Method Article

Isolierung, Verhaltensidentifikation und Pathogenitätsbewertung von entomopathogenen Pilzen aus einem Waldholzbohrer

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll zur Gewinnung entomopathogener Pilze aus einem Waldholzzünsler vor und eine substituierende Methode zur Bewertung ihrer entomopathogenen Aktivitäten anhand eines Coleoptera-Modellinsekts. Diese Methode ist effizient und praktisch, um entomopathogene Pilzressourcen von holzbohrenden Schadinsekten in natürlichen Wäldern zu erforschen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Waldholzzünsler (FWB) verursachen weltweit schwere Baumschäden und wirtschaftliche Verluste. Die Freisetzung von entomopathogenen Pilzen (EPF) während der FWB-Schlüpfphase gilt als akzeptable Alternative zur chemischen Bekämpfung. Im Gegensatz zu landwirtschaftlichen Schadinsekten sind die Ressourcen der EPF für FWBs jedoch deutlich weniger erforscht. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Erkundung von EPF-Ressourcen aus FWBs am Beispiel wilder Monochamus alternatus-Populationen vorgestellt. In diesem Protokoll wird die Zuordnung von Fallen, die mit M beködert sind. alternatus Lockstoffe für verschiedene Populationen garantierten die Entnahme adäquater Proben mit natürlichen Infektionssymptomen während der Schlüpfperioden des Käfers. Nach feinem Präparieren der Integumente und deren Aufbringen auf ein selektives Medium wurden Pilzarten aus jedem Teil des Käferkörpers isoliert und anhand molekularer und morphologischer Merkmale identifiziert.

Mehrere Pilzarten wurden durch Reinfektion von gesunden M. alternatus mit Sporensuspensionen als parasitäre EPFs zertifiziert. Ihre Verhaltensphänotypen an M. alternatus wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie beobachtet und weiter mit denen an der Coleopteran-Modellinsekte Tribolium castaneum verglichen. Bei EPFs, die bei beiden Käferarten konsistente Parasitismus-Phänotypen aufweisen, Bewertung ihrer Aktivitäten auf T. Castaneum lieferte wertvolle Informationen zur Letalität für zukünftige Studien an M. alternatus. Dieses Protokoll half bei der Entdeckung von EPF-Neuinfektionen über M. alternatus-Populationen in China, die als effizienter Ansatz zur Erkundung weiterer EPF-Ressourcen aus anderen FWBs eingesetzt werden könnten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verwüstung durch Schadinsekten hat zu großen ökologischen und ökonomischen Verlusten sowohl in den Wald- als auch in den Agrarökosystemen geführt. Die meisten landwirtschaftlichen Schädlinge setzen sich natürlichen Feinden oder künstlichen Bekämpfungsmitteln aus und schädigen dabei die Wirtspflanzen. Stattdessen schließt der Waldholzzünsler (FWB) fast seinen gesamten Entwicklungszyklus in den Wirtsbaumstämmenab 1, was eine große Herausforderung für die Erforschung effizienter biologischer Schädlingsbekämpfungsorganismen aus FWB in der Wildnis darstellt. Noch schlimmer ist, dass FWBs eine große Anzahl von Phytopathogenen in sich tragen2 oder eine enge Beziehung zu diesen Krankheitserregern als ihren potenziellen Vektoren haben 3,4, was die negativen Auswirkungen von FWB auf die Gesundheit der Wälder dramatisch verstärkt. Der übermäßige Einsatz chemischer Insektizide kann den Schweregrad der FWB verringern, aber das Auftreten von Insektizidresistenzen 5,6 schränkt ihre Anwendung in der Umwelt ein. In bestimmten Fällen wurden Insektenparasitoide, räuberische Arthropoden sowie entomopathogene Mikroben als biologische Schädlingsbekämpfungsmittel in die Verbreitungsgebiete von FWB7 freigesetzt und erwiesen sich als effiziente und wirtschaftlich akzeptable Alternativen zur chemischen Bekämpfung 8,9,10.

