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Methodenartikel

Ein Tool zur automatischen Erstellung stabiler und reproduzierbarer zellfreier Lücken zur Verbesserung der Zuverlässigkeit von Zellwundheilungsassays

1.4K Aufrufe

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DOI:

10.3791/65794

⸱

4. Oktober 2024

 ,  ,  , 
1Faculty of Art and Communication, Kunming University of Science and Technology, 2The School of Integrated Chinese and Western Clinical Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Industrial Design, Hubei University of Technology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Durch die Einbeziehung des Interaktionserlebnisdesigns und der Analyse der Benutzeranforderungen führen wir einen innovativen Zellschaber ein, der zelluläre Wundheilungsassays in Bezug auf Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit, Praktikabilität, zelluläre Integrität und Benutzererfahrung verbessert.

Zusammenfassung

Die Zuverlässigkeit der Messung der zellulären Migration in Wundheilungsassays wird häufig durch die vorherrschende methodische Instabilität, d.h. die spitzenbasierte Methode, untergraben. Wir stellen ein innovatives Instrument vor, das diese Einschränkungen überwinden soll. Unser neuartiger Zellabstreifer übertrifft den bisherigen Ansatz und erzeugt einen konsistenteren und stabileren zellfreien Spalt. Wiederholte biologische Experimente zeigen, dass der durch den Zellschaber erzeugte zellfreie Spalt im Vergleich zur spitzenbasierten Technik geradere Kanten und eine einheitliche Größe und Form aufweist (p < 0,05). In Bezug auf das Produktdesign verfügt der Zellschaber über ein verfeinertes Farbschema, das für Laborumgebungen geeignet ist, die Überwachung der Versuchsergebnisse verbessert und die Sterilisation durch Autoklavieren zur Wiederverwendung ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass der Zellschaber nach der Behandlung einen vernachlässigbaren Effekt auf die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen zeigt (97,31 % bzw. 24,41 %). Umgekehrt führt die tip-basierte Methode zu einer geringeren Zellviabilität (91,37 %) und Proliferation (18,79 %). Diese Untersuchung stellt den Zellschaber als ein neuartiges, wiederverwendbares Gerät vor, das in der Lage ist, reproduzierbare zellfreie Lücken zu erzeugen und gleichzeitig die zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten, wodurch die Zuverlässigkeit von Wundheilungsassays im Vergleich zu bestehenden Techniken erhöht wird.

Einleitung

Tumore zeichnen sich durch unterschiedliche Merkmale aus, wie z. B. selektive Wachstumsvorteile, metabolische Neuverdrahtung und Immunmodulation, die alle faszinierenderweise zu einer verstärkten Zellmigration beitragen, einem kritischen bösartigen Verhalten von Tumorzellen. Dieses Merkmal wirkt sich direkt auf die Fernmetastasierung des Primärtumors aus und beeinträchtigt das Langzeitüberleben der Patienten 1,2,3. Selektive Wachstumsvorteile ermöglichen es Krebszellen, normale Zellen zu verdrängen, während die metabolische Neuverdrahtung diese schnelle Proliferation unterstützt, indem sie Energiewege verändert. Gleichzeitig ermöglicht die Immunmodulation Tumoren, sich der körpereigenen Abwehr zu entziehen. Studien unterstreichen die Schwere dieses Problems und zeigen, dass Lungenmetastasen, oft eine Folge einer verstärkten Zellmigration, ein tödliches Ereignis sind, das zum Tod von Patienten mit verschiedenen Krebsarten führt4. So machen beispielsweise Brustkrebs5, Gebärmutterhalskrebs4 und Osteosarkom6 20 %, 9 % bzw. 30 % dieser Fälle aus. Daher ist die Beurteilung der Migration von Tumorzellen zu einem integralen Bestandteil der aktuellen onkologischen Forschung geworden, was die Vielschichtigkeit der Tumorprogression weiter unterstreicht.

