Ein Tool zur automatischen Erstellung stabiler und reproduzierbarer zellfreier Lücken zur Verbesserung der Zuverlässigkeit von Zellwundheilungsassays

Zusammenfassung

Durch die Einbeziehung des Interaktionserlebnisdesigns und der Analyse der Benutzeranforderungen führen wir einen innovativen Zellschaber ein, der zelluläre Wundheilungsassays in Bezug auf Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit, Praktikabilität, zelluläre Integrität und Benutzererfahrung verbessert.

Zusammenfassung

Die Zuverlässigkeit der Messung der zellulären Migration in Wundheilungsassays wird häufig durch die vorherrschende methodische Instabilität, d.h. die spitzenbasierte Methode, untergraben. Wir stellen ein innovatives Instrument vor, das diese Einschränkungen überwinden soll. Unser neuartiger Zellabstreifer übertrifft den bisherigen Ansatz und erzeugt einen konsistenteren und stabileren zellfreien Spalt. Wiederholte biologische Experimente zeigen, dass der durch den Zellschaber erzeugte zellfreie Spalt im Vergleich zur spitzenbasierten Technik geradere Kanten und eine einheitliche Größe und Form aufweist (p < 0,05). In Bezug auf das Produktdesign verfügt der Zellschaber über ein verfeinertes Farbschema, das für Laborumgebungen geeignet ist, die Überwachung der Versuchsergebnisse verbessert und die Sterilisation durch Autoklavieren zur Wiederverwendung ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass der Zellschaber nach der Behandlung einen vernachlässigbaren Effekt auf die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen zeigt (97,31 % bzw. 24,41 %). Umgekehrt führt die tip-basierte Methode zu einer geringeren Zellviabilität (91,37 %) und Proliferation (18,79 %). Diese Untersuchung stellt den Zellschaber als ein neuartiges, wiederverwendbares Gerät vor, das in der Lage ist, reproduzierbare zellfreie Lücken zu erzeugen und gleichzeitig die zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten, wodurch die Zuverlässigkeit von Wundheilungsassays im Vergleich zu bestehenden Techniken erhöht wird.

Einleitung

Tumore zeichnen sich durch unterschiedliche Merkmale aus, wie z. B. selektive Wachstumsvorteile, metabolische Neuverdrahtung und Immunmodulation, die alle faszinierenderweise zu einer verstärkten Zellmigration beitragen, einem kritischen bösartigen Verhalten von Tumorzellen. Dieses Merkmal wirkt sich direkt auf die Fernmetastasierung des Primärtumors aus und beeinträchtigt das Langzeitüberleben der Patienten ^1,2,3. Selektive Wachstumsvorteile ermöglichen es Krebszellen, normale Zellen zu verdrängen, während die metabolische Neuverdrahtung diese schnelle Proliferation unterstützt, indem sie Energiewege verändert. Gleichzeitig ermöglicht die Immunmodulation Tumoren, sich der körpereigenen Abwehr zu entziehen. Studien unterstreichen die Schwere dieses Problems und zeigen, dass Lungenmetastasen, oft eine Folge einer verstärkten Zellmigration, ein tödliches Ereignis sind, das zum Tod von Patienten mit verschiedenen Krebsarten führt⁴. So machen beispielsweise Brustkrebs⁵, Gebärmutterhalskrebs⁴ und Osteosarkom⁶ 20 %, 9 % bzw. 30 % dieser Fälle aus. Daher ist die Beurteilung der Migration von Tumorzellen zu einem integralen Bestandteil der aktuellen onkologischen Forschung geworden, was die Vielschichtigkeit der Tumorprogression weiter unterstreicht.

Der Zellwundheilungsassay ist eine einfach anzuwendende Methode zur Messung der zellulären Migration in vitro , die häufig in onkologischen Studien eingesetzt wird⁷. Die meisten Experimentatoren verwenden Pipettenspitzen, um Zellwunden manuell zu erzeugen⁸. Obwohl eine solche Methode schnell und bequem Zellwunden bilden könnte, weist sie immer noch viele Einschränkungen auf, die die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei der Bewertung der Zellmigration beeinträchtigen. Erstens wird die Verwendung von Pipettenspitzen zur manuellen Erzeugung von Kratzern stark vom Bedienwinkel, der Kraft und der Geschwindigkeit des Bedieners beeinflusst, was sich auf die Wiederholbarkeit der Methode auswirkt⁸. Zweitens haben spitzengenerierte Zelldefekte in der Regel gezackte Kanten anstelle von geraden Kanten, da Pipettenspitzen Kunststoffprodukte mit einer gewissen Elastizität sind⁹. Einige Studien erzeugen Wunden, indem vorgefertigte Kultureinsätze direkt in die Zellkulturplatte eingesetzt werden, um den Bereich der Zellproliferation einzuschränken¹⁰. Dieser Ansatz umgeht die Einschränkungen der spitzenbasierten Methode, wie z. B. gezackte Kanten und Reproduzierbarkeit. Aber auch bei biokompatiblen Materialien wirkt sich die langfristige Koexistenz der Einbettung mit den Zellen immer noch auf das Zellwachstum^{aus 11}. Darüber hinaus kann die Einbettung aufgrund der Kontaktbeschränkung auch zelluläre epigenetische Veränderungen in der Marginalzone verursachen¹². Außerdem sind Kontakteinsatze, die aus biokompatiblen Materialien hergestellt werden, teuer und schwer wiederzuverwenden, was ihre Machbarkeit einschränkt¹³. Daher wird ein neuartiges, reproduzierbares und praktisches Werkzeug benötigt, um die zelluläre Migration in vitro einfach zu quantifizieren.

Das Hauptziel dieser Methode ist es, ein innovatives Werkzeug zur Quantifizierung der zellulären Migration in vitro in onkologischen Studien einzuführen, die Grenzen bestehender Techniken zu überwinden und die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei der Beurteilung der zellulären Migration zu verbessern.