Entomopathogene Pilze (EPF) gelten als im Vorteil bei der Bekämpfung von FWB gegenüber den meisten anderen mikrobiellen Gruppen. Ihre Sporen können von Insektenwirten getragen und durch Eindringen in die Kutikula oder das Integument stabil an Körperoberflächen fixiertwerden 8,11. EPF weisen auch eine ausgezeichnete Anpassungsfähigkeit an Umwelteinflüsse auf, und einige Arten besiedeln sich gut im Gewebe von Bäumen als Endophyten12,13, was ihr Wachstum, Überleben und ihre Übertragung erleichtert. Im Vergleich zu der in der Landwirtschaft ist die Artenvielfalt von EPF, die in natürlichen Waldökosystemen verwendet wird, jedoch bemerkenswert begrenzt 14,15,16. Beauveria bassiana (Stamm PPRI 5339) erwies sich als der vielversprechendste Stamm zur Förderung eines IPM-Programms für Eukalyptuskäfer in Südafrika17 und die Kombination von zwei vielversprechenden Isolaten von B. bassiana bot die Möglichkeit zur praktischen mikrobiellen Bekämpfung des Roten Palmrüsselkäfers, Rhynchophorus ferrugineus, in verschiedenen Lebensstadien auf Palmenfeldern18. Neben Beauveria und dem bekannten Metarhizium zeigten auch andere EPF-Gattungen der Ordnung Hypocreales, insbesondere Arten von Lecanicillium (von denen viele heute in die Gattung Akanthomyces19,20 eingeordnet werden), eine starke Pathogenität und ein hohes Potenzial bei der Bekämpfung von Waldschädlingen, wie z.B. der Zypressenblattlaus in Chile21.

Der Kiefernsägekäfer Monochamus alternatus ist ein berüchtigter Kiefernwaldschädling in China und den Nachbarländern, der sich in Äste und Stämme von Kiefern eingräbt, um den Transport von Nährstoffen und Wasser zu behindern 22,23,24. Darüber hinaus hat M. alternatus fördert auch die Invasion des pflanzenparasitären Kiefernfadenwurms (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) als Hauptvektorkäfer. Eine weitere artverwandte Art des Käfers, M. galloprovincialis, hat den Kiefernfadenwald in den letzten Jahren in mehreren Ländern Europas verbreitet25. Frühere Forschungen berichteten über mehrere Gattungen natürlicher EPFs aus Monochamus spp., wie Beauveria, Metarhizium und Lecanicillium (Verticillium, ein sogar früherer Name von Lecanicillium) in Spanien, Japan und den chinesischen Provinzen Anhui/Zhejiang 26,27,28,29. Nichtsdestotrotz scheinen diese Sammlungen von EPFs im Vergleich zu dem weit verbreiteten Vorkommen von Monochamuskäfern auf natürlichen Feldern häufig an einem bestimmten Ort begrenzt zu sein. Da der M. alternatus-Käfer in China weit verbreitet ist, könnte er als repräsentativer Holzzünsler angesehen werden, um mehr potenzielle EPFs in verschiedenen Populationen zu erforschen.

Im vorliegenden Protokoll führen wir ein spezifisches Verfahren ein, bei dem EPFs aus verschiedenen geografischen Populationen von M untersucht werden. alternatus in Südchina. Dieses Protokoll verwendet einen Coleoptera-Modellkäfer als Ersatz für die Durchführung von Entomopathogenitätstests, unter der Bedingung, dass die getestete Pilzart bei beiden Käferarten einen konsistenten Verhaltensphänotyp aufweist. Dieses Protokoll kann auch Einblicke in die EPF-Erkundung für andere Waldholzzünsler geben, bei denen die Diversität ihrer entomopathogenen Pilzarten unterschätzt oder weniger untersucht wird.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolierung von Pilzen aus M. alternatus (Abbildung 1)