Der Zellwundheilungsassay ist eine einfach anzuwendende Methode zur Messung der zellulären Migration in vitro , die häufig in onkologischen Studien eingesetzt wird7. Die meisten Experimentatoren verwenden Pipettenspitzen, um Zellwunden manuell zu erzeugen8. Obwohl eine solche Methode schnell und bequem Zellwunden bilden könnte, weist sie immer noch viele Einschränkungen auf, die die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei der Bewertung der Zellmigration beeinträchtigen. Erstens wird die Verwendung von Pipettenspitzen zur manuellen Erzeugung von Kratzern stark vom Bedienwinkel, der Kraft und der Geschwindigkeit des Bedieners beeinflusst, was sich auf die Wiederholbarkeit der Methode auswirkt8. Zweitens haben spitzengenerierte Zelldefekte in der Regel gezackte Kanten anstelle von geraden Kanten, da Pipettenspitzen Kunststoffprodukte mit einer gewissen Elastizität sind9. Einige Studien erzeugen Wunden, indem vorgefertigte Kultureinsätze direkt in die Zellkulturplatte eingesetzt werden, um den Bereich der Zellproliferation einzuschränken10. Dieser Ansatz umgeht die Einschränkungen der spitzenbasierten Methode, wie z. B. gezackte Kanten und Reproduzierbarkeit. Aber auch bei biokompatiblen Materialien wirkt sich die langfristige Koexistenz der Einbettung mit den Zellen immer noch auf das Zellwachstumaus 11. Darüber hinaus kann die Einbettung aufgrund der Kontaktbeschränkung auch zelluläre epigenetische Veränderungen in der Marginalzone verursachen12. Außerdem sind Kontakteinsatze, die aus biokompatiblen Materialien hergestellt werden, teuer und schwer wiederzuverwenden, was ihre Machbarkeit einschränkt13. Daher wird ein neuartiges, reproduzierbares und praktisches Werkzeug benötigt, um die zelluläre Migration in vitro einfach zu quantifizieren.

Das Hauptziel dieser Methode ist es, ein innovatives Werkzeug zur Quantifizierung der zellulären Migration in vitro in onkologischen Studien einzuführen, die Grenzen bestehender Techniken zu überwinden und die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei der Beurteilung der zellulären Migration zu verbessern.

Der Grund für die Entwicklung dieser Technik liegt in der entscheidenden Bedeutung der Bewertung der Migration von Tumorzellen in der Onkologie. Tumore weisen charakteristische Merkmale auf, darunter selektive Wachstumsvorteile, metabolische Neuverdrahtung und Immunmodulation, die alle zu einer verstärkten Zellmigration beitragen, einem grundlegenden Aspekt der bösartigen Krebserkrankung. Diese Methode zielt darauf ab, ein zuverlässigeres Mittel zur Untersuchung der zellulären Migration bereitzustellen und zu einem tieferen Verständnis des Tumorverhaltens beizutragen.

Diese Methode bietet erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Techniken. Manuelle Scratch-Assays können unter bedienerabhängigen Interferenzen leiden, während Kultureinsätze das Zellwachstum und die Genexpression beeinträchtigen können. Im Gegensatz dazu bietet diese Methode eine verbesserte Wiederholbarkeit, Genauigkeit und Praktikabilität und stellt eine kostengünstige Lösung für die Messung der zellulären Migration in vitro in der onkologischen Forschung dar. Es adressiert den entscheidenden Bedarf an einem zuverlässigen und zugänglichen Werkzeug zur Untersuchung der Zellmigration bei verschiedenen Krebsarten, was es zu einer wertvollen Ergänzung des Feldes macht.

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Protokoll

Alle Teilnehmer gaben eine vollständige schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Ethikzulassung war nicht anwendbar, da in der vorliegenden Studie keine tierischen oder menschlichen Gewebeproben eingeschlossen wurden.

