Method Article

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

DOI:

10.3791/65788

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, 2Ilse Kats Institute for Nanoscale Science & Technology, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Plant Pathology and Microbiology, Faculty of Agriculture, Food and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 4The Scojen institute for synthetic biology, Reichman university

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nützliche und probiotische Bakterien spielen eine wesentliche Rolle in ihren Wirten und bieten verschiedene gesundheitliche Vorteile, einschließlich der Immunität gegen Infektionskrankheiten. Die Familie der Lactobacillaceae besteht aus grampositiven Bakterien mit bestätigten probiotischen Eigenschaften. In dieser Studie werden Lactobacillaceae-Spezies als Modell verwendet, um die Wirksamkeit der Einzelzell-Hochdurchsatzanalyse bei der Untersuchung der zellulären Aggregation zu demonstrieren. Der Schwerpunkt liegt auf der Analyse der Reaktion dieser nützlichen Spezies auf einfache Kohlenhydrate aus der Nahrung.

Die Studie zeigt, wie die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) die grundlegenden Unterschiede in der Assemblierung probiotischer Bakterien in Gegenwart und Abwesenheit von Kohlenhydraten überwinden kann. IFC kombiniert die Leistungsfähigkeit und Geschwindigkeit der konventionellen Durchflusszytometrie mit der räumlichen Auflösung der Mikroskopie und ermöglicht komplexe morphometrische Messungen mit hoher Rate in einer phänotypisch definierten Weise über eine Bibliothek nützlicher Bakterienstämme und -bedingungen. Dieses Protokoll bietet Einblicke in die Autoaggregation von Lactobacillaceae-Arten und beleuchtet ihre Reaktion auf Kohlenhydrate in der Nahrung, was zum Verständnis der Mechanismen hinter den positiven Wirkungen dieser probiotischen Bakterien beiträgt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die bakterielle Autoaggregation gilt als ein primärer Schritt bei der Bildung von Biofilmen. Bei diesem Prozess (manchmal auch Autoagglutination oder Flockung genannt) bilden Bakterien des gleichen Typs mehrzellige Klumpen, die sich schließlich am Boden von Kulturröhrchen absetzen oder sich an ihr Zielgewebe oder ihre Oberfläche anheften1.

Autoaggregation ist ein weit verbreitetes Phänomen und wurde bisher bei gramnegativen Erregern wie dem opportunistischen Erreger Acinetobacter baumannii2, dem Zahnpathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3 und dem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die .ast-Datei mit der Vorlage für Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) als Beispiel wird in der Supplementary Coding File 1 bereitgestellt.

1. Vorbereitung der Medien

  1. Bereiten Sie Laktobazillen-MRS-Brühe gemäß den Anweisungen des Herstellers (55 g in 1 l entionisiertem Wasser) und Laktobazillen-MRS-Agarplatten mit 1,5 % (w/v) Agar zu (siehe Materialtabelle). Nach der Sterilisation im Autoklaven ist das Medium direkt gebrauchsfertig oder kann bei 4 °C gelagert werden.
  2. 50% (15 g in 1 l entionisiertem Wasser) tryptische Sojabrühe (TSB) (siehe Materialtabe....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Unterschiede in der Autoaggregation als Reaktion auf Nahrungszucker in LAB-Bakterien leicht messen kann. Durch die Trennung von Individuen und Aggregaten ermöglicht die Methode die Berechnung des prozentualen Anteils der Grundgesamtheit an den Aggregationsereignissen an allen Ereignissen als Reaktion auf fermentierbare oder nicht fermentierbare Zucker aus der Nahrung. Darüber hinaus war es möglich zu messen, ob es Unterschiede in der durchschnittlichen Größe der Gesamtpopulat.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Durchflusszytometrie ist eine weit verbreitete Methode zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in eukaryotischen Zellen, liefert jedoch aufgrund ihrer größeren Größe oder kleinen Aggregate möglicherweise keine genauen Messungen für Bakterienzellen. Diese Faktoren können die genaue Quantifizierung der Autoaggregation und das basale Niveau der Aggregatbildung unter verschiedenen Bedingungen erheblich beeinflussen. Um dies zu beheben, wurde die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) eingesetzt, um eine bessere Auf.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Israeli Science Foundation (Grant 119/16) und IMoh Grant (3-15656) an die IKG unterstützt. R.S. unterstützt durch das Kreitman-Stipendium.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 mL KulturröhrchenFalcon352051
15 mL ZentrifugenröhrchenFalcon352096
Bacto AgarBaeton,Dickinson and Company214010
Bacto Typtic Soja BrothBaeton,Dickinson and Company211825
D-(+)-GlucoseSigmaG7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrateSigma83400-25G
Difco Laktobazillen MRS BouillonBaeton,Dickinson and Company288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)FL medical23053
IDEAS SoftwareAmnis/EMD MilliporeN/A  Details unter: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/A  Details abrufbar unter: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-Morpholin)propansulfonsäureFisher BioreagenzienBP308-500
Kaliumphosphat zweibasischFisher Scientific, 174,18 g/molBP363-1
Kaliumphosphat monobasischSigma, 136,09 g/molP0662-500G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. Bacterial autoaggregation. AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).
  2. Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating hig....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometryMicrobial AutoaggregationLactobacillaceae SpeciesProbiotic BacteriaSingle Cell AnalysisDietary CarbohydratesHigh Throughput ImagingAggregate Size DistributionBright Field MicroscopyCell Aggregation

Related Articles