  1. Käferprobe entnehmen
    1. Sammeln Sie die Kiefern Sägekäfer M. alternatus mit kommerziellen Fallen (siehe Materialtabelle), die vor den vorhergesagten Schlüpfperioden der Käferpopulationen in natürlich befallenen Kiefernwäldern mit Lockstoffen beködert wurden.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden Käfer aus fünf geografischen Regionen Südchinas (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guangdong, Yulin/Guangxi) gesammelt. Die Falleneinstellung von oben nach unten ist wie folgt: eine runde Oberseite (50 cm Durchmesser), eine kreuzförmige Platte (35 cm breit und 66 cm lang), ein Trichter (35,5 cm oben runder Durchmesser und 5,5 cm unterer runder Durchmesser), ein Auffangbecher (10,5 cm Durchmesser und 26,5 cm Länge). Als Köder30 werden die flüchtigen Bestandteile des Wirts (z. B. Ethanol und α-Pinen) und das Aggregationspheromon (2-Undecyloxy-1-ethanol) verwendet.
    2. Beschriften Sie die Probe, bevor Sie sie an das Labor übergeben. Legen Sie jeden Käfer in einzelne sterilisierte Röhrchen mit frischen Zweigen. Ersetzen Sie alle 2 Tage Zweige durch frische.
    3. Ziehen Sie die lebenden Käfer bei 25 ± 1 °C in einem nicht befeuchteten Brutschrank (16-8 L/D-Zyklen) auf und beobachten Sie sie täglich.
    4. Erfassen Sie Proben, die eine verminderte Fütterung und Beweglichkeit zeigen. Tot M übertragen. alternatus , die verhärtet und steif werden, um nasse Kammern zu bilden, um das Wachstum von Pilzmyzelien und Konidien zu beobachten.
      HINWEIS: Nach der Infektion mit entomopathogenen Pilzen zeigten die Käfer im Anfangsstadium der Infektion eine Abnahme der Nahrungsaufnahme und Beweglichkeit31,32. Nach dem Tod wurden ihre Körper verhärtet und steif, wobei Myzelien und Konidien einige Tage nach der Lagerung in einer Feuchtkammerauftraten 33.
    5. Lagern Sie Käferkadaver mit Pilzinfektionen für die zukünftige Verwendung bei 4 °C. Um diesem Protokoll zu folgen, verarbeiten Sie die Proben sofort innerhalb weniger Stunden, um eine Kontamination mit saprotropheren Pilzen zu vermeiden.
  2. Vorbereitung des Nährmediums
    1. 39 g Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Pulver in 1 l reines Wasser geben und 30 min bei 121 °C autoklavieren.
    2. Auf eine betriebsfähige Temperatur (~50 °C) abkühlen lassen, 0,05 g Streptomycin, 0,05 g Penicillin G und 0,05 g Tetracyclin zugeben und schütteln, um das Medium zu verteilen.
    3. Das Medium unter einer sauberen Bank in Petrischalen füllen und nach dem Erstarren verwenden.
      HINWEIS: Das PDA-Medium mit Antibiotika wird zur Isolierung von Käfern verwendet, das das Wachstum von Bakterien verhindert, ohne das Pilzwachstum während der Isolierung zu beeinträchtigen. Für den täglichen Anbau und die Konservierung wird jedoch das PDA-Medium ohne Antibiotika verwendet.
    4. 35 g Kartoffel-Dextrose-Pulver (PDB) in 1 L ddH2O geben und 30 min bei 121 °C autoklavieren. Kühlen Sie es für den Gebrauch ab.
  3. Sektion der Käferprobe mit Pilzinfektionssymptomen
    1. Bereiten Sie sterilisierte Scheren, Skalpelle und Insektennadeln vor; Arbeiten Sie dann unter einer sauberen Bank mit einem Alkoholbrenner.
      HINWEIS: Die Verwendung von Sezierwerkzeugen kann nach persönlichen Vorlieben angepasst werden. Insektennadeln sind schärfer als Standard-Präpariernadeln, und unterschiedliche Spezifikationen können den Bedarf an Sezieren decken.
    2. Sezieren Sie die Körperintegumente des Käfers mit Werkzeugen in sterilen und Einweg-Petrischale. Achten Sie darauf, mögliche Schäden am Mitteldarm- und Hinterdarmgewebe zu vermeiden, die inneren Inhalt austreten können.
    3. Teilen Sie die Käferkörper wie folgt in die Hauptpositionen ein: Antennen, Kopf, Thorax, Bauch, Flügel (jedes Paar) und Beine.
  4. Reinigung von Pilzen
    1. Schneide die Integumente jeder Position mit einer Schere in kleine Stücke. Drücken Sie die Außenfläche vorsichtig mit Antibiotika auf die Oberfläche der PDA-Platten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Pilzmyzelien auf den Integumenten auf die Platte geimpft wurden.
    2. Vorsichtig mit Parafilm verschließen und in einem Inkubator bei 25 ± 1 °C kultivieren, bis das Gewebe vollständig mit Myzel bedeckt ist.
    3. Einzelne Kolonien entsprechend den phänotypischen Eigenschaften (Farbe, Form) mit Antibiotika zur Kultur bei 25 ± 1 °C auf einen neuen PDA übertragen.
    4. Schritt 1.4.3 zwei- bis dreimal auf PDA mit Antibiotika wiederholen, bis die reinen Kolonien getrennt isoliert sind.
      HINWEIS: Wenn mehrere Pilzstämme in den Originalplatten wachsen, wählen Sie das Myzel genau aus, um die Sortierung weiterer Pilzarten zu erleichtern.
  5. Lagerung der Pilzisolate
    1. Übertragen Sie Agarblöcke (~5 mm Durchmesser) von den Kolonien auf neue PDA-Platten.
    2. In einem Inkubator bei 25 ± 1 °C für 1-2 Wochen kultivieren.
    3. Zur täglichen Aufbewahrung für die weitere Verwendung in einen 4 °C Kühlschrank stellen.
    4. Pilzstämme werden in einem 250-ml-Kolben in 50 mL sterilem PDB inokuliert und 5-7 Tage lang bei 180 U/min/min bei 25 °C geschüttelt.
    5. Ernten Sie 1 ml des frisch gewachsenen Pilzmyzels und suspendieren Sie es in 1 ml sterilisiertem 20%igem Glycerin in sterilen 2-ml-Gefrierröhrchen (die Endkonzentration von Glycerin beträgt 10%).
    6. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und kühlen Sie sie bei -20 °C und -40 °C vor. Halten Sie dann die Röhren als Vorräte auf -80 °C.