1. Untersuchung der Anforderungen der Nutzergemeinschaft

  1. Liefern Sie Fragebögen an die Biologen/Experimentatoren, die an Zellwundheilungsassays arbeiten. Sammeln Sie die ausgefüllten Fragebögen und verwenden Sie sie für die Studie. Für diese Studie wurden vom 12. Oktober 2021 bis zum 3. Februar 2022 100 Fragebögen an 100 Biologen verteilt. Der Prozentsatz der Rücklaufquote lag bei 97 %.
  2. Bitten Sie die Befragten, Fragen zu beantworten wie: Welches der Zellkratzexperimente hat Sie am meisten gestört? Und mit welchem Werkzeug wurde das Cell Scratching durchgeführt? Folgen Sie diesen Fragen mit Unterfragen, um die Ursachen zu verfolgen.
  3. Untersuchen Sie die Wahrnehmung von Werkzeugen wie Pipettenspitzen und Zellkultureinsätzen durch Experimentatoren in Zellwundheilungsexperimenten. Verstehen und sammeln Sie ihre Gründe für die Auswahl eines Tools gegenüber einem anderen, indem Sie die Means-End-Chain-Theorie verwenden, die auf Laddering-Techniken in den Fragebögen Abschnitt14,15 basiert.
    HINWEIS: Die Leitermethode ist in zwei Typen unterteilt: die weiche Leitermethode mit ausführlichen Interviews und die harte Leitermethode mit Fragebögen oder Papier-und-Bleistift-Quizfragen16. Die harte Laddering-Methode war die primäre Technik, die in dieser Studie verwendet wurde. Die Means-End-Chain-Theorie legt nahe, dass das explizite Wissen der Zielnutzer oberflächlich und konkret ist, während das implizite Wissen tief und abstrakt ist 17,18,19.

