Untersuchung der Initiierung des Zelltods mit einem digitalen Mikroskop

Die Kartoffel ist eine der weltweit am häufigsten angebauten Nahrungspflanzen und liegt an vierter Stelle hinter Reis, Weizen und Mais. Die Kartoffelproduktion kann jedoch durch das Kartoffelvirus Y (PVY), das derzeit als wichtigster Viruserreger gilt, stark beeinträchtigt werden ^1,2. In Kartoffelpflanzen cv. Rywal lösen mehrere PVY-Stämme (einschließlich des PVY-Stammes N-Wilga) eine durch Überempfindlichkeitsreaktion (HR) übertragene Resistenz aus, bei der sich die Beschränkung des Erregers auf den Infektionsort als nekrotische Läsionen auf inokulierten Blättern manifestiert³. In diesem Pathosystem wird die HR durch das temperaturabhängige Ny-1-Resistenzgen vermittelt, da Pflanzen, die bei niedrigeren Temperaturen angebaut werden, effizient nekrotische Läsionen entwickeln, während bei Pflanzen, die konstitutiv bei erhöhter Temperatur (28 °C) angebaut werden, der Abbruch der Resistenz als mangelnde Läsionsbildung und systemische Virusausbreitung nachgewiesen^{wird 3,4}. Wenn die Pflanzen auf eine niedrigere Temperatur (22 °C) gebracht werden, wird der Zelltod eingeleitet, was ausgenutzt werden kann, um die Geschwindigkeit der Zelltodinitiierung zu verfolgen, indem geimpfte Blätter in der Zeit zwischen der Initiierung des Zelltods und dem Auftreten des Zelltods abgebildet werden.

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Bestimmung der Zelltod-Initiierungsrate mit einem digitalen Mikroskop. Durch die Bildgebung der beimpften Blätter nach dem Transfer der Pflanze von 28 °C auf 22 °C ermöglicht ein digitales Mikroskop eine kontinuierliche Beobachtung des Blattes in gewünschten Intervallen. Im Gegensatz zur Verwendung anderer Verfahren (z. B. konfokale Mikroskopie oder Beobachtung der Läsionsbildung mit bloßem Auge) ermöglicht dies die Bestimmung des genauen Zeitpunkts der Läsionsbildung und damit der Zelltodinitiierungsrate auf Minuten genau, im Gegensatz zu Stunden bei den vorgenannten Verfahren ^5,6. Die Verwendung des digitalen Mikroskops ist zudem unabhängig vom Licht und kann daher sowohl bei Tag als auch bei Nacht eingesetzt werden. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Komponenten zu identifizieren, die an der Initiierung des Zelltods beteiligt sind, oder um die Auswirkungen verschiedener Komponenten auf die Zelltodinitiierungsrate zu bestimmen, wenn die verwendeten Pflanzen transgen sind und veränderte Mengen an Komponenten von Interesse aufweisen.

ANMERKUNG: In den Abschnitten 1 und 2 wird ein modifiziertes Protokoll für die Aufbereitung von Pflanzenmaterial beschrieben, das auf den von Lukan et ^al.7 beschriebenen Methoden basiert. Insbesondere wurden einige Modifikationen an den kontrollierten Umgebungsbedingungen und der Inokulumpräparation vorgenommen.