Der Grund für die Entwicklung dieser Technik liegt in der entscheidenden Bedeutung der Bewertung der Migration von Tumorzellen in der Onkologie. Tumore weisen charakteristische Merkmale auf, darunter selektive Wachstumsvorteile, metabolische Neuverdrahtung und Immunmodulation, die alle zu einer verstärkten Zellmigration beitragen, einem grundlegenden Aspekt der bösartigen Krebserkrankung. Diese Methode zielt darauf ab, ein zuverlässigeres Mittel zur Untersuchung der zellulären Migration bereitzustellen und zu einem tieferen Verständnis des Tumorverhaltens beizutragen.

Diese Methode bietet erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Techniken. Manuelle Scratch-Assays können unter bedienerabhängigen Interferenzen leiden, während Kultureinsätze das Zellwachstum und die Genexpression beeinträchtigen können. Im Gegensatz dazu bietet diese Methode eine verbesserte Wiederholbarkeit, Genauigkeit und Praktikabilität und stellt eine kostengünstige Lösung für die Messung der zellulären Migration in vitro in der onkologischen Forschung dar. Es adressiert den entscheidenden Bedarf an einem zuverlässigen und zugänglichen Werkzeug zur Untersuchung der Zellmigration bei verschiedenen Krebsarten, was es zu einer wertvollen Ergänzung des Feldes macht.

Protokoll

Alle Teilnehmer gaben eine vollständige schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Ethikzulassung war nicht anwendbar, da in der vorliegenden Studie keine tierischen oder menschlichen Gewebeproben eingeschlossen wurden.

1. Untersuchung der Anforderungen der Nutzergemeinschaft

1. Liefern Sie Fragebögen an die Biologen/Experimentatoren, die an Zellwundheilungsassays arbeiten. Sammeln Sie die ausgefüllten Fragebögen und verwenden Sie sie für die Studie. Für diese Studie wurden vom 12. Oktober 2021 bis zum 3. Februar 2022 100 Fragebögen an 100 Biologen verteilt. Der Prozentsatz der Rücklaufquote lag bei 97 %.
2. Bitten Sie die Befragten, Fragen zu beantworten wie: Welches der Zellkratzexperimente hat Sie am meisten gestört? Und mit welchem Werkzeug wurde das Cell Scratching durchgeführt? Folgen Sie diesen Fragen mit Unterfragen, um die Ursachen zu verfolgen.
3. Untersuchen Sie die Wahrnehmung von Werkzeugen wie Pipettenspitzen und Zellkultureinsätzen durch Experimentatoren in Zellwundheilungsexperimenten. Verstehen und sammeln Sie ihre Gründe für die Auswahl eines Tools gegenüber einem anderen, indem Sie die Means-End-Chain-Theorie verwenden, die auf Laddering-Techniken in den Fragebögen Abschnitt^14,15 basiert.
   HINWEIS: Die Leitermethode ist in zwei Typen unterteilt: die weiche Leitermethode mit ausführlichen Interviews und die harte Leitermethode mit Fragebögen oder Papier-und-Bleistift-Quizfragen¹⁶. Die harte Laddering-Methode war die primäre Technik, die in dieser Studie verwendet wurde. Die Means-End-Chain-Theorie legt nahe, dass das explizite Wissen der Zielnutzer oberflächlich und konkret ist, während das implizite Wissen tief und abstrakt ist 17,18,19.