2. Design und dreidimensionale Modellierung

  1. Ziehen Sie eine Skizze aus den Erkenntnissen aus der vorherigen Fragebogenumfrage und initiieren Sie den Designprozess. Verwenden Sie diese vorläufige Skizze als grundlegende Blaupause.
    1. Erläutern Sie die Abmessungen und das Layout der einzelnen Komponenten, indem Sie die Funktionen "Dim", "DimRadius" und "DimDiameter" in der Modellierungssoftware anwenden.
    2. Führen Sie Messungen mit dem Messschieber mit einer Genauigkeit von 0,02 mm auf tatsächlichen 6-Well-Platten durch, um die endgültigen Abmessungen des Zellabstreifers zu ermitteln. Vergewissern Sie sich, dass diese 42,1 mm lang, 42,1 mm breit und 18,5 mm hoch sind. Achten Sie in der Designphase auf die Details, insbesondere auf die Produkthöhe und die Eignung in der Vertiefung, um eine reibungslosere Montage zu ermöglichen.
  2. Erstellen Sie ein dreidimensionales Modell, und rendern Sie es.
    1. Beginnen Sie mit der 3D-Konstruktion in einer Software, indem Sie ein Basismodell erstellen. Klicken Sie auf Schaltflächen wie ExtrudeCrv zum Dehnen und Loft zum Formen des Designs. Verfeinern Sie das Modell, und klicken Sie dann auf Kante abrunden, um Kanten zu glätten.
      HINWEIS: Weitere verwendete Funktionstasten sind: Linien - Zum Zeichnen von geraden Liniensegmenten, Polylinien - Zum Erstellen von durchgehenden Linien, die aus mehreren Segmenten bestehen, Rechtecke - Zum Zeichnen von rechteckigen Formen, Kreise - Zum Zeichnen von Kreisformen, Bögen - Zum Zeichnen von Bogen- oder elliptischen Formen, Punkte - Zum Platzieren von Einzelpunktmarkierungen, Text - Zum Hinzufügen von Textbeschriftungen, Abmessungen - Zum Hinzufügen von gemessenen Abmessungen zu Modellen, Anordnung - Um kopierte Muster von Objekten zu erstellen, Drehen - Um Objekte in die gewünschten Winkel zu drehen, Verschieben - Um Objekte an neue Positionen zu verschieben, Skalieren - Um die Größe von Objekten größer oder kleiner zu ändern, Trimmen/Verlängern - Um Objekte zu trimmen oder zu erweitern, um andere Geometrien zu treffen, Boolesche Vereinigung/Differenz/Schnittmenge - Um Objekte zu kombinieren, zu subtrahieren oder den Schnittpunkt von Objekten zu finden, Ebenen - Um Objekte auf verschiedenen Ebenen zu organisieren, Rendern - Zum Generieren von gerenderten Ansichten mit Materialien und Beleuchtung und Exportieren - Zum Exportieren von Modellgeometrie in andere Dateiformate.
    2. Importieren Sie das Modell in eine 3D-Rendering-Software. Tragen Sie Materialien wie Kunststoff, Schwamm und Stahl auf und passen Sie dann die Beleuchtung für ein realistisches Rendering an.
      HINWEIS: Eine allgemeine Liste von Funktionsschaltflächen umfasst: Drag & Drop - Zum direkten Anwenden von Materialien auf Teile oder Modelle, indem Sie ein Material aus der Bibliothek ziehen und auf die gewünschte Komponente in der Echtzeitansicht ablegen, Rechtsklick - Wenn Sie mit der rechten Maustaste auf ein Material in der Bibliothek klicken, sehen Sie in der Regel folgende Optionen: Auf Auswahl anwenden - Wenden Sie das Material auf ein ausgewähltes Teil in der Echtzeitansicht an. Material bearbeiten - Passen Sie die Materialeigenschaften an. Materialeigenschaften (nach Auswahl eines Materials) - Zum Zugreifen auf und Ändern bestimmter Eigenschaften des Materials, z. B. Farbe, Rauheit, Brechungsindex und andere Attribute. Suchleiste - Um ein Material in der Bibliothek schnell zu finden, indem Sie seinen Namen oder die zugehörigen Schlüsselwörter eingeben. Kategorien/Ordner - Um durch verschiedene Kategorien oder Ordner von Materialien wie Metallen, Kunststoffen, Glas usw. zu navigieren. Zu Favoriten hinzufügen - Um bestimmte Materialien als Favoriten zu markieren, damit Sie in zukünftigen Sitzungen leicht darauf zugreifen können. Hotkeys - Auf einige Vorgänge kann über Hotkeys zugegriffen werden. Zum Beispiel ist M in der Regel der Hotkey, um schnell die Materialeigenschaften eines ausgewählten Teils aufzurufen.
    3. Verbessern Sie schließlich den Kontrast (+56) und die Sättigung des Bildes (Lebendigkeit +19, Sättigung +7) in Foto- und Designsoftware und fügen Sie Hintergrundelemente (Textinformationen und Farbe von weiß bis hellgrauem Verlaufshintergrund) für den Kontext hinzu, um eine hochwertige, realistische Produktdarstellung zu gewährleisten.
      1. Verwenden Sie Bild->-Anpassungen, Helligkeit/Kontrast , um den Kontrast eines Bildes anzupassen. Verwenden Sie Bild > Farbton/Sättigung , um den Sättigungsgrad des Bildes zu ändern. Verwenden Sie das Textwerkzeug (T-Symbol), um dem Bild Textinformationen hinzuzufügen.
        HINWEIS: Eine verallgemeinerte Liste von Funktionstasten enthält Ellipsenwerkzeug (U) - Zum Zeichnen von Punkten/Kreisen. Stellen Sie das Werkzeug so ein, dass es eine Form zeichnet, wählen Sie die gewünschte Füllfarbe aus und klicken und ziehen Sie dann (halten Sie die Umschalttaste gedrückt, um einen perfekten Kreis beizubehalten), um einen Punkt zu erstellen. Linienwerkzeug (U) - Zum Zeichnen gerader Linien auf dem Bild. Wählen Sie das Werkzeug aus, legen Sie die gewünschte Linienbreite fest, und klicken und ziehen Sie dann, um eine Linie zu zeichnen. Pinselwerkzeug (B) - Eine alternative Methode zum Zeichnen von Punkten und Linien. Wählen Sie die Pinselgröße und -form aus und klicken Sie (für Punkte) oder klicken und ziehen Sie (für Linien).
  3. Nach Fertigstellung des dreidimensionalen Modells wird der Zellschaber nach dem Schleif- und Montageverfahren 20,21,22 hergestellt.