2. Molekulare und morphologische Identifizierung von Pilzisolaten

  1. Extraktion von genomischer Pilz-DNA
    1. Kultivieren Sie Pilze in PDB, wie in Schritt 1.5.4 beschrieben.
    2. Ernten Sie das Myzel und filtern Sie es, um es vom PDB zu trennen. In flüssigem Stickstoff mit einem vorgekühlten Mörser und Stößel homogenisieren.
    3. Extrahieren Sie die genomische DNA mit dem Fungi Genomic DNA Isolation Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  2. PCR-Amplifikation und DNA-Sequenzierung
    1. Bereiten Sie das PCR-Reaktionsgemisch wie folgt vor: 25 μl Taq-DNA-Polymerase, 1 μl Template, 2 μl Vorwärts- und Rückwärtsprimer und ddH2O bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl.
    2. Die rDNA-ITS-Region der DNA-Probe wird mit den Primerpaaren ITS1 und ITS434 (siehe Tabelle 1) nach folgendem Verfahren amplifiziert: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 4 min, gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 94 °C für 60 s, Glühen bei 58 °C für 60 s, Dehnung bei 72 °C für 2 min, und eine abschließende Dehnung bei 72 °C für 10 min.
    3. Elektrophorese von amplifizierten Produkten mit 1,5% Agarosegel bei 100 V, 100 mA.
    4. Sequenzieren Sie die PCR.
    5. Richten Sie die Sequenz mit Clustal X2.0 und MEGA 6.0 aus.
      HINWEIS: Bei der Sequenzausrichtung werden Standorte mit mehrdeutiger Ausrichtung ausgeschlossen, und Lücken werden als fehlende Daten behandelt.
    6. Vergleichen Sie die erhaltene Sequenz mit denen in der ITS-Sequenzdatenbank in GenBank mit BLAST auf der Website des National Center for Biotechnology Information (NCBI). Identifizieren Sie zunächst die Informationen über die Pilzstammarten.
  3. Morphologische Identifizierung
    1. Verwenden Sie eine Kamera, um die Morphologie der reifen reinen Pilzkolonie sowohl auf der Vorder- als auch auf der Rückseite der PDA-Platten zu erfassen.
    2. Aus den Reinkultur-Pilzkolonien werden mit einer Impfnadel Konidien gezupft und mit einem Tropfen sterilem Wasser auf einen Objektträger umgefüllt.
    3. Halten Sie das Deckglas fest und legen Sie es langsam in einem Winkel von ~45° ab, damit das Deckglas die Probe blasenfrei abdecken kann.
    4. Schneiden Sie mit einem Skalpell einen 5 mm2 großen Agarblock aus Kolonien am Rand der Pilzkolonie ab und geben Sie ihn mit einem Tropfen sterilem Wasser auf einen sauberen Glasobjektträger. Toupieren Sie Pilze vorsichtig mit einer feinen Nadel auseinander, um bestimmte Strukturen zu erkennen.
    5. Wiederholen Sie Schritt 2.3.3.
    6. Beobachten Sie die asexuelle Morphe der Pilze unter einem optischen Mikroskop (OM), einschließlich der Form, Transparenz und Haltung der Hyphen, Konidiophoren, Phialiden und Konidien. Erfassen und messen Sie die Form und Größe der asexuellen Merkmale, um die verschiedenen Pilzisolate voneinander zu unterscheiden.
      HINWEIS: Um die Fähigkeit zur Beobachtung von Pilzstrukturen zu maximieren, verwenden Sie Flecken und Eindeckmittel35.