2. Design und dreidimensionale Modellierung

1. Ziehen Sie eine Skizze aus den Erkenntnissen aus der vorherigen Fragebogenumfrage und initiieren Sie den Designprozess. Verwenden Sie diese vorläufige Skizze als grundlegende Blaupause.
   1. Erläutern Sie die Abmessungen und das Layout der einzelnen Komponenten, indem Sie die Funktionen "Dim", "DimRadius" und "DimDiameter" in der Modellierungssoftware anwenden.
   2. Führen Sie Messungen mit dem Messschieber mit einer Genauigkeit von 0,02 mm auf tatsächlichen 6-Well-Platten durch, um die endgültigen Abmessungen des Zellabstreifers zu ermitteln. Vergewissern Sie sich, dass diese 42,1 mm lang, 42,1 mm breit und 18,5 mm hoch sind. Achten Sie in der Designphase auf die Details, insbesondere auf die Produkthöhe und die Eignung in der Vertiefung, um eine reibungslosere Montage zu ermöglichen.
2. Erstellen Sie ein dreidimensionales Modell, und rendern Sie es.
   1. Beginnen Sie mit der 3D-Konstruktion in einer Software, indem Sie ein Basismodell erstellen. Klicken Sie auf Schaltflächen wie ExtrudeCrv zum Dehnen und Loft zum Formen des Designs. Verfeinern Sie das Modell, und klicken Sie dann auf Kante abrunden, um Kanten zu glätten.
      HINWEIS: Weitere verwendete Funktionstasten sind: Linien - Zum Zeichnen von geraden Liniensegmenten, Polylinien - Zum Erstellen von durchgehenden Linien, die aus mehreren Segmenten bestehen, Rechtecke - Zum Zeichnen von rechteckigen Formen, Kreise - Zum Zeichnen von Kreisformen, Bögen - Zum Zeichnen von Bogen- oder elliptischen Formen, Punkte - Zum Platzieren von Einzelpunktmarkierungen, Text - Zum Hinzufügen von Textbeschriftungen, Abmessungen - Zum Hinzufügen von gemessenen Abmessungen zu Modellen, Anordnung - Um kopierte Muster von Objekten zu erstellen, Drehen - Um Objekte in die gewünschten Winkel zu drehen, Verschieben - Um Objekte an neue Positionen zu verschieben, Skalieren - Um die Größe von Objekten größer oder kleiner zu ändern, Trimmen/Verlängern - Um Objekte zu trimmen oder zu erweitern, um andere Geometrien zu treffen, Boolesche Vereinigung/Differenz/Schnittmenge - Um Objekte zu kombinieren, zu subtrahieren oder den Schnittpunkt von Objekten zu finden, Ebenen - Um Objekte auf verschiedenen Ebenen zu organisieren, Rendern - Zum Generieren von gerenderten Ansichten mit Materialien und Beleuchtung und Exportieren - Zum Exportieren von Modellgeometrie in andere Dateiformate.
   2. Importieren Sie das Modell in eine 3D-Rendering-Software. Tragen Sie Materialien wie Kunststoff, Schwamm und Stahl auf und passen Sie dann die Beleuchtung für ein realistisches Rendering an.
      HINWEIS: Eine allgemeine Liste von Funktionsschaltflächen umfasst: Drag & Drop - Zum direkten Anwenden von Materialien auf Teile oder Modelle, indem Sie ein Material aus der Bibliothek ziehen und auf die gewünschte Komponente in der Echtzeitansicht ablegen, Rechtsklick - Wenn Sie mit der rechten Maustaste auf ein Material in der Bibliothek klicken, sehen Sie in der Regel folgende Optionen: Auf Auswahl anwenden - Wenden Sie das Material auf ein ausgewähltes Teil in der Echtzeitansicht an. Material bearbeiten - Passen Sie die Materialeigenschaften an. Materialeigenschaften (nach Auswahl eines Materials) - Zum Zugreifen auf und Ändern bestimmter Eigenschaften des Materials, z. B. Farbe, Rauheit, Brechungsindex und andere Attribute. Suchleiste - Um ein Material in der Bibliothek schnell zu finden, indem Sie seinen Namen oder die zugehörigen Schlüsselwörter eingeben. Kategorien/Ordner - Um durch verschiedene Kategorien oder Ordner von Materialien wie Metallen, Kunststoffen, Glas usw. zu navigieren. Zu Favoriten hinzufügen - Um bestimmte Materialien als Favoriten zu markieren, damit Sie in zukünftigen Sitzungen leicht darauf zugreifen können. Hotkeys - Auf einige Vorgänge kann über Hotkeys zugegriffen werden. Zum Beispiel ist M in der Regel der Hotkey, um schnell die Materialeigenschaften eines ausgewählten Teils aufzurufen.
   3. Verbessern Sie schließlich den Kontrast (+56) und die Sättigung des Bildes (Lebendigkeit +19, Sättigung +7) in Foto- und Designsoftware und fügen Sie Hintergrundelemente (Textinformationen und Farbe von weiß bis hellgrauem Verlaufshintergrund) für den Kontext hinzu, um eine hochwertige, realistische Produktdarstellung zu gewährleisten.
      1. Verwenden Sie Bild->-Anpassungen, Helligkeit/Kontrast , um den Kontrast eines Bildes anzupassen. Verwenden Sie Bild > Farbton/Sättigung , um den Sättigungsgrad des Bildes zu ändern. Verwenden Sie das Textwerkzeug (T-Symbol), um dem Bild Textinformationen hinzuzufügen.
         HINWEIS: Eine verallgemeinerte Liste von Funktionstasten enthält Ellipsenwerkzeug (U) - Zum Zeichnen von Punkten/Kreisen. Stellen Sie das Werkzeug so ein, dass es eine Form zeichnet, wählen Sie die gewünschte Füllfarbe aus und klicken und ziehen Sie dann (halten Sie die Umschalttaste gedrückt, um einen perfekten Kreis beizubehalten), um einen Punkt zu erstellen. Linienwerkzeug (U) - Zum Zeichnen gerader Linien auf dem Bild. Wählen Sie das Werkzeug aus, legen Sie die gewünschte Linienbreite fest, und klicken und ziehen Sie dann, um eine Linie zu zeichnen. Pinselwerkzeug (B) - Eine alternative Methode zum Zeichnen von Punkten und Linien. Wählen Sie die Pinselgröße und -form aus und klicken Sie (für Punkte) oder klicken und ziehen Sie (für Linien).
3. Nach Fertigstellung des dreidimensionalen Modells wird der Zellschaber nach dem Schleif- und Montageverfahren 20,21,22 hergestellt.

3. Produktion

1. Wenden Sie die CMF-Theorie (Color, Materials, Finish) in der aktuellen Studie an, um die Prototypen des Zellschabers zu entwerfen. Die CMF-Theorie dient als Designmethodik in der wissenschaftlichen Forschung. Es verbessert die Benutzerfreundlichkeit des Produkts, prägt die Benutzerwahrnehmung und steuert die Auswahl der Materialien 23,24,25.
   1. Wählen Sie die Farben, die im Zellschaber verwendet werden sollen, aus dem Standardfarbsystem aus, z. B. Schwarz 6 C, Kaltgrau 6 C und 11-0601TPG^26,27.
   2. Um den Zellschaber zu bauen, der den Laborstandards entspricht, wählen Sie geeignete Materialien wie Polypropylen (PP), Schwamm und kohlenstoffreicher Stahl. Beginnen Sie für die Herstellung physischer Prototypen mit dem Einsatz eines 3D-Druckers, um das strukturelle Gerüst herzustellen. Verwenden Sie anschließend Verbinder oder Klebemittel, um die Montage des Schabers abzuschließen.
      HINWEIS: Um das physikalische Produkt des Zellschabers vorzubereiten, schleifen und montieren Sie die erforderlichen Materialien. Sicherheitsprotokolle müssen während des gesamten Prozesses befolgt werden, um ein sicheres und effektives Endprodukt zu gewährleisten.
   3. Fahren Sie mit dem Veredelungsprozess fort, der Schneiden, Schleifen, Polieren, Stanzen oder andere Techniken umfassen kann. Beginnen Sie damit, das Modell mit einem Schleifpapier mittlerer Körnung und 120er Körnung zu schleifen, um raue Kanten zu entfernen.
   4. Anschließend ein feines Schleifpapier der Körnung 220 auftragen, um eine glatte Oberfläche zu erhalten.
   5. Nachschleifen, um die Oberflächen zu glätten, um sicherzustellen, dass die Steckverbinder oder eingebauten Steckverbinder korrekt aufeinander abgestimmt sind.
   6. Verbinden Sie Schieber I und II sicher mit den Verbindern (festen Stangen), um eine robuste und langlebige Montage des Küvettenabstreifers zu gewährleisten. Die endgültige feste Form des Zellschabers erreichen Sie durch eine Kombination aus mechanischer Befestigung und Klebeverbindung. Verwenden Sie Befestigungselemente, insbesondere eine Einsteck- und Zapfenkonstruktion, um die Teile durch mechanische Kraft miteinander zu verbinden. Um die Festigkeit der Baugruppe zu erhöhen, tragen Sie außerdem Klebstoff (Kleber) auf, um die Komponenten weiter zu verbinden.
   7. Autoklavieren Sie den Schaber 30 Minuten lang bei 121,3 °C, um sicherzustellen, dass er seine ursprüngliche Form und seine physikalischen Eigenschaften beibehält.