3. Produktion

  1. Wenden Sie die CMF-Theorie (Color, Materials, Finish) in der aktuellen Studie an, um die Prototypen des Zellschabers zu entwerfen. Die CMF-Theorie dient als Designmethodik in der wissenschaftlichen Forschung. Es verbessert die Benutzerfreundlichkeit des Produkts, prägt die Benutzerwahrnehmung und steuert die Auswahl der Materialien 23,24,25.
    1. Wählen Sie die Farben, die im Zellschaber verwendet werden sollen, aus dem Standardfarbsystem aus, z. B. Schwarz 6 C, Kaltgrau 6 C und 11-0601TPG26,27.
    2. Um den Zellschaber zu bauen, der den Laborstandards entspricht, wählen Sie geeignete Materialien wie Polypropylen (PP), Schwamm und kohlenstoffreicher Stahl. Beginnen Sie für die Herstellung physischer Prototypen mit dem Einsatz eines 3D-Druckers, um das strukturelle Gerüst herzustellen. Verwenden Sie anschließend Verbinder oder Klebemittel, um die Montage des Schabers abzuschließen.
      HINWEIS: Um das physikalische Produkt des Zellschabers vorzubereiten, schleifen und montieren Sie die erforderlichen Materialien. Sicherheitsprotokolle müssen während des gesamten Prozesses befolgt werden, um ein sicheres und effektives Endprodukt zu gewährleisten.
    3. Fahren Sie mit dem Veredelungsprozess fort, der Schneiden, Schleifen, Polieren, Stanzen oder andere Techniken umfassen kann. Beginnen Sie damit, das Modell mit einem Schleifpapier mittlerer Körnung und 120er Körnung zu schleifen, um raue Kanten zu entfernen.
    4. Anschließend ein feines Schleifpapier der Körnung 220 auftragen, um eine glatte Oberfläche zu erhalten.
    5. Nachschleifen, um die Oberflächen zu glätten, um sicherzustellen, dass die Steckverbinder oder eingebauten Steckverbinder korrekt aufeinander abgestimmt sind.
    6. Verbinden Sie Schieber I und II sicher mit den Verbindern (festen Stangen), um eine robuste und langlebige Montage des Küvettenabstreifers zu gewährleisten. Die endgültige feste Form des Zellschabers erreichen Sie durch eine Kombination aus mechanischer Befestigung und Klebeverbindung. Verwenden Sie Befestigungselemente, insbesondere eine Einsteck- und Zapfenkonstruktion, um die Teile durch mechanische Kraft miteinander zu verbinden. Um die Festigkeit der Baugruppe zu erhöhen, tragen Sie außerdem Klebstoff (Kleber) auf, um die Komponenten weiter zu verbinden.
    7. Autoklavieren Sie den Schaber 30 Minuten lang bei 121,3 °C, um sicherzustellen, dass er seine ursprüngliche Form und seine physikalischen Eigenschaften beibehält.

4. Zellkultur

  1. Züchten Sie HOS-Zellen in einem Minimum an essentiellem Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Kultivieren Sie sie bei 37 °C mit 5 % CO2.
  2. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 2 Tage.
  3. Wenn das Zellwachstum 80 % Konfluenz übersteigt, fügen Sie 1 ml Trypsin mit 0,25 % EDTA hinzu und verdauen Sie es 60 s lang. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min für die Subkultur. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie Kulturmedium hinzu, um eine Endkonzentration von 5 x 104 Zellen pro Vertiefung zu erhalten. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler zum Zählen von Zellen.

