (Abbildung 2B,C).
5. Gate der TMRM^hi- und ALCAM⁺-Population (P2 in Abbildung 2E), um Hepatozyten zu sortieren. Gate der TMRM^hi- und ALCAM-Population (P1 in Abbildung 2E), um Nicht-Hepatozyten zu sortieren. Sammeln Sie sortierte Hepatozyten und Nicht-Hepatozyten in 15-ml-Entnahmeröhrchen, die Hepatozyten-Reifungsmedium enthalten.
6. Das Sammelröhrchen mit den sortierten Zellen bei 200 x g für 5 min bei 18 °C zentrifugieren.
7. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in Hepatozyten-Reifungsmedium.
8. Aussaat der Zellen auf Mitomycin C-behandelten embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) oder gelartiger Basalmembranmatrix mit Hepatozyten-Reifungsmedium, ergänzt mit 10 μM Y-27632 und 20 nM Ciclosporin A. Kulturieren Sie die Zellen in einem 37 °C_{CO 2} -Inkubator für 5 Tage.

5. Immunzytochemie zum Nachweis von Hepatozyten, die aus humanen iPS-Zellen gewonnen wurden

1. Waschen Sie die kultivierten Zellen nach der Sortierung mit PBS (-) 5 Tage lang.
2. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit TBS-T-Puffer (1x TBS mit 1% Tween 20), um das Paraformaldehyd zu entfernen.
4. Inkubieren Sie die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 verdünntem TBS-T-Puffer für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit TBS-T-Puffer, um Triton X-100 zu entfernen.
6. Die handelsübliche Blockierungslösung (siehe Materialtabelle) für 30 min bei Raumtemperatur in die Zellen geben.
7. Primäre Antikörper gegen Albumin (Hepatozytenmarker) und humanes nukleäres Antigen (hNA, siehe Materialtabelle) zugeben, verdünnt 1:50 in Blockierungslösung.
8. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen zweimal mit TBS-T-Puffer.
9. Sekundärantikörper hinzufügen: Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-IgG und Alexa Fluor 546 Esel-Anti-Maus-IgG, 1:100 in Blockierungslösung verdünnt (siehe Materialtabelle).
10. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen zweimal mit TBS-T-Puffer.
11. Bewerten Sie die Reinheit von Hepatozyten, indem Sie albuminpositive und hNA-positive Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop zählen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Albumin-positiven Zellen pro hNA-positiver Zelle sowohl für die P1- als auch für die P2-Population.

Ergebnisse

Die Zeitleiste der Prozesse, die humane iPS-Zellen dazu veranlassen, sich durch 2D-Kultur (Abbildung 1A) und repräsentative Zellmerkmale (Abbildung 1B) in Hepatozyten zu differenzieren, wird gezeigt. Ungefähr am 12. Tag der Differenzierung begannen die Zellen polygonale Zellformen und runde Zellkerne zu zeigen, die für Hepatozyten charakteristisch sind. Einige Hepatozyten zeigten auch eine Mehrkernigkeit.

Die FACS-Analyse wurde mit de...

Diskussion

Aufgrund ihrer Funktionen im Nährstoffstoffwechsel und in der Entgiftung besitzen Hepatozyten im Vergleich zu anderen Zelltypen eine relativ große Anzahl an Mitochondrien¹⁵. ALCAM ist ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie und spielt eine Rolle bei der Zelladhäsion und -migration. Es wird in verschiedenen Zelltypen exprimiert, darunter hepatische, epitheliale, lymphozytäre, myeloische, Fibroblasten- und neuronale Zellen¹⁶. Durch die Verwendung einer Kombination aus der...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
253G1 humane iPS-Zelllinie	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% Paraformaldehyd	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Lösung, human, rekombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antikörper, Klon 235-1	Chemicon	MAB1281	Antikörper gegen humanes nukleäres Antigen
B-27 Supplement (50x), serumfrei	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Zellsortierer
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Kollagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembran-Matrix	Corning	354230	Gel-artige Basalmembran-Matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023 ROCK-Inhibitor
Dexamethason	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethylsulfoxid (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Esel Anti-Ziegen-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Esel Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	Scientific A-21206
Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsieb Schnappkappe	Corning	352235
fötales Rinderserum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin
Mensch/Maus/Ratte/Hund ALCAM/CD166 Antikörper	R& D Systems	AF1172
Hydrocortison 21-Hemisuccinat-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 Seide	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blockierungslösung
ITS-G Ergänzung(&mal; 100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amid (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyklonales Kaninchen-Anti-Human-Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylen-Sorbitan Monolaurat (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Natrium-L-Ascorbat	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamin, Methylester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypanblau-Lösung	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptosephosphat-Bouillon Lösung	Sigma-Aldrich	T8159