4. Zellkultur

1. Züchten Sie HOS-Zellen in einem Minimum an essentiellem Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Kultivieren Sie sie bei 37 °C mit 5 % CO₂.
2. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 2 Tage.
3. Wenn das Zellwachstum 80 % Konfluenz übersteigt, fügen Sie 1 ml Trypsin mit 0,25 % EDTA hinzu und verdauen Sie es 60 s lang. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min für die Subkultur. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie Kulturmedium hinzu, um eine Endkonzentration von 5 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung zu erhalten. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler zum Zählen von Zellen.

5. Bewertung des Zellverletzungspotenzials des Zellschabers und der spitzenbasierten Methode

1. Bereiten Sie alle Materialien für die Verwundung vor und sterilisieren Sie sie mit ultravioletter Strahlung, indem Sie sie 30 Minuten lang belichten.
2. Nach der Sterilisation werden 100 % konfluente HOS-Zellen in 6-Well-Platten in einer Konzentration von 5 x 10⁴ Zellen pro Well gewickelt, wobei entweder die Zellschabermethode oder die Spitzenmethode verwendet wurde.
   1. Verwenden Sie für die spitzenbasierte Methode eine 100-μl-Spitze und ziehen Sie sie mit 1 Strich in horizontaler Richtung und dem anderen in vertikaler Richtung über die Zelle mit dem Medium.
   2. Für die Zellschaber-Methode legen Sie den Schaber-Prototyp in eine der Vertiefungen und drücken mit Hilfe der Pinzette einmal vorsichtig an. Die Zellen sind verwundet. Führen Sie jedes Verwundungsexperiment in dreifacher Ausfertigung durch.
3. Analysieren Sie alle Zellwunden mit einem digitalen Mikroskopsystem und einer Bildgebungssoftware.

6. Messung der Zellviabilität und Zellproliferation

1. Führen Sie alle Zellviabilitätsassays gemäß dem im CCK-8 Kit enthaltenen Protokoll durch.
2. Inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang bei 37 °C mit CCK-8-Lösung und messen Sie dann ihre Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu quantifizieren.
3. Entwerfen Sie den Inkorporationsassay für 5-Ethinyl-20-Desoxyuridin (EdU), um die DNA-Duplikation genau zu quantifizieren und das Zellproliferationsverhältnis direkt zu quantifizieren. Bestimmen Sie den Einfluss verschiedener Methoden zur Erzeugung von Zellwunden auf die Zellproliferation mit dem EdU-Assay, gemäß dem in der vorherigen Veröffentlichung^{beschriebenen Protokoll 28}.
4. Färben Sie die Zellen und bilden Sie sie mit einem digitalen Mikroskopsystem ab. Stellen Sie sicher, dass jedes Experiment in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wird.

Ergebnisse

Die Nachfrage der Nutzer nach Werkzeugen zur Erzeugung von Zellwunden
Die derzeitige experimentelle Methode zur Erzeugung von Zellwunden muss weiter verbessert werden, um viele Probleme zu lösen, die die biologische Reproduzierbarkeit, Robustheit, den wirtschaftlichen Verbrauch und die Benutzererfahrung von Zellwundheilungsassays beeinträchtigen. Wir haben die Hard-Laddering-Methode verwendet, um die Anforderungen der an biologischen Experimenten beteiligten Benutzer anhand von Fragebögen^{zu analysieren 29} (Abbildung 1A). Die im Fragebogen enthaltenen Informationen, wie z. B. Namen, wurden anonymisiert, um ihre Privatsphäre zu schützen. Die Einzelheiten des Fragebogens sind in Tabelle 1 dargestellt. Während der 6-wöchigen Befragung von 100 Personen gingen 97 vollständig ausgefüllte Fragebögen ein, 3 verdächtige und ungültige Fragebögen wurden ausgeschlossen; Die Rücklaufquote lag bei 97,00 %.

Die Ergebnisse zeigen, dass die beunruhigendsten Probleme bei der Zellwundheilung die gezackte Kante (nicht gerade) und die instabile Breite oder Fläche der Wunden waren, die 55,67 % bzw. 29,90 % ausmachten. Diese waren mit 3,09 %, 5,15 % bzw. 6,19 % signifikant höher als die einer niedrigeren Zellwachstumsrate, einer Zellkontamination und anderer Optionen (p < 0,001, Abbildung 1B). Bei der Auswahl der Werkzeuge zur Herstellung von Wunden war die Verwendung von Pipettenspitzen viel häufiger als bei Zellkultureinsätzen (Abbildung 1C). Dies wurde hauptsächlich darauf zurückgeführt, dass Zellkultureinsätze eher teuer und nicht wiederverwendbar sind (Abbildung 1D), während Pipettenspitzen billig sind, experimentelle Reproduzierbarkeit (6,59%) und Zellviabilität (20,88%, Abbildung 1E) aufweisen. Wichtig ist, dass bis zu 69,23 % der Anwender argumentierten, dass der Preis für Zellkultureinsätze über ihrem Budget lag (Abbildung 1D). Im Gegensatz dazu wählten nur 6 Probanden Zellkultureinsätze, wobei nur 16,67 % ihren Preis für akzeptabel hielten (Abbildung 1F). Was das innovative Instrument zur Erzeugung von Zellwunden betrifft, so waren 86,60 % von ihnen optimistisch, während nur weniger Benutzer dagegen waren (4,12 %, Abbildung 1G).