5. Bewertung des Zellverletzungspotenzials des Zellschabers und der spitzenbasierten Methode

  1. Bereiten Sie alle Materialien für die Verwundung vor und sterilisieren Sie sie mit ultravioletter Strahlung, indem Sie sie 30 Minuten lang belichten.
  2. Nach der Sterilisation werden 100 % konfluente HOS-Zellen in 6-Well-Platten in einer Konzentration von 5 x 104 Zellen pro Well gewickelt, wobei entweder die Zellschabermethode oder die Spitzenmethode verwendet wurde.
    1. Verwenden Sie für die spitzenbasierte Methode eine 100-μl-Spitze und ziehen Sie sie mit 1 Strich in horizontaler Richtung und dem anderen in vertikaler Richtung über die Zelle mit dem Medium.
    2. Für die Zellschaber-Methode legen Sie den Schaber-Prototyp in eine der Vertiefungen und drücken mit Hilfe der Pinzette einmal vorsichtig an. Die Zellen sind verwundet. Führen Sie jedes Verwundungsexperiment in dreifacher Ausfertigung durch.
  3. Analysieren Sie alle Zellwunden mit einem digitalen Mikroskopsystem und einer Bildgebungssoftware.

6. Messung der Zellviabilität und Zellproliferation

  1. Führen Sie alle Zellviabilitätsassays gemäß dem im CCK-8 Kit enthaltenen Protokoll durch.
  2. Inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang bei 37 °C mit CCK-8-Lösung und messen Sie dann ihre Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu quantifizieren.
  3. Entwerfen Sie den Inkorporationsassay für 5-Ethinyl-20-Desoxyuridin (EdU), um die DNA-Duplikation genau zu quantifizieren und das Zellproliferationsverhältnis direkt zu quantifizieren. Bestimmen Sie den Einfluss verschiedener Methoden zur Erzeugung von Zellwunden auf die Zellproliferation mit dem EdU-Assay, gemäß dem in der vorherigen Veröffentlichungbeschriebenen Protokoll 28.
  4. Färben Sie die Zellen und bilden Sie sie mit einem digitalen Mikroskopsystem ab. Stellen Sie sicher, dass jedes Experiment in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wird.

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Ergebnisse

Die Nachfrage der Nutzer nach Werkzeugen zur Erzeugung von Zellwunden
Die derzeitige experimentelle Methode zur Erzeugung von Zellwunden muss weiter verbessert werden, um viele Probleme zu lösen, die die biologische Reproduzierbarkeit, Robustheit, den wirtschaftlichen Verbrauch und die Benutzererfahrung von Zellwundheilungsassays beeinträchtigen. Wir haben die Hard-Laddering-Methode verwendet, um die Anforderungen der an biologischen Experimenten beteiligten Benutzer anhand von Fragebögen

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Diskussion

Ziel der vorliegenden Studie war es, ein automatisches mechanisiertes Werkzeug für den Zellwundheilungsassay zu entwickeln. Nach unserem besten Wissen handelt es sich um den ersten Versuch, eine mechanisierte Antriebsstruktur anzuwenden, um Zellwunden mit einem Klick automatisch zu erzeugen. Auf diese Weise wollen wir die Mängel der traditionellen spitzenbasierten Methode beheben, wie z. B. die geringe Reproduzierbarkeit und den instabilen Kratzzustand. Ausgehend von den positiven Ergebn...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

Diese Studie wird durch den Zuschuss der National Social Science Foundation (22FYSB023), der Hubei Industrial Design Center Research Foundation (08hqt201412046) und der Humanities and Social Science Foundation des Hubei Provincial Education Department (15Y054) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CCK-8 KitBeyotime Company, ChinaC0037
digitales MikroskopsystemOlympusIX81
fötales RinderserumGibco, USA16000044
HOS Procell Life Science & Technology Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia KybernetikVersion 6.0
KeyShotLuxionVersion 11.03D-Rendering-Software
Mikroplatten-ReaderBioTek, DeutschELX808
Minimum Essential MediumGibco, USA11095080
Pantonekommerzielle Farbabstimmung
Penicillin-StreptomycinBeyotime Company, ChinaST488
PhotoshopAdobeFoto- und Designsoftware
Rhinoceros 3DRobert McNeel & AssociatesVersion 7.03D-Designsoftware
TC20 Automatisierter ZellzählerBio-RadTC20
TrypsinCytiva  HyClone, Vereinigte StaatenSH30042.01
Pantone-Matching-System

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