3. Induktion der Symptome einer Pilzinfektion bei M. alternatus zur Beobachtung ihrer Verhaltensphänotypen

  1. Herstellung der Konidiensuspension
    1. 0,01% Tween-80 mit reinem Wasser zubereiten und 25 min bei 121 °C autoklavieren. Nach dem Abkühlen verwenden.
    2. Geben Sie eine angemessene Menge steriler kleiner Glaskügelchen und 0,01 % Tween-80-Lösung in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen.
    3. Kratzen Sie Pilzkolonien in das Röhrchen und schütteln Sie es ausreichend mit einem Wirbelschüttler, bis das Volk aufgebrochen ist. Filtern Sie durch zwei Schichten Gaze, um das Myzel zu entfernen.
      HINWEIS: Das Schütteln erfolgt, um die Suspension der Konidiospore in 0,01% iger Tween-80-Lösung sicherzustellen.
    4. Zählen Sie die Anzahl der Sporen unter dem OM mit einem Hämozytometer, stellen Sie sie auf 1 × 108 Konidien/ml mit sterilen 0,01 % Tween-80 ein und halten Sie sie für die Verwendung bei 4 °C.
  2. Vorbereitung von Käfern
    1. Die Zirbenzweige (etwa gleich groß) autoklavieren und im Ofen trocknen (~ 60 °C).
    2. Bewahren Sie das auf dem Feld gesammelte M auf. alternatus adulte Tiere mit Zirbenzweigen in einem Brutkasten bei 25 ± 1 °C.
    3. Käfer 24 Stunden lang aushungern lassen und die Oberfläche der Käfer vor Gebrauch mit Bleichmittel, Ethanol und destilliertem Wasser [10:10:80 (v:v)] sterilisieren.
  3. Induktion der Pilzinfektion
    1. Arbeiten Sie unter einer sauberen Bank, tauchen Sie die Zirbenzweige 10 s lang in eine konische Aufhängung und trocknen Sie sie an der Luft.
    2. Die Käfer werden 10 s lang in konidiale Suspension getaucht und dann in sterile 50-ml-Röhrchen (ein Käfer und ein Zweig pro Röhrchen) überführt. Ersetzen Sie die Zweige alle 2 Tage durch neue.
    3. Zur Negativkontrolle die konidische Suspension in eine nur sterile 0,01%ige Tween-80-Lösung umwandeln. Machen Sie fünf Replikate für jeden Pilzstamm und jede Kontrollgruppe.
    4. Beurteilen Sie die Aktivität von Käfern anhand der Menge an Frass, die an Kiefernzweigen produziert wird. Wenn die Fütterung aufhört, betrachten Sie sie als tot.
    5. Füllen Sie die toten Käfer in neue sterile 50-ml-Röhrchen um und legen Sie ein Stück sterile feuchte Watte hinein. Inkubieren bei 25 ± 1 °C.
      HINWEIS: Die nasse Watte wird verwendet, um die Feuchtigkeit zu halten, da das Wachstum von Pilzen angemessene Feuchtigkeit erfordert, aber nicht zu viel.
    6. Beobachten und fotografieren Sie die Veränderung der Käferoberfläche jeden Tag zur gleichen Zeit.
  4. Erneute Isolierung und Bestätigung der Pilzarten
    1. Bis klare Pilzinfektionsphänotypen auf der Oberfläche von Käfern auftreten, wählen Sie Myzel aus verschiedenen Geweben einzeln in neue PDA-Platten aus.
    2. Bei 25 ± 1 °C kultivieren und beobachten, ob die Morphologie mit der der geimpften Pilze übereinstimmt.
  5. Behandlung von Modellkäfern
    1. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.3.6 am Modellkäfer Tribolium castaneum unter Verwendung von Weizenkleie als Futter und sterilisieren Sie die Weizenkleie mit UV-Licht.
    2. Berühren Sie die Käfer leicht mit einer sterilen Pinzette. Gehen Sie davon aus, dass sie tot sind, wenn es keine Antwort gibt.

4. Bestätigung der Infektionsphänotypen von Pilzen bei M. alternatus und Modellkäfer

  1. Probenvorbereitung für die Beobachtung
    1. Sezieren Sie den infizierten M. alternatus Leichen vorsichtig wie in Schritt 1.3.
    2. Wähle T. Kastankörper mit offensichtlichen Symptomen einer Pilzinfektion.
    3. Schneiden Sie 5 mm Scheibenstopfen von vier reifen Pilzkolonien, die auf PDA wachsen.
  2. Vorbehandlung von Proben
    1. Pfropfen, infiziertes Käfergewebe und Körper 2 Tage lang in vorgekühltes 2,5%iges Glutaraldehyd bei 4 °C legen.
    2. Waschen Sie die Proben dreimal 5 Minuten lang in 0,1 % Phosphatpuffer (pH 7,2-7,4) und dehydrieren Sie sie 10 Minuten lang in 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % Ethanol.
    3. Trocknen Sie die Proben in einem Vakuum-Gefriertrockner.
      HINWEIS: Der gesamte Vorbehandlungsprozess sollte sorgfältig sein, einschließlich Schneiden, Einweichen, Dehydrieren, Waschen und Trocknen, um Schäden an der Probe zu vermeiden.
  3. Rasterelektronenmikroskopie (REM) Beobachtung
    1. Die vorbehandelten Proben werden mit einem Sputter-Coater mit Platin beschichtet und unter einem Rasterelektronenmikroskop36 betrachtet.
    2. Aufzeichnung der morphologischen Merkmale von Hyphen und Konidien, die auf PDA, M wachsen. Alternatus-Gewebe und Modellkäferkörper.
    3. Vergleichen Sie, ob die Ergebnisse mit denen unter OM in Schritt 2.3 übereinstimmen.

5. Bewertung der entomopathogenen Aktivität

  1. Herstellung der Konidiensuspension
    1. Die Herstellung der Konidiensuspension ist die gleiche wie in den Schritten 3.1.1 bis 3.1.4.
  2. Vorbehandlung von Modellkäfer
    1. Kultivieren, füttern, sterilisieren und aushungern T. Kastaneum wie in Schritt 3.5.1 beschrieben.
    2. Sterilisieren Sie Weizenkleie durch UV-Strahlung und legen Sie das gleiche Gewicht auf sterile Petrischale.
  3. Test der entomopathogenen Aktivität
    1. Behandeln Sie die Weizenkleie mit der Konidiensuspension und trocknen Sie sie an der Luft unter einer sauberen Bank bei Raumtemperatur.
    2. Tauchen Sie ein T. Kastankäfer 10 s in der konidialen Suspension halten und in eine Petrischale überführen (n = 20 in jeder Petrischale). Ersetzen Sie die neue Weizenkleie alle 4 Tage durch die gleiche Konidienbehandlung.
    3. Zur Negativkontrolle nur sterile 0,01%ige Tween-80-Lösung auftragen.
      HINWEIS: Legen Sie mindestens drei Wiederholungen für jede Behandlungsgruppe und die Kontrolle bereit.
    4. Zählen Sie täglich die toten Käfer.
      HINWEIS: Berühren Sie die Käfer leicht mit einer sterilen Pinzette. Gehen Sie davon aus, dass sie tot sind, wenn es keine Reaktion gibt.
  4. Phylogenetische Multigenanalyse
    1. Entomopathogene genomische Pilz-DNA wie in Schritt 2.1 beschrieben extrahieren.
      HINWEIS: Für die parasitären EPFs, die signifikante Infektionsphänotypen und starke entomopathogene Aktivitäten gegen den Modellkäfer zeigen, wird eine Multigenidentifizierung durchgeführt.
    2. Amplifizieren Sie die folgenden Gene, einschließlich einer Region, die das nukleäre ribosomale SSU34-Gen umfasst, ein Segment des großen Untereinheiten rRNA-Gens (LSU37,38), einen Teil des Elongationsfaktor-1-alpha-Gens (tef-1α39), die zweitgrößten Untereinheitensequenzen der RNA-Polymerase ІІ (rpb240) und einen Teil des β-Tubulin41 unter Verwendung der Primerpaare NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R bzw. TUB1/TUB22 (siehe Tabelle 1).
      1. Bereiten Sie das PCR-Reaktionsgemisch wie in Schritt 2.2.1 vor.
      2. Die Amplifikation ist wie folgt durchzuführen: anfängliche Denaturierung bei 95 ΰC für 4 min, gefolgt von 35 Zyklen (tef-1α, rpb2, SSU), 38 Zyklen (LSU) oder 39 Zyklen (β-Tubulin) Denaturierung bei 94 °C für 60 s, Glühen bei 47 °C für 60 s (LSU), 55 °C für 60 s (tef-1α), 54 °C für 40 s (β-Tubulin) und 50 °C für 30 s (rpb2, SSU), eine Dehnung bei 72 °C für 1 min und eine endgültige Dehnung bei 72 °C für 10 min.
    3. Sequenzieren und richten Sie es mit den gleichen Schritten aus, die in den Schritten 2.2.4 bis 2.2.5 gezeigt wurden.
    4. Führen Sie die phylogenetische Analyse mit MEGA 6.0 auf der Grundlage der Maximum-Likelihood-Methode (ML)42 durch.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolierung und Identifizierung von Pilzisolaten aus M. alternatus
Mit Hilfe von Lockstofffallen konnte eine große Anzahl (insgesamt ca. 500 Käfer) von M. Alterlatus wurden aus fünf geografischen Regionen gesammelt. Es wurden Käferkadaver mit typischen Symptomen einer Infektion durch entomopathogene Pilze entnommen; Dann wurden die Körperintegumente jedes Käfers in mehrere Positionen präpariert, wie in Protokollschritt 1.3 beschrieben. Als Ergebnis wurden mehr als 6...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unterschiedliche geographische Populationen von FWB können aufgrund der langfristigen Anpassung der EPF-Arten an lokale Klimafaktoren und der spezifischen genotypischen Population des Wirtsinsekts unterschiedliche Wechselwirkungen mit den natürlichen entomopathogenen Pilzen entwickeln 44,45. Die Ausweitung der Probenahmestellen auf mehrere Insektenvorkommensregionen trägt dazu bei, die Möglichkeit zu erhöhen, verschiedene Stämme ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde vom National Key Research and Development Program of China (2021YFC2600100) und der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (LY21C040001) unterstützt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL, 2 mL ZentrifugenröhrchenBiosharpBS-15-M
10 & micro; L PipettenspitzenSangon BiotechF601216
10 µ L, 20 & Mikro; L, 100 &Mikro; L, 200 & Mikro; L, 1.000 & Mikro; L PipettenRainin
1.000 µ L PipettenspitzenSangon BiotechF630102
2 mL KryofläschchenCorning430659
20x PBS PufferSangon BiotechB548117-0500
200 µ L PipettenspitzenSangon BiotechF601227
2.000 bp HerstellerTaKaRarSD0531
50 mL RöhrchenNest602052
50% GlutaraldehydlösungSangon BiotechG916054
50x TAE PufferSangon BiotechB548101
6x LadepufferTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
wasserfreies EthanolJkchemicalLB10V37
Biochemie AnbauschrankShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Kommerzielle KäferfallenFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Gel ImagerBio-RadGelDoc XR+
GlycerinSangon BiotechA600232
Kühlzentrifuge mit hoher GeschwindigkeitSigmaD-37520
Hochdruck-DampfsterilisationsopferMettler ToledoJA5003
IsopropylalkoholAllgemeines ReagenzG75885B
NukleinsäurefarbstoffSangon BiotechA616696
Optisches Mikroskop, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilm PM996
PCR-MessgerätHeal ForceTrident960
Penicillin GMärklinGB15743
Kartoffel-Dextrose-Agar, PDAOxoidCM0139
Kartoffel-Dextrose-Brühe, PDBSolarbioP9240
PrimerSangon Biotech/
Primer TaqTaKaRarRR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation KitSangon BiotechB518229
Rasterelektronenmikroskop, REMHitachiS-3400N
StreptomycinMärklinS6153
TetracyclinMärklinT829835
Tween-80MärklinT6336
Vakuum-GefriertrocknerYamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMärklinM6230

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

Related Articles