Anschließend wurden Produkteigenschaften, die von den Nutzern dringend benötigt wurden, seziert 30,31,32. Zu diesen Merkmalen gehörten gerade Wunden, stabile Breite und Fläche der Wunden, hohe Reproduzierbarkeit und akzeptabler Preis. Dementsprechend wurden nachfolgende Konstruktionsaktivitäten durchgeführt.

Entscheidung über die Konstruktion von Elementen und Materialien, die bei der Entwicklung von Zellabstreifern verwendet werden
Die obigen Daten zeigen, dass Laborbedarf, der in der biologischen Routineforschung eingesetzt wird, streng steril sein muss, um eine Zellkontamination zu vermeiden³³. Daher sollte der vorgeschlagene Zellschaber steril sein. Obwohl Einwegwerkzeuge durch Ethylenoxid sterilisiert werden könnten, werden die Versuchskosten unweigerlich steigen 34,35,36. Daher schlagen wir vor, den Zellschaber anstelle von Einwegmaterialien mit einem wiederverwendbaren Material mit großer Toleranz gegenüber der Hochdruckdampfsterilisation (121,3 °C) zu entwickeln, um die Kosten zu senken und die Flexibilität bei der Anwendung in verschiedenen Fällen zu erhöhen³⁷. Um diese Anforderungen zu erfüllen, muss das Material, das für die Konstruktion des Zellenabstreifers verwendet wird, bestimmte physikalische und chemische Eigenschaften aufweisen, einschließlich Beständigkeit gegen Hitze, hohen Druck und Wasserdampfkorrosion.

Für den Verwendungszweck des Zellschabers sollte er neben den Grundfunktionen wie dem Herstellen der kantengeraden Wunden auch ein ansprechendes Design und eine ansprechende Farbe aufweisen. In Bezug auf die Modellierung sollte der Gesamtstil unter Berücksichtigung der Ziel- und Anwendungsfelder für die Labore kongenial sein. Das Erscheinungsbild sollte nicht zu auffällig sein, um das Personal daran zu hindern, den Versuchsverlauf zu beobachten. Darüber hinaus sollte seine Größe für Six-Well-Platten geeignet sein, und die Oberfläche sollte einen Vorsprung haben, damit die Pinzette sie stabil aufnehmen kann.

CMF im Design ist ein kritischer Aspekt des Produktdesigns, der die Ästhetik und das Benutzererlebnis beeinflusst. Die Farbwahl wirkt sich auf die emotionale Reaktion aus, die Materialauswahl wirkt sich auf Funktionalität und Nachhaltigkeit aus, und das Finish bestimmt das haptische Gefühl und die optische Attraktivität. CMF-Designer harmonisieren diese Elemente unter Berücksichtigung von Markttrends und Markenidentität, um Produkte zu schaffen, die bei den Nutzern Anklang finden.

Gemäß der CMF-Theorie wurden drei kritische Faktoren, darunter Farbe, Material und Veredelungsprozess, berücksichtigt, um ihre Auswirkungen auf Funktion und visuelle Wirkung^{zu bestimmen 24}. Zuerst wurde die Farbauswahl durchgeführt. In diesem Zusammenhang bezieht sich Farbe auf die Eigenfarbe, die die Eigenfarbe eines Objekts oder einer Substanz unter Standardlichtbedingungen ist, ohne den Einfluss externer Lichtquellen oder Reflexionen. Da die Six-Well-Platte aus PP mit transparenter Oberfläche besteht, wurde Dunkelgrau als Eigenfarbe gewählt. Diese Wahl wurde für eine einfache Identifizierung und Bedienung getroffen, da Dunkelgrau einen optimalen Kontrast und Sichtbarkeit bietet, wenn es mit anderen Farben überlagert wird. Außerdem ist es weniger wahrscheinlich, dass Dunkelgrau in Kombination mit anderen Farben Farbverzerrungen verursacht, was ebenfalls für die Beobachtung entscheidend ist. Wesentliche Funktionsbauteile wurden zusätzlich durch Schwarz unterschieden (Abbildung 2A).

Das kommerzielle Farbabstimmungssystem wurde aufgrund seiner weit verbreiteten Akzeptanz und Verwendung in verschiedenen Branchen als Standard für die Farbauswahl ausgewählt. Aufgrund der Fähigkeit des Unternehmens, konsistente Farben über verschiedene Medien hinweg zu reproduzieren, wurde es für die Studie ausgewählt, da dies für eine genaue und konsistente Farbdarstellung von entscheidender Bedeutung ist.

Die Materialauswahl erfolgte auf Basis der oben genannten Ergebnisse von Fragebögen. Die Hülle und die Komponenten des Abstreifers wurden aus einem hitzebeständigen Kunststoff, Polypropylen (PP), hergestellt, um die Anforderung der Sterilisation durch Autoklavieren zu erfüllen, wie in Abbildung 2B gezeigt. Kohlenstoffstahl eignet sich für Federn, da er korrosionsbeständig gegen hoch- und niedrigtemperaturbeständige Laborumgebungen ist. Zur Pufferung wurden Schwämme mit hoher Dichte verwendet, die am Ende der Rutsche platziert wurden.

Schließlich wurde der Veredelungsprozess entwickelt. Da der Zellschaber häufig verwendet wird und leicht zu kontaminieren ist und die Oberflächenqualität die Sterilisation beeinflusst, ist eine glatte und glänzende Oberfläche für den Zellschaber vorzuziehen, da sie dem Benutzer hilft, die Kontaminationsquelle schnell zu identifizieren und zu beseitigen, was ein Gefühl der Sauberkeit vermittelt. Die Spitzen sind teilweise geschliffen, um eine Beschädigung des Bodens der Kulturschale zu vermeiden, die die Kulturumgebung beeinträchtigen und zu einer Einschränkung der Zellproliferation führen kann³⁸.

Design und Prototyp des Zellabstreifers
Basierend auf den oben genannten Ergebnissen wurden drei Prototypen von Zellschabern entworfen (Abbildung 3A). Studien zeigen, dass die am häufigsten verwendeten Zellwunden in Zellkulturplatten kreuzförmig waren³⁹, was sich deutlich vom Prototyp I unterscheidet, der rechteckige Wunden verwendete; somit war Prototyp I verzichtet worden (Abbildung 3A). Obwohl Prototyp II und III beide kreuzförmige zellfreie Bereiche erzeugen konnten, war die Gleitschiene von Prototyp II in Zellkulturscheiben schwer zu befestigen und die Infrastruktur war ziemlich kompliziert (Abbildung 3A). Nach vorsichtigen Diskussionen wurde der Prototyp III als endgültiges Modell für die Herstellung von Zellschabern ausgezeichnet.

Angesichts der Tatsache, dass die Form der Spitzen den zellfreien Bereich in Bezug auf Kanten und Größen direkt beeinflussen könnte, wurden drei Skizzen zur Auswahl entworfen. Bei der Skizze hatte ich eine scharfe Spitze, die sehr gerade Kanten liefern konnte; Die Kulturschnittstelle, die die Zellproliferation ermöglicht, kann jedoch beeinträchtigt werden, wenn die Spitzen zu scharf sind (Abbildung 3B). Sketch II bot eine quadratische Oberseite, die eine Beeinträchtigung der Zellkulturplatten vermeiden konnte. Da die Kontaktfläche zwischen der Spitze und dem Boden der Kulturplatte jedoch quadratisch ist, ist sie bei der Verwendung instabil (Abbildung 3B). Skizze III hatte eine stumpfe, abgerundete Spitze, wodurch die oben genannten Probleme effektiv vermieden wurden (Abbildung 3C). Daher wurde es als endgültiges Design ausgewählt.

Das Design wurde in drei Aspekten optimiert: der Fixiermethode, dem eingebauten Polsterschwamm und der Leichtigkeit des Greifens. Erstens umfassten die erwarteten Produktbefestigungsmethoden das Knicken⁴⁰, das Einstecken und den Zapfen⁴¹ und das Schwenken⁴². Unter Berücksichtigung der tatsächlichen Produktionskosten und der Funktionsfähigkeit wurde unter dem kreuzförmigen Fixierer eine Klaue entwickelt, um das Einklemmen des Kantons des Bohrlochs zu erleichtern. Darüber hinaus beobachteten wir im Zellkratzheilungstest, dass die Spitzen nach dem Berühren der Wand gegen Ende aufgrund der festen Länge und Härte der Gleiter zurückprallten, was sich auf den Kratzzustand auswirkte. Deshalb haben wir am Ende des Schlittens einen Dämpfungsschwamm angebracht, um die Bewegung der Spitzen zu stabilisieren. (Abbildung 3A,C). Schließlich wurde der Vorsprung mit einer Oberflächenvertiefung versehen, um das Greifen der Pinzette zu erleichtern.

Anhand der 3D-Konstruktionssoftware wurde weiter ein dreidimensionales Modell konstruiert. Das Rendering ist in Abbildung 4A dargestellt. Das Sprengdiagramm erläutert die detaillierten inneren Strukturen des Zellschabers, die seine notwendigen Eigenschaften zeigen, die oben diskutiert wurden (Abbildung 4B). Um das Ziel eines reibungslosen Gleitens der Spitzen und geraden Kanten zu erreichen, wird zusätzlich die interne mechanische Kraftübertragungsstruktur übernommen. Die gesamte Funktionseinheit des Zellenabstreifers besteht aus dem Steuerungsteil. Bei der eigentlichen Arbeit ist der Gestängehebel im Inneren des Zellenabstreifers mit dem oberen Knopf verbunden, und das Ende bewegt sich nach unten, nachdem Druck ausgeübt wurde, um das Ende zu verbiegen. Die Feder im Inneren des Schiebers wird gelöst, um die Spitzen in Bewegung zu setzen. Schließlich stoppt es mit einem schmalen Schlitz am Schwamm, um das Schaben zu beenden, und schaltet dann bei erneuter Verwendung auf Zurücksetzen um (Abbildung 5A). Darüber hinaus sind die Leichtigkeit des Lernens und die komfortable Bedienung die Kriterien für einen Biologen, um die Produktqualität zu messen. Daher folgte die Oberflächengestaltung für die Gestaltung des Erscheinungsbildes des Produkts dem Prinzip der Symmetrie und Sauberkeit^43,44, wobei verschiedene Komponenten durch verschiedene Schwarz-, Weiß- und Grautöne unterschieden und hervorgehoben wurden (Abbildung 5A).

Der Zellschaber ist der Spitzenkratzmethode in der Praxis überlegen
Das physikalische Produkt des Zellschabers wurde im Schleif- und Montageverfahren hergestellt (Abbildung 5B). Wie erwartet ließ sich der Zellschaber hervorragend in die Sechs-Well-Platte integrieren, wobei der obere kreuzförmige Halter eng am Rand der Platte anlag und eine starke Fixierung ermöglichte (Abbildung 5C). Darüber hinaus passten die Spitzen genau an den Boden der Six-Well-Platte, was die reibungslose Erzeugung zellfreier Bereiche ermöglicht. Abschließend wurde der Zellschaber autoklaviert, um zu testen, ob er wiederverwendbar ist. Wie in Abbildung 5D gezeigt, behielt der vorliegende Zellabstreifer auch nach 30-minütigem Autoklavieren unter 121,3 °C die ursprüngliche Form und die physikalischen Leistungen bei.

Der Zellschaber übertraf im Benchmark-Test die bestehende Methode zur Erstellung von Zellwunden. Nach wiederholten Tests zeigte der Zellkratzer eine hohe Stabilität und Reproduzierbarkeit bei der Vorbereitung der Wunde, eine geringe Fluktuation im Bereich jeder Wunde und nahezu gerade Kanten mit einer Standardabweichung der zellfreien Fläche von 483,73 und einer Abweichung zur geraden Kante von 5041,33 ± 2420,00. Im Gegensatz dazu zeigte die Fläche jeder Wunde, die von den Pipettenspitzen vorbereitet wurde, eine höhere Fluktuation, mit einer Standardabweichung der zellfreien Fläche von 3905,80 und einer Abweichung zur geraden Kante von 19562,33 ± 1068,39 (Abbildung 6A-C).

Schließlich wurde der Effekt auf die Zellviabilität nach Zellwunden untersucht (Abbildung 6D). Die Ergebnisse zeigten, dass 12 h nach Abschluss der Zellwunde die Zellviabilität in der Zellschabergruppe leicht, aber signifikant höher war als in der Spitzengruppe. Ein EdU-Assay wurde durchgeführt, um diese Ergebnisse weiter zu bestätigen und den Einfluss verschiedener Methoden zur Zellwundvorbereitung auf die Zellproliferation, d.h. die DNA-Replikation, zu klären. Die Ergebnisse des EdU-Assays zeigten, dass der Prozentsatz der proliferierenden Zellen in der Zellschabergruppe (24,41 % ± 0,48) nach 12 h signifikant höher war als in der Spitzenmethode (18,79 % ± 1,46) (Abbildung 6E,F).

Diese Daten bestätigten eindeutig, dass der vorliegende Zellwundgenerator die derzeitige Methode zur Erzeugung von Zellwunden in Bezug auf Stabilität und biologische Reproduzierbarkeit übertraf. Es hatte einen geringen Einfluss auf die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen. All diese bemerkenswerten Vorteile des Zellwundgenerators bestätigten sein Potenzial, die aktuellen Zellwund-Assays zu verbessern, indem er die Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit der resultierenden Daten gewährleistet.

Abbildung 1: Analysen der Benutzeranforderungen. (A) Das Sankey-Diagramm zeigt den Arbeitsablauf der fragebogenbasierten Untersuchung für Experimentatoren. (B) bis (G) die Ergebnisse der Fragebögen, einschließlich der Fragen 1 bis 6, vorlegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Produktdesign mit verwendeten Farben und Materialien. (A) Auswahl der Farben. (B) Autoklav, der in biologischen Experimenten verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Produktdesign von Detailstrukturen. (A) Drei Prototypkandidaten für einen Zellabstreifer. (B) Drei Skizzen des Spitzendesigns. (C) Drei-Ansichten-Zeichnung des ausgewählten Prototyps III, in der sein Gesamtdesign sowie die physikalischen und räumlichen Parameter dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Darstellung des gerenderten dreidimensionalen Modells und der inneren Strukturen. (A) Darstellung des dreidimensionalen Modells. (B) Sprengplot, der die inneren Strukturen des vorgeschlagenen Zellabstreifers zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Funktionsweise des Zellabstreifers. (A) Die Skizzen zeigen, wie der Zellschaber funktioniert. (B) Physikalisches Produkt des Zellschabers. (C) Der Zellschaber passt in eine 6-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Experimentelle Validierung des Zellschabers. (A) Zellwunden, die mit verschiedenen Methoden erzeugt wurden, und ihre gruppierten Vergleichsergebnisse wurden in (B) und (C) gezeigt, der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. (D) Ergebnisse der Zellviabilität. (E) und (F) Edu-Assay-Ergebnisse beträgt der Maßstabsbalken 50 μm. Für die statistische Auswertung wurde ein t-Test für den Gruppenvergleich durchgeführt und der ursprüngliche p-Wert durch einen Holm-Bonferroni-Test angepasst, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

I) Welches der folgenden Probleme ist für Sie das beunruhigendste Problem beim Zellkratzexperiment?

A) Keine geraden Kanten

B) Instabile Breite

C) Langsame Vermehrung

D) Kontamination der Zellen

E) Sonstiges

II) Welche Werkzeuge verwenden Sie zur Erzeugung von Zellwunden?

A) Pipettenspitzen (wenden Sie sich zu Frage III)

B) Zellkultureinsätze (siehe Frage IV-V)

III) Warum entscheiden Sie sich nicht für Zellkultureinsätze?

A) Lebensfähigkeit der Zellen

B) Nicht wiederverwendbar

C) Kosten

D) Sonstiges

IV) Warum haben Sie sich für Zellkultureinsätze entschieden?

A) Kosten

b) Wiederholbarkeit

C) Sonstiges

V) Was sind Ihrer Meinung nach die schwerwiegendsten Probleme mit Zellkultureinsätzen?

A) Status der Zellen

B) Nicht wiederverwendbar

C) Teuer

D) Sonstiges

E) Zufrieden

VI) Wenn es ein kostengünstiges, wiederverwendbares (autoklavierbares), hochreproduzierbares Kratzwerkzeug gäbe, wie bereit wären Sie, es zu kaufen und zu verwenden?

A) Sehr willig

B) Bereit

C) Nicht sicher

D) Unwillig

Tabelle 1: Der in dieser Studie verwendete Fragebogen besteht aus sechs Fragen, die Situationen verstehen sollen, denen Biologen bei Zellwundheilungstests begegnen.

Diskussion

Ziel der vorliegenden Studie war es, ein automatisches mechanisiertes Werkzeug für den Zellwundheilungsassay zu entwickeln. Nach unserem besten Wissen handelt es sich um den ersten Versuch, eine mechanisierte Antriebsstruktur anzuwenden, um Zellwunden mit einem Klick automatisch zu erzeugen. Auf diese Weise wollen wir die Mängel der traditionellen spitzenbasierten Methode beheben, wie z. B. die geringe Reproduzierbarkeit und den instabilen Kratzzustand. Ausgehend von den positiven Ergebnissen und dem ermutigenden Feedback der Anwendergemeinschaft soll der Zellschaber den Experimentatoren eine effiziente und stabile Alternative zur Erzeugung von Zellwunden bieten und so das Konfidenzniveau der experimentellen Analyseergebnisse erheblich verbessern.

Für die Verwendung des vorliegenden Zellschabers sollte der Benutzer 1) Zellen vorbereiten, um eine zellfreie Lücke zu schaffen, ähnlich wie bei herkömmlichen Methoden wie der spitzenbasierten Methode, d. h. Zellen auf eine Sechs-Well-Platte mit einer bestimmten Dichte aussäen; 2) Warten Sie, bis die zelluläre Konvergenzrate > 90% erreicht; 3) Legen Sie den sterilen Zellschaber in eine Vertiefung der Platte, klicken Sie auf die Schaltfläche, wie in Abbildung 5 dargestellt, und der zellfreie Spalt wird innerhalb von 1-2 s automatisch erstellt.

Der Zellwundheilungsassay wird häufig zur Messung der Zellmigrationskapazität eingesetzt. In der Regel verwenden Experimentatoren Pipettenspitzen, um Zellwunden zu erzeugen. Zum Beispiel verwendeten Tariq et al. eine Pipettenspitze, um Zellwunden zu erzeugen, um die Zellmigrationskapazität zu beurteilen⁴⁵; Es ist kein Zufall, dass Rahimi et al. eine Pipettenspitze in einem Assay verwendeten, um die Migrationskapazität von PC3-Zellen zu beobachten⁴⁶; im mesenchymalen Zellmigrationsassay der Maus verwendeten Cormier et al. ebenfalls eine Pipettenpistole⁴⁷; Um die Wirkung von Arsen auf die Migration von Hautzellen zu demonstrieren, verwendeten Pinto et al. unter anderem eine Pipettenspitze für das vertikale Schaben⁴⁸.

Wie bereits erwähnt, birgt die Verwendung einer Spitze zur Erzeugung zellulärer Wunden jedoch mehrere Probleme, wie z. B. eine variable zellfreie Fläche, gezackte Kanten und eine Abhängigkeit von der Kraft und dem Kratzwinkel des Bedieners, was zu einer geringen Reproduzierbarkeit führt⁴⁹. Die vorliegenden Ergebnisse von Fragebögen zeigten auch, dass die tip-basierte Methode offensichtlichere Vorteile gegenüber Zellkultureinsätzen hat, insbesondere in Bezug auf den Preis, die Zellüberlebensrate und die Wiederverwendbarkeit des Werkzeugs. Alternativ sind Zelleinsätze zu teuer und schwer wiederzuverwenden, während beide Werkzeuge Mängel aufweisen. Daher ist die Nutzergemeinschaft in der Regel optimistisch und bereit, innovative Tools auszuprobieren. In dieser Studie wurde ein neues Präparationswerkzeug für zellfreie Bereiche konzipiert und entwickelt, um die Bildung von Zellwunden zu erleichtern und zu stabilisieren.

Der wichtigste Beitrag der vorliegenden Studie liegt in der Entwicklung und experimentellen Validierung von Zellschabern. Im Vergleich zu den vorangegangenen Studien umfassen die Verbesserungen des vorliegenden Zellabstreifers die folgenden drei Hauptpunkte. 1) Stabile und bequeme Herstellung von Zellwunden. Diese Studie zeigte, dass im Vergleich zur traditionellen spitzenbasierten Methode die mit dem vorliegenden Zellschaber hergestellten Zellwunden gerade Kanten aufwiesen und in wiederholten Experimenten ähnliche Wunden erzeugen konnten, was die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Zellwundheilungsexperimente erheblich verbesserte. 2) Der vorliegende Zellschaber hatte einen geringeren Einfluss auf den Zellstatus. Sie hatte keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen (DNA-Amplifikation), was deutlich besser war als die spitzenbasierte Methode. Daher wird erwartet, dass dieser Zellschaber den Einfluss externer Faktoren auf den Zellwundheilungsassay in Routineexperimenten weiter reduziert. 3) Dieser Zellenschaber ist in guter Übereinstimmung mit den Anforderungen der Benutzergemeinschaft. Die Ergebnisse der vorangegangenen Fragebogenerhebung zeigten, dass die Anforderungen der Anwender an das neue Zellwunden-Tool vor allem eine gleichmäßige Hubbreite, eine hohe Reproduzierbarkeit, ein einfaches Bedienungsverfahren und ein moderater Preis umfassen, die mit dem vorliegenden Zellschaber erreicht wurden. Darüber hinaus ist der Zellschaber in neutralen Farben gehalten, um das einfache und praktische Designkonzept dieses Produkts zu vermitteln. Gleichzeitig hebt der starke Schwarz-Weiß-Kontrast seine Funktionsbereiche wirkungsvoll hervor. Der Gesamtstil ist eine Kreuzform, die durch die abgerundete Artikulation der gekrümmten Oberfläche gebildet wird, die sich auf die herkömmliche Wickelform bezieht und die Rolle des Produkts andeutet. Der Schwierigkeitsgrad der Bedienung wird durch die Vereinfachung der Bedienung und die manuelle Rückstellfunktion reduziert. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse auf ein vielversprechendes alternatives Werkzeug für Experimentatoren hin, um Zellkratzer mit einem Klick, automatisiert und robust vorzubereiten und so die Reproduzierbarkeit wissenschaftlicher Ergebnisse zu verbessern.

Die Einschränkungen dieser Studie müssen anerkannt werden. Die Stichprobengröße der befragten Fragebögen schränkt die Verallgemeinerbarkeit dieser Studie ein; Daher werden wir die Stichprobengröße in einer Folgestudie weiter erweitern, um den Zellschaber zu verbessern. Zweitens muss der Zellkratzer in eine gut geplante Studie mit einer größeren Anwenderpopulation einbezogen werden, damit die Leistungsfähigkeit dieses Zellschabers umfassender bewertet werden kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CCK-8 Kit	Beyotime Company, China	C0037
digitales Mikroskopsystem	Olympus	IX81
fötales Rinderserum	Gibco, USA	16000044
HOS	Procell Life Science & Technology Co., Ltd	CL-0360
Image-Pro Plus	Media Kybernetik	Version 6.0
KeyShot	Luxion	Version 11.0	3D-Rendering-Software
Mikroplatten-Reader	BioTek, Deutsch	ELX808
Minimum Essential Medium	Gibco, USA	11095080
	Pantone		kommerzielle Farbabstimmung
Penicillin-Streptomycin	Beyotime Company, China	ST488
Photoshop	Adobe		Foto- und Designsoftware
Rhinoceros 3D	Robert McNeel & Associates	Version 7.0	3D-Designsoftware
TC20 Automatisierter Zellzähler	Bio-Rad	TC20
Trypsin	Cytiva  HyClone, Vereinigte Staaten	SH30042.01