1. Anbau von Kartoffelpflanzen

1. Bauen Sie gesunde Kartoffeln an. Rywal-Pflanzen in Stammknoten-Gewebekultur⁸.
2. Nach 6-8 Wochen werden zehn 1 cm lange Explantate mit Nodien von Kartoffelpflanzen auf sterilem Papier unter sterilen Bedingungen mit einer sterilen Pinzette und einem Skalpellmesser abgeschnitten.
3. Füllen Sie sie in Plastikboxen mit Murashige und Skoog (MS30) Medium (Abbildung 1A) und züchten Sie sie unter kontrollierten Umgebungsbedingungen (22 °C im Licht und 19 °C im Dunkeln mit 250 μE oder μmol/m²/s Strahlung und einer 16-stündigen Photoperiode bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 % ± 5 %).
4. Setze sie 2 Wochen nach der Mikrovermehrung in den Boden um.
   1. Füllen Sie die Töpfe (r = 10 cm) mit Erde. Mache mit einem Finger ein 3-4 cm tiefes Loch in der Mitte eines Topfes in die Erde, fülle das Loch mit Wasser und warte, bis es aufgesogen ist.
   2. Setze eine Pflanze pro Topf in das Loch und lasse die Blätter über der Oberfläche. Bedecke die Wurzeln vorsichtig mit Erde (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Einige Pflanzen entwickeln möglicherweise keine Wurzeln. Schließen Sie diese Pflanzen aus der Analyse aus.
5. Züchten Sie die Pflanzen in Erde in einer Wachstumskammer unter kontrollierten Umgebungsbedingungen (22 °C im Licht und 19 °C im Dunkeln, bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 % ± 5 %, mit 250 μmol/m²/s Strahlung und einer 16-stündigen Photoperiode).
6. Nach 3-4 Wochen sind die Pflanzen reif. Verwenden Sie diese Pflanzen, um geimpft zu werden.
   HINWEIS: Die Pflanzen sollten mindestens 3-4 voll entwickelte Blätter mit sichtbaren Blättchen haben (Abbildung 1C). Sie sollten gesund aussehen und keine sichtbaren Symptome (gelbe oder braune Blätter) aufweisen, die mit Läsionen verwechselt werden könnten, die durch PBY verursacht wurden. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, sollten die Pflanzen in allen Experimenten zur gleichen Zeit (z. B. um 9 Uhr morgens) geimpft werden, um mögliche Auswirkungen des zirkadianen Rhythmus auf die Immunantwort der Pflanzen und die Bildung von Läsionen zu vermeiden 9,10,11.

2. Inokulumvorbereitung und Kartoffelimpfung

1. Die Pflanze wird mit dem PVY-Stamm N-Wilga (PVY^{N-Wi; Zugangs-Nr}. EF558545) Inokulum wie unten angegeben.
   HINWEIS: Es können mehrere Pflanzen parallel geimpft werden, wenn mehr als ein digitales Mikroskop zur Verfügung steht. Die Pflanzen sollten vor der Inokulation mindestens drei voll entwickelte Blätter haben (Abbildung 1C). PVY^N-Wi wird in der Kartoffel cv. Pentland vermehrt und gepflegt.
   1. Phosphatpuffer, ergänzt mit Natriumdiethyldithiocarbamat (DIECA), für die Inokulation vorbereiten: Mischen Sie 1,3 ml 0,2 M NaH 2 PO 4, 8,7 ml_0,2M_Na2HPO₄ und 0,225 g DIECA. Das Volumen wird mit ddH₂0 auf 100 ml aufgefüllt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein, indem Sie 1 M NaOH oder 1 M HCl-Lösung hinzufügen.
   2. Ernte 6-8 Wochen alte PVY^N-Wi infizierte Kartoffel cv. Pentlandpflanzen aus Gewebekultur in Extraktionsbeuteln mit Filternetz (0,5 g pro 6 Pflanzen) unter Zugabe von Phosphatpuffer, ergänzt mit DIECA (4x Masse Pflanzenmaterial, Masse-Volumen-Verhältnis). Verwenden Sie einen Handhomogenisator 1-2 Minuten lang, um eine homogene Lösung zu erhalten.
   3. Die ersten drei unteren, voll entwickelten Blätter von 3-4 Wochen alten Kartoffelpflanzen (ab Schritt 1.6) leicht mit Carborundumpulver bestäuben.
      HINWEIS: Passen Sie die Menge des Carborundum-Pulvers an. Zu viel kann Schäden verursachen, während zu wenig zu einer unwirksamen Infektion führen kann. Optimalerweise werden 0,1 mg/cm Carborundumpulver verwendet, was etwa 1,5 mg Pulver pro Blatt mittlerer Größe (ca. 15^cm2) entspricht.
   4. Reiben Sie die Blätter vorsichtig mit dem Inokulum (~100 μl pro Blatt) ein. Waschen Sie die Blätter nach 10 Minuten gründlich mit Leitungswasser.
      1. Achte darauf, die Blätter nicht zu beschädigen. Die Inkubationszeit darf nicht überschritten werden. Passen Sie die Menge des Inokulums entsprechend der Blattgröße an - 6,5 μl/cm, was etwa 100 μl pro Blatt durchschnittlicher Größe (ca. 15^cm2) entspricht.
   5. Bringen Sie die Pflanzen in eine Wachstumskammer und züchten Sie sie 3 Tage lang unter kontrollierten Umgebungsbedingungen (28 °C im Licht und 28 °C im Dunkeln bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 % ± 5 %, mit 250 μmol/m²/s Strahlung und einer 16 h Photoperiode).

3. Pflanzenvorbereitung und Verwendung des Digitalmikroskops zur Erfassung der Läsionsentwicklung

1. Die inokulierten Pflanzen werden 3 Tage nach der Inokulation aus der Wachstumskammer bei 28 °C in eine Wachstumskammer bei 22 °C überführt, wobei andere Bedingungen wie in Schritt 1.5 beschrieben sind.
2. Wählen Sie eine Pflanze für die Beobachtung aus. Immobilisieren Sie das zweite inokulierte Blatt mit Klebeband (Abbildung 1D). Stellen Sie sicher, dass das gewünschte Blatt vollständig immobilisiert ist, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen (Abbildung 1D).
3. Installieren Sie eine Softwareanwendung für die Bilderfassung auf dem Laptop. Schließen Sie das Digitalmikroskop an den Computer an. Öffnen Sie die Software.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gerät, das Digitalmikroskop und der Laptop auf dem Regal in der Nähe der Steckdose positioniert sind, um den Computer anzuschließen. Die Entscheidung über die Auswahl der zu überwachenden Blätter könnte von der untersuchten biologischen Fragestellung abhängen, z. B. von der Art des Prozesses, der zur Bildung eines begrenzten programmierten Zelltods führt.
4. Stellen Sie das Mikroskop über dem immobilisierten Blatt ein. Fokussieren Sie mit dem Einstellrad des Digitalmikroskops (siehe Abbildung 1E).
   1. Stellen Sie sicher, dass die Sichtlinie so breit wie möglich ist, um die Chancen zu erhöhen, die Entstehung der Läsion zu erfassen, aber immer noch groß genug ist, um das Erscheinungsbild der Läsion zu erkennen (in der Regel wird eine 25-fache Vergrößerung verwendet).
5. Legen Sie die Kameraeinstellungen fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellungen in der oberen rechten Ecke des Bildes (Abbildung 2A, eingekreister Teil 1) und passen Sie die Kameraeinstellungen an: Helligkeit (60-70), Kontrast (10-15), Farbton (0), Weißabgleich, Sättigung (45-50), Schärfe (0), Gamma (5) (Abbildung 2B). Die in dieser Studie verwendeten Einstellungen waren wie folgt: Helligkeit (64), Kontrast (14), Farbton (0), Sättigung (47), Schärfe (0), Gamma (5).
   HINWEIS: Die Kameraeinstellungen sollten an das Außenlicht angepasst werden, um die beste Bildqualität zu gewährleisten. Die Einstellungen können an die Bedingungen des Benutzers in der Wachstumskammer angepasst werden.
6. Legen Sie die Einstellungen für die Bilderfassung fest, indem Sie auf das Symbol für die Bilderfassung klicken (Abbildung 2C, eingekreist Teil 2). Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitraffervideo und stellen Sie die Bildaufnahme alle 15 Minuten für 24 Stunden ein (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Das Intervall zwischen den aufgenommenen Bildern und die Aufnahmedauer sind völlig flexibel und können an die Bedürfnisse des Experiments angepasst werden. In der Zeit zwischen den Aufnahmen ist das LED-Licht ausgeschaltet. Das LED-Licht schaltet sich während der Bildaufnahme automatisch ein.
7. Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche START klicken (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Nach dem Umtopfen von 28 °C auf 22 °C sollten die Pflanzen innerhalb von 24 Stunden beginnen, Läsionen zu entwickeln. Wenn nicht, könnte dies ein Zeichen für eine unwirksame Impfung sein. Stellen Sie die Menge des Carborundumpulvers ein, stellen Sie sicher, dass der Zeitpunkt der Inkubation des Inokulums auf den Blättern korrekt war, und bestimmen Sie die Virushäufigkeit im Inokulum mittels qPCR.
8. Um Bilder zu speichern, wählen Sie alle Bilder aus und klicken Sie auf das Symbol Speichern (Abbildung 2B, eingekreist Teil 3). Legen Sie Exportoptionen fest. Stellen Sie DPI auf maximal (300) ein (Abbildung 2D). Löschen Sie nach dem Speichern alle Bilder im Programm.
9. Für die Bildanalyse ist ein beliebiges Programm zur Bildbetrachtung/-bearbeitung ausreichend. Die Verwendung der kostenlosen Software zur Bildbearbeitung, ImageJ, wird im Folgenden erläutert.
   1. Importieren Sie die zeitliche Abfolge von Bildern aus einem einzelnen Sichtfeld (klicken Sie in der oberen linken Ecke auf Datei, wählen Sie Importieren und dann Bildsequenz aus). Fügen Sie den Pfad des Verzeichnisses der gespeicherten Bilder ein und klicken Sie auf die Schaltfläche OK , um die Konvertierung zu starten.
   2. Nach der Konvertierung öffnet die Software automatisch einen internen Videoplayer, der das endgültige Video anzeigt. Exportieren Sie die Videodatei, indem Sie auf die Option Datei > Speichern unter klicken und das AVI-Format auswählen. Es öffnet sich ein kleines Fenster. Stellen Sie die Bildrate auf 0,3 fps ein und drücken Sie OK , um das Video als AVI-Videodatei zu speichern.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt der Läsionsentwicklung kann auch bestimmt werden, indem alle Bilder manuell überprüft und ein Bild gefunden wird, auf dem die Läsion auftritt.

Diese Studie demonstriert ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Untersuchung der Initiierung des Zelltods durch das Auftreten von Läsionen auf Kartoffel-CV. Rywal, mit einem digitalen Mikroskop. Dies ermöglicht es, den exakten Zeitpunkt der programmierten Zelltodiöleitung zu bestimmen.

Pflanzen, die Wurzeln entwickelt haben, wurden 2 Wochen nach der Kartoffel in die Erde gesetzt. Rywal-Mikrovermehrung (Abbildung 1A,B). Nach 3-4 Wochen des Wachstums unter den beschriebenen Bedingungen wurden Pflanzen mit mindestens 3-4 voll entwickelten Blättern mit sichtbaren Blättchen, die gesund aussahen, ohne Anzeichen von Abszission, für die weitere Analyse verwendet (Abbildung 1C). Mit einem digitalen Mikroskop, wie in diesem Protokoll beschrieben, beobachteten wir den gleichen Bereich auf dem inokulierten Blatt in 15-Minuten-Intervallen und bestimmten das Auftreten und die zeitliche Ausdehnung der Läsion (Abbildung 3). Die Läsion trat nach 15 h 30 min auf (Abbildung 3).

Abbildung 1: Pflanzenvorbereitung für die Analyse mit einem digitalen Mikroskop . (A) Eine Kunststoffbox mit MS 30 Medium und Kartoffel-CV. Rywal-Pflanzenexplanta, die Nodien enthalten. (B) Kartoffel cv. Rywal-Pflanze in Erde (2 Wochen nach der Mikrovermehrung). (C) Kartoffel cv. Rywal-Pflanze, bereit für die Beimpfung (4 Wochen nach dem Einlegen in die Erde) mit mindestens drei voll entwickelten Blättern. (D) Zweites beimpftes Blatt (Pfeil) der Kartoffel cv. Rywal-Anlage positioniert und mit Klebeband immobilisiert (Pfeil). (E) Pflanze, die unter dem Digitalmikroskop positioniert ist, wobei der Pfeil auf das zur Fokussierung verwendete Zifferblatt zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Digitale Softwareeinstellung zur Aufzeichnung der Läsionsentwicklung. (A) Software-Schnittstelle - rot eingekreist sind Optionen für die Schaltfläche für (1) Kameraeinstellungen, (2) Bildaufnahmeeinstellungen und (3) Speichern von Bildern. (B) Fenster mit Kameraeinstellungen, das sich mit einem Klick auf (1) in Bedienfeld A öffnet. Helligkeit, Kontrast, Sättigung, Schärfe und Gamma sollten richtig eingestellt sein. (C) Fenster mit Bildaufnahmeeinstellungen, das sich mit einem Klick auf (2) öffnet, das in Feld A angegeben ist. (D) Fenster mit Bildspeichereinstellungen, das sich mit einem Klick auf (3) öffnet, das in Feld A angegeben ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Läsionsbildung auf dem inokulierten Blatt, beobachtet unter dem Digitalmikroskop. Bilder des zentralen Teils des PVY-inokulierten Kartoffelblattes bei 23,6-facher Vergrößerung unter dem Digitalmikroskop, aufgenommen in Abständen von 5 Minuten. Die inokulierten Pflanzen wurden 3 Tage lang bei 28 °C erhitzt, und am dritten Tag begann die Beobachtung mit einem digitalen Mikroskop bei 22 °C um 7:00 Uhr. (A) Um 21:02 Uhr ist die Läsion noch nicht sichtbar, (B) 90 Minuten später, um 22:32 Uhr, ist die Läsion sichtbar. (C) Die Ausdehnung der Läsion wurde um 01:02 Uhr und (D) 07:32 Uhr am nächsten Morgen beobachtet. Das Experiment wurde zweimal wiederholt, und die Läsionen traten 8 h 15 min bzw. 12 h nach Beginn des Zelltods auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.