Methodenartikel

Quantifizierung von Callose in Pflanzengeweben mittels enzymgebundener Immunsorbent-Assay/Immunfluoreszenzspektrophotometrie

DOI:

10.3791/65833

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22. Mai 2026

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1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll quantifiziert Callose in Pflanzengeweben mit der Callose-spezifischen Methode, der Immunfluoreszenzspektrophotometrie/ELISA, die auf der Bindung von Callose in den Pflanzenproben an kallosespezifische Antikörper basiert, gefolgt von der Quantifizierung gebundener Callose mittels enzymmarkierter Detektionsantikörper durch Messung der resultierenden enzymatischen Aktivität.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die bestehenden Methoden zur Callose-Quantifizierung aus Pflanzengeweben umfassen Epifluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzspektrophotometrie, Immunfluoreszenzmikroskopie und indirekte Bewertung sowohl der Callose-Synthase- als auch der β-(1,3)-Glucanase-Aktivitäten. Einige dieser Methoden haben jedoch erhebliche Einschränkungen, darunter zeitaufwendig, nicht auf Hornhaut bezogen, arbeitsintensiv, subjektiv, hohe Autofluoreszenz, geringe Sensitivität, eher qualitative als quantitative und erfordern den Erwerb von Softwareressourcen und technischen Fähigkeiten. Daher besteht ein dringender Bedarf, alternative Methoden zur Callose-Quantifizierung in Pflanzengeweben zu erforschen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Immunfluoreszenzspektrophotometrie oder der enzymgebundene Immunsorbent-Test (ELISA), der callose-spezifische Antikörper verwendet, einige der Einschränkungen der aktuellen Callose-Quantifizierungsmethoden überwinden könnte. Biotischer Stress wurde durch Inokulation von Bananenpflanzen aus Gewebekulturen mit Xanthomonas vasicola pv verabreicht. Musacearum- (Xvm)-Bakterien, die die Callose-Produktion induzierten. Bananen-Kormgewebeproben wurden 14 Tage nach der Inokulation (DPI) zur Callose-Quantifizierung mit der neuen Immunfluoreszenzspektrophotometrie-Methode entnommen. Die Calloseproduktion in den Knollen der Xvm-inokulierten und Kontrollgruppen variierte signifikant in beiden Bananengenotypen (unabhängige Probe t-Test, p < 0,05). Die hier beschriebene Methode der Immunfluoreszenzspektrophotometrie könnte zur Quantifizierung von Callose in verschiedenen Pflanzengeweben mit hoher Spezifität gegenüber Kallose, Sensitivität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit angewendet werden. Zusätzlich macht die Verwendung einer 96-Well-Platte diese Methode geeignet für hochdurchsatz Callose-Quantifizierungsstudien mit minimalen Stichproben- und Analyseverzerrungen.

Einleitung

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Callose ist ein Polysaccharid von β-1,3-Glucan, einer natürlich vorkommenden Verbindung in den Zellwänden verschiedener höherer Pflanzen. Callose wird durch Callose-Synthasen (CalS) synthetisiert und durch β-(1,3)-Glucanasen 1,2,3 abgebaut. Es ist an mehreren biologischen Prozessen beteiligt, darunter Wachstum und Entwicklung sowie Reaktion auf abiotische und biotische Belastungen 4,5,6. Während einer Krankheitserreger-Infektion hilft die Zunahme der Kalloseablagerung in den Papillen, eine weitere mikrobielle Besiedlung zu verhindern, indem sie als Permeabilitätsbarriere zwischen den benachbarten Pflanzenzellenwirkt 2,4,7,8,9,10,11,12 . Durch die Verlangsamung der Pathogeninvasion im angegriffenen Gewebe ermöglicht die Callose-Ablagerung Zeit für die Induktion zusätzlicher Abwehrreaktionen13. Eine genaue raumzeitliche Quantifizierung von Callose im Pflanzengewebe ist unerlässlich, um ihre Rolle in den verschiedenen physiologischen Prozessen zu verstehen. Die derzeitigen Methoden der Callose-Quantifizierung aus Pflanzengeweben, zu denen Epifluoreszenzmikroskopie, Immunfluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzspektrophotometrie gehören, weisen jedoch erhebliche Einschränkungen und Quantifizierungsprobleme auf. Daher besteht ein dringender Bedarf, alternative Methoden zur Callose-Quantifizierung zu erforschen, um diese Nachteile zu überwinden. Es wurde vermutet, dass die Immunfluoreszenzspektrophotometrie oder der enzymgebundene Immunsorbent-Test (ELISA) eine effizientere Methode zur Callose-Quantifizierung in Pflanzenproben bieten könnte, die hohe Spezifität, Sensitivität, Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit und eine hohe Durchsatzmethode bietet.

Die Goldstandardmethode zur Callose-Quantifizierung beinhaltet die Bildgebung von anilinblau gefärbten Callose-Partikeln mittels Epifluoreszenzmikroskopie 14,15,16,17. Die anilinblau gefärbte Callose erscheint bei der Anregung von Blau oder UV-Licht als gelbe fluoreszierende Partikel, die entweder manuell für die Anzahl der fluoreszierenden Callose-Partikel 14,15 gezählt oder von automatisierter Callose-Zählsoftware gezählt werden können. Das manuelle Zählen von Callose-Partikeln ist fürden Forscher mühsam, zeitaufwendig und subjektiv, während automatisiertes Zählen den Erwerb von Softwareressourcen und erheblichen technischen Fähigkeiten erfordert. Einige der für die automatisierte Callose-Zählung verwendeten Software sind ImageJ 19,20,21,22, Photoshop23, CalloseMeasurer24, Icy18,25 und Ilastik26. Die anilinblau gefärbte Callose kann ebenfalls mittels Fluoreszenzspektrophotometrie 17,19,27,28,29 quantifiziert werden. Die hohe Hintergrund-/Autofluoreszenzstärke, die mit Epifluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzspektrophotometrie verbunden ist, macht diese Methoden jedoch aufgrund des niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses26 schwierig und unzuverlässig. Außerdem kann Anilinblau neben Callose30 auch andere β-1,3-Glukane färben, wodurch sowohl die Epifluoreszenzmikroskopie- als auch die Fluoreszenzspektrophotometriemethoden zur Callose-Detektion und -Quantifizierung teilweise unspezifisch und unzuverlässig sind. Eine Methode der Immunfluoreszenzmikroskopie zur Callose-Quantifizierung, die auf Kallose-spezifischen Antikörpern basiert, wurde ebenfalls in mehreren Studien verwendet: 31,32,33. Obwohl diese Methode einige Nachteile mit der Epifluoreszenzmikroskopie von anilinblau gefärbter Schwiele aufweist, hat sie aufgrund der hier verwendeten Antikörper den Vorteil, dass sie hornusenspezifisch ist. Die Callose-Quantifizierung wurde ebenfalls mit enzymaktivitätsbasierten Methoden durchgeführt. Enzymbasierte Methoden zur Callose-Quantifizierung umfassen die Bewertung der Callose-Synthase (CalS)20,33 und β-(1,3)-Glucanase-Aktivitäten34,35. Die enzymaktivitätsbasierten Methoden haben mehrere Nachteile im Vergleich zur Epifluoreszenzmikroskopie, Immunfluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzspektrophotometrie. Dazu gehören die indirekte Schätzung der Kallose, die Schwierigkeit bei der Enzymextraktion und Enzymaktivitätstests sowie das Fehlen einer gleichmäßigen Verteilung von Callose im Pflanzengewebe.

Aufgrund der Nachteile der aktuellen Methoden der Callose-Quantifizierung, zu denen Epifluoreszenzmikroskopie, Immunfluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzspektrophotometrie, CalS und β-(1,3)-Glucanase-Assays gehören, bestand die Notwendigkeit, eine neue Methode der Callose-Quantifizierung zu entwickeln, die eine Reihe von Vorteilen bieten würde, darunter 1) hohe Spezifität, Sensitivität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit sowie 2) eine einfachere Calose-Quantifizierung mit hoher Durchsatzfähigkeit. Die Verwendung der Immunfluoreszenzspektrophotometrie zur Callose-Quantifizierung wurde bisher nicht untersucht. Hier wird eine neue Methode der Callose-Quantifizierung auf Basis der Immunfluoreszenzspektrophotometrie vorgestellt, genauer gesagt der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Die Methode kann für die Quantifizierung von Callose in verschiedenen Pflanzen oder deren Geweben optimiert werden, mit einer guten Spezifität gegenüber Hornhaute, Präzision, Reproduzierbarkeit und einer hohen Durchsatz-Experimentelfähigkeit. Diese Methode kann auch modifiziert werden, um jeden pflanzlichen Analyt zu quantifizieren, sofern der Antikörper gegen diesen Analyt verfügbar ist. Um eine genaue, effiziente und zuverlässige räumlich-zeitliche Verteilung von Callose in Pflanzengeweben sicherzustellen, wird empfohlen, gleichzeitig verschiedene Methoden der Callose-Quantifizierung anzuwenden, darunter Mikroskopie, Spektrophotometrie und enzymbasierte Methoden. Folglich ermöglicht dies ein präzises und effizientes Verständnis der Rolle von Callose bei verschiedenen physiologischen und Stressreaktionen.

Protokoll

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1. Impfung von Versuchspflanzen

  1. Isolieren, bereiten und bestätigen Sie das Xvm-Inokulum nach Standardverfahren36,37. Wählen Sie zufällig 10 2 Monate alte, aus Gewebekulturen abgeleitete Musa balbisiana- und Mbwazirume-Pflanzen aus und inokulieren Sie die dorsale Seite des jüngsten, vollständig offenen Blattblattblatts mit 200 μL (1 x 108 Zellen) des PCR-bestätigten Xvm-Inokulums (Abbildung 1)38.
  2. Ebenso werden zufällig 10 Musa balbisiana und Mbwazirume Bananenpflanzen ausgewählt und mit 200 μL sterilem destilliertem Wasser (SDW) inokuliert.
  3. Pflege der Xvm-impfierten und kontrollierenden Bananenpflanzen unter ähnlichen Bedingungen im Bildschirmhaus mit einer 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelphase bei 25 °C, wobei alle 3 Tage gegossen werden.
    HINWEIS: Siehe Materialtabelle und Tabelle 1 für die Liste der Materialien und Ausrüstung sowie das Rezept für Puffer.

2. Probenahme von Knallgeweben und Probenvorbereitung

  1. Führen Sie destruktive Probenahmen durch, um Kormproben von den Versuchspflanzen zu erhalten (Abbildung 1).
  2. Entfernen Sie etwa 2 g der Kormproben schnell mit sterilen chirurgischen Klingen 14 Tage nach der Impfung (DPI) und legen Sie sie einzeln in beschriftete 50-ml-Röhren. Machen Sie dies für alle 10 Proben, die jeweils von den Xvm-impfierten Pflanzen und den Kontrollpflanzen entnommen wurden.
  3. Tauchen Sie die 50-ml-Röhren mit den Proben sofort in flüssigen Stickstoff ein.
  4. Transportieren Sie die Proben ins Labor und lagern sie bei -80 °C, bis sie bereit sind, fortzufahren. Lagern Sie die Proben bei −80 °C bis zu einem Jahr oder länger mit minimalen Frost-Tau-Zyklen.
  5. Gefriertrocknen die Proben 72 Stunden lang mit einem Gefriertrockner (Abbildung 1).
  6. Geben Sie genau 30 mg der gefriergetrockneten Proben in 2-mL-Röhrchen mit 2 Stahlperlen und pulverisieren Sie sie zu feinem Pulver, wobei die Geschwindigkeit auf 5 für 1 Minute eingestellt wird (Abbildung 1).
  7. Bewahren Sie die pulverisierten Proben in einer kühlen, trockenen Umgebung bei Raumtemperatur auf, gut versiegelt, bis sie bereit zum Weiterfahren sind. Lagern Sie die pulverisierten Proben bis zu 4 Monate bei Raumtemperatur oder bis zu 1 Jahr bei −80 °C mit minimalen Frost-Tau-Zyklenvon 39,40.

3. Extraktion von Callose und Herstellung von Laminarin-Standards und Blank

  1. Um Callose aus den 30 mg der pulverisierten Kormprobe zu extrahieren, fügen Sie 800 μL 1 M NaOH hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 80 °C in einem Wasserbad, mit gelegentlichem Vortex alle 10 Minuten27,41 (Abbildung 1, Schritt 6).
  2. Lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur (ca. 5 Min) abkühlen und zentrifugieren Sie dann bei 15.294 x g für 5 Minuten.
  3. Übertragen Sie den Überstandsstoff (Callose-Extrakt) in ein steriles 2-mL-Rohr und verdünnen Sie mit dem Blockpuffer (Tabelle 1) im Verhältnis 1:2.
    HINWEIS: Wählen Sie den Verdünnungsfaktor basierend auf vorläufigen Experimenten und Optimierungen. Eine Verdünnung des Callose-Extrakts kann notwendig sein oder auch nicht. Bei Bedarf sollte die Verdünnung im Blockpuffer durchgeführt und das Verdünnungsverhältnis für verschiedene Probentypen optimiert werden, um im Bereich der Standardkurve zu liegen.
  4. Lagern Sie die Callose-Extrakte bei -20 °C, bis Sie bereit sind, fortzufahren. Lagern Sie den Callose-Extrakt bis zu 6 Monate mit minimalen Gefrier-Tau-Zyklen.
  5. Bereiten Sie einen konzentrierten Vorrat von Laminarin Standard bei 100 mg/mL in 1 M NaOH 6,42,43,44,45 vor.
    HINWEIS: Laminarin ist ein 1-3-β-Glukan-Polymer und kann als Standard für Callose-Äquivalente in der Immunfluoreszenzspektrophotometrie verwendet werden.
  6. Inkubieren Sie die resultierende Suspension des Standards bei 80 °C in einem Wasserbad und schütteln Sie sie sanft in Abständen, bis das gesamte Laminarin vollständig gelöst ist (ca. 20–40 Minuten).
  7. Kühle das gelöste Getränk auf Standardtemperatur ab (ca. 10 Minuten).
  8. Laminarin-Standards werden bei Konzentrationen von 80 mg/mL, 60 mg/mL, 40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,1 mg/mL und 0,01 mg/mL mit dem Blockpuffer vorbereitet, ausgehend vom konzentrierten Vorrat von 100 mg/mL.
  9. Bereiten Sie die Rohlinge vor, indem Sie 1 M NaOH und den Blockpuffer im Verhältnis 1:2 mischen. Wenn eine Verdünnung erforderlich ist, verwenden Sie das gleiche Verdünnungsverhältnis, das zur Herstellung des Callose-Extrakts verwendet wurde.
  10. Lagern Sie die Laminarin-Standards und die Rohlinge bei −20 °C. Lagere Standards und Rohlinge bis zu 6 Monate mit minimalen Auftauzyklen.

4. Callose-Quantifizierung durch die Immunfluoreszenzspektrophotometrie

  1. Fügen Sie 100 μL des primären Antikörpers (1-3-β-Glucan-orientiertes Maus-IgG), das mit dem Beschichtungspuffer (Tabelle 1) hergestellt wurde, zu jedem der 96 Brunnen der Polystyrol-ELISA-Platten hinzu (Abbildung 2).
  2. Versiegeln Sie den Teller fest mit einer Paraffinfolie und bebrüten Sie ihn über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank.
  3. Am nächsten Tag stellst du den Teller auf die Werkbank und lass ihn Zimmertemperatur erreichen (etwa 10 Minuten).
  4. Waschen Sie den Teller mit den üblichen Trocken- und Waschverfahren46. Kurz gesagt: Gib 200 μL des Waschpuffers (Tabelle 1) in die Bohrungen, wirbel ihn 30 Sekunden lang bei 500 U/min mit einem digitalen Shaker in Vortex und tupfe auf Seidenpapier. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass die Brunnen nicht vollständig austrocknen, und verwenden Sie eine sterile Mikropipettenspitze, um eventuelle Blasen zu entfernen, ohne die Basis und Wände der Bohrlöcher zu berühren.
  5. Fügen Sie jedem der Bohrlöcher 200 μL des Blockpuffers hinzu (Abbildung 2) und versiegeln Sie die Platte fest mit Paraffinfolie. Brüten Sie es 4 Stunden bei 37 °C ein. Waschen Sie den Teller wie oben erwähnt (Abbildung 2).
  6. Fügen Sie 100 μL des Callose-Extrakts aus den 10 Xvm-impfierten und 10 Kontrollanlagen zu den vorgesehenen Bohrungen hinzu. Fügen Sie 100 μL der Laminarin-Standards zu anderen Bohrlöchern hinzu. Fügen Sie 100 μL des Blanks zu anderen Bohrlöchern hinzu (Abbildung 2).
  7. Versiegeln Sie den Teller fest mit Paraffinfolie und bebrüten Sie ihn über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank. Waschen Sie den Teller erneut, wie oben erwähnt (Abbildung 2).
  8. Fügen Sie 100 μL des primären Antikörpers (1-3-β-Glucan-orientiertes Maus-IgG), das mit dem Blockpuffer hergestellt wurde, zu jedem der Brunnen hinzu (Abbildung 2).
  9. Versiegeln Sie die Platte fest mit einer Paraffinfolie und inkubieren Sie sie 4 Stunden bei 37 °C, dann waschen Sie die Platte wie oben angegeben (Abbildung 2).
  10. Fügen Sie 100 μL Anti-Maus-IgG-Alkaline Phosphatase-Sekundärantikörper zu jedem Bohrlochhinzu (Abbildung 2).
  11. Versiegeln Sie die Platte fest mit Paraffinfolie und lassen Sie sie über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank inkubieren. Waschen Sie dann die Platte wie oben angegeben (Abbildung 2).
  12. Fügen Sie 100 μL frisch präparierte Paranitrophenylphosphat (pNPP)-Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/mL (Tabelle 1) zu den Bohrlöchern hinzu (Abbildung 2)
  13. Inkubiere den Teller auf der Werkbank bei Zimmertemperatur für 30 Minutenund 48 Minuten.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Pflanzenproben und verwendetem Standard variieren. In dieser Studie hatte Laminarin mit 30 Minuten den besten Wert.
  14. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 100 μL frisch vorbereitete Stoplösung (0,5 M NaOH) zu jedem derBrunnen 48 hinzufügen (Abbildung 2).
  15. Übertragen Sie die Platte auf einen Mikroplattenleser (ausgegliblibert auf 37 °C), schütteln Sie sie 1 Minute mit mittlerer Geschwindigkeit und lesen Sie die Absorptionswerte bei 405 nm48 ab (Abbildung 1, Abbildung 2).

5. Datenanalyse

  1. Führen Sie eine einfache lineare Regression der Laminarinabsorption bei 405 nm gegen die Laminarinkonzentration (μg/mL) durch, um die Standardkurve zu erhalten. Die Gleichung der Standardkurve ist
    Y = β1X + β0
    wobei Y die Laminarinabsorption bei 405 nm darstellt, β1 die Steigung der Regressionslinie ist (Pearson-Korrelationskoeffizient), X Log10 (Laminarinkonzentration in μg/mL) und β0 der y-Intercept.
  2. Berechnen Sie die Callose-Konzentrationen in den Kormproben, indem Sie die Absorption des Blanks von der Absorption der Proben subtrahieren. Dann verwendet man die Standardkurve, um die Callose-Konzentration in μg/mL als laminarinäquivalent (LE) zu schätzen.
  3. Untersuchen Sie alle Daten auf Normalität der Verteilung mit dem Shapiro-Wilk-Test und prüfen Sie die Homoskedastizität der Varianzen mit dem Levene-Test (α > 0,05).
  4. Verwenden Sie den unabhängigen Stichproben-t-Test, um die Callose-Produktion zwischen der Xvm-inokulierten und der Kontrollgruppe zu vergleichen (p≤ 0,05).

Ergebnisse

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Die bekannten Konzentrationen der Laminarin-Standards wurden mittels Spektrophotometrie analysiert und ihre entsprechenden Absorptionswerte erfasst. Anhand dieser Daten wurde ein Beer-Lambert-Diagramm erstellt, indem die Konzentrationen der Laminarin-Standards auf der x-Achse und die Absorption auf der y-Achse dargestellt wurden. Die Gleichung der Regressionslinie war y = 0,5079x − 0,04534 (Abbildung 3)49. Das Beer-Lambert-Diagramm ergab einen hohen Korrelationskoeffizienten (r) von 0,9988 und einen Bestimmungskoeffizienten (r2) von 0,9975, was eine starke lineare Beziehung zwischen Konzentration und Absorption anzeigt, und bis zu 0,9975 der Varianz der abhängigen Variable (Absorption) wurde durch die unabhängige Variable (Konzentration; Abbildung 3; S<0,0001). Daher passte dieses Modell gut, war genau und zuverlässig zur Vorhersage der Konzentration von Laminarin und Hornhaute. Die Konzentration von Callose in den Bananen-Kormproben wurde durch Messung der Absorption der Kristallproben mittels Spektrophotometrie und mit den Absorptionswerten zur Berechnung der Callose-Konzentrationen mit der Gleichung bestimmt.

Der Immunfluoreszenzspektrophotometrie-Test zeigte einen signifikanten Anstieg der induzierten Callose bei Xvm-inokulierten Pflanzen im Vergleich zur Kontrollgruppe bei beiden Bananengenotypen (unabhängige Probe t-Test, p < 0,05; Abbildung 4). Die Callose-Produktion in den Kontrollanlagen mit 14 dpi betrug 1474,34 mg/mL bzw. 1037,11 mg/mL bei Mbwazirume bzw . M. balbisiana (Abbildung 4). Die Impfung der Pflanzen mit Xvm ergab 4190,78 mg/mL und 1996,07 mg/mL Callose in den Knollen von Xvm-inokulierten Mbwazirume und M. balbisiana-Pflanzchen bei 14 dpi (Abbildung 4). Die Xvm-Impfung führte zu einer 1,9- bis 2,8-fach höheren Callose-Produktion im Vergleich zu den Kontrollanlagen (unabhängige Probe t-Test, p < 0,001; Abbildung 4).

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte bei der Callose-Quantifizierung mit der neuen Immunfluoreszenzspektrophotometrie-Methode. Diese Abbildung zeigt die wichtigsten Schritte zur Callose-Quantifizierung aus Bananengeweben, darunter die Erhebung der aus Gewebekultur gewonnenen Pflanzenpflanzen, Inokulation mit Xvm, destruktive Probenahme der Kormgewebe, Gefriertrocknung der Proben, Extraktion von Callose und Quantifizierung von Callose mittels der neuen Immunfluoreszenzspektrophotometrie-Methode. Diese Zahl wurde50 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Detaillierte schematische Darstellung der Immunfluoreszenzspektrophotometriemethode zur Callose-Quantifizierung. Diese Abbildung zeigt eine detaillierte Demonstration der Immunfluoreszenzspektrophotometriemethode zur Callose-Quantifizierung, zeigt, wie die ELISA-Platte mit den verschiedenen Komponenten beladen ist und wie Callose schließlich durch die Spektrophotometrie quantifiziert wird. Diese Zahl wurde50 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Proteinquantifizierung. Das Beer-Lambert-Diagramm basiert auf Laminarin-Standards mit bekannten Konzentrationen und Absorptionswerten (bei 405 nm), die zur Berechnung der Callose-Konzentrationen (als Laminarin-Äquivalente, LE) aus den Absorptionswerten der Kormproben verwendet werden. Diese Figur wurde49 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Vergleich der Callose-Konzentration. Vergleich der mittleren Callose-Konzentrationen (mittlerer ± SEM, n = 9) in den Kormen von M. balbisiana und Mbwazirume-Bananenpflanzen, die mit Xvm impfiert wurden, bestimmt durch die neue Immunfluoreszenzspektrophotometrie-Methode (unabhängiger Proben-T-Test, α ≤ 0,05) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

PufferZusammensetzungLagerung
Blockpuffer10 g Rinderserumalbumin (BSA; 1 % w/v), gelöst in 1 L PBS.-20 °C für bis zu 6 Monate
Beschichtungspuffer1,59 g Natriumcarbonat (Na2CO3), 2,93 g Natriumbicarbonat (NaHCO3), 0,2 g Natriumazid (NaN3) lösen sich in 1 l deionisiertem H2O, pH 9,6.-20 °C für bis zu 12 Monate
Konjugierter Puffer2 g PVP (2 % W/V), gelöst in 1 l Blockpuffer.-20 °C für bis zu 6 Monate
Paranitrophenylphosphat (pNPP)-LösungLösen Sie Paranitrophenylphosphat (pNPP) im Substratpuffer auf eine Arbeitskonzentration von 1 mg/mL auf-20 °C für bis zu 12 Monate
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)8,0 g Natriumchlorid (NaCl), 0,2 g monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4), 1,15 g dibasisches Natriumphosphat (Na2HPO4), 0,2 g Kaliumchlorid (KCl), 0,2 g Natriumazid (NaN3), gelöst in 1 l deionisiertem H2O, pH 7,4.-20 °C für bis zu 12 Monate
Primärer Antikörper im BlockpufferRekonstituiert den lyophilisierten primären Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers, um den konzentrierten Bestand zu gewinnen. Verdünnen Sie den erhaltenen rekonstituierten primären Antikörperbestand im Blockpuffer auf eine Arbeitskonzentration von 2 μg/mL.-20 °C für bis zu 6 Monate
Primärer Antikörper im BeschichtungspufferRekonstituiert den lyophilisierten primären Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers, um den konzentrierten Bestand zu gewinnen. Verdünnen Sie den erhaltenen rekonstituierten primären Antikörperbestand in einem Beschichtungspuffer auf eine Arbeitskonzentration von 2 μg/mL.-20 °C für bis zu 6 Monate
Sekundärer Antikörper1:1000 des sekundären Antikörperkonzentrats: konjugierter Puffer-20 °C für bis zu 6 Monate
Substratpuffer97 ml Diethanolamin, 0,2 g Natriumazid (NaN3), lösen sich in 1 L deionisiertem H2O, pH 9,8-20 °C für bis zu 12 Monate
Waschpuffer0,5 ml Tween 20 (0,05 % v/v), gelöst in 1 L PBS, pH 7,5-20 °C für bis zu 12 Monate

Tabelle 1: Rezept für Puffer.

Diskussion

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Die Methode der Immunfluoreszenzspektrophotometrie wurde erstmals zur Quantifizierung von Callose in Bananenknollen angewandt. Es basiert auf einem Enzym-Immunoassay (EIA), der verwendet wird, um Callose im rohen 1 M NaOH-Extrakt der Banane mithilfe von Kallose-spezifischen Antikörpern 47,51,52 zu quantifizieren. Kurz gesagt beinhaltete dieser neue, auf Immunfluoreszenzspektrophotometrie basierende, kallosespezifische Quantifizierungstest die Mikroplatte mit einem kallosespezifischen Antikörper, der dann an Callose im Pflanzenextrakt bindet, gefolgt von einem sekundären Antikörper, der ebenfalls spezifisch für Kallose ist. Anschließend wird der Nachweis eines Antikörpers, der mit einem Enzym (alkalische Phosphatase) verknüpft ist, hinzugefügt und bildet einen Komplex mit dem sekundären Antikörper. Anschließend wird ein Substrat, Paranitrophenylphosphat (pNPP), hinzugefügt. Die Quantifizierung von Callose in der Probe beruht auf der Fähigkeit der alkalischen Phosphatase, die Phosphatgruppen aus pNPP-Molekülen zu spalten, was zur Bildung einer gelb gefärbten Verbindung (p-Nitrophenol) führt. Die Erkennung der Intensität der gelben Farbe erfolgte mit einem Spektrophotometer bei 405 nm, und die Absorption wurde dann mit der alkalischen Phosphataseaktivität korreliert, die direkt proportional zur Callosekonzentration in der Probe war. Die Reaktion wurde durch eine Erhöhung des pH-Werts durch Zugabe von 0,5 M NaOH gestoppt, was die weitere alkalische Phosphatase-Aktivität verhinderte.

Im Gegensatz dazu ist die Standard-Gold-Methode zur Callose-Lokalisierung und Quantifizierung die Epifluoreszenzmikroskopie-Methode, eine etablierte Methode, die auf der Färbung von Callose mit Anilinblau-Fluorochrom53 basiert. Kurz gesagt basiert diese Methode auf der spezifischen Bindung des anilinblauen Farbstoffs an Beta-1,3-Glukane (Kallose), wodurch ein Komplex entsteht. Das Anilinblau in diesem Komplex wird dann mit dem ultravioletten Licht (Wellenlänge 365–375 nm) angeregt. Wenn der anilinblaue Farbstoff angeregt wird, strahlt er blaue Fluoreszenz aus, die eingefangen wird, um eine spezifische Visualisierung von Callose in Pflanzengewebenzu ermöglichen. Die Quantifizierung von anilinblau gefärbter Callose folgt einer Reihe von Bildgebenden, die die Menge an Fluoreszenz aus den Pflanzengeweben quantifizieren. Die Fluoreszenz ist proportional zur Menge an Callose im Pflanzengewebe. Die Epifluoreszenzmikroskopie wurde zur Visualisierung und Quantifizierung von Callose bei biotischem Stresseingesetzt 54.

In einer separaten Studie wurde die Calose-Ablagerung sowohl mittels Epifluoreszenzmikroskopie als auch mit Immunfluoreszenzspektrophotometrie49 bestimmt. Obwohl einige Unterschiede in den Daten beobachtet wurden, zeigte die statistische Analyse weitgehend eine Kongruenz von Epifluoreszenzmikroskopie- und Immunfluoreszenzspektrophotometriedaten, was auf Konsistenz in den beiden Methoden der Callose-Detektion49 hinweist. Obwohl die Ergebnisse der beiden Methoden weitgehend übereinstimmen, ist es ratsam, dass sowohl Epifluoreszenzmikroskopie als auch Immunfluoreszenzspektrophotometrie sich für eine zuverlässigere Bewertung ergänzen. Obwohl die ELISA-basierte Methode wahlspezifisch, sensibel und zuverlässig ist, ist sie anfangs zeitaufwendig bei der Optimierung des Protokolls und zur Entwicklung einer bestpassenden Standardkurve, die alle Konzentrationen und Absorptionen abdeckt.

Einige der Methoden zur Callose-Quantifizierung sind aufwendig 17,32,55, zeitaufwendig 26,56, nicht Callose-spezifisch, da Anilinblau andere β-1,3-Glukane außer Callose30 verfärben kann, und teure und ausgeklügelte Callose-Zählsoftwareerfordern 23,24,26 erfordern erhebliche technische Fähigkeiten, und die hohe Hintergrund-/Autofluoreszenz, die mit der Fluoreszenzspektrophotometrie verbunden ist, macht die Callose-Quantifizierung schwierig und unzuverlässig26. Callose-Quantifizierungsmethoden, die auf einem automatisierten Bildanalyse-Workflow basieren, wie die ImageJ-Software, erfordern geeignetes Training des Bildanalyse-Plug-ins wie der Trainable Weka Segmentation (TWS) für ImageJ, und das ist sehr umständlich57.

Immunofluoreszenzspektrophotometriebasierte Tests werden aufgrund ihrer Spezifität, Empfindlichkeit, Benutzerfreundlichkeit und Reproduzierbarkeit sehr bevorzugt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Erkennungssystem und seine Empfindlichkeit je nach spezifischem Prüfprotokoll und verwendeter Ausrüstung variieren können.

Hier wird eine neue Methode der Callose-Quantifizierung auf Basis der Immunfluoreszenzspektrophotometrie beschrieben. Die hier beschriebene Methode könnte zur Quantifizierung von Callose in verschiedenen Pflanzengeweben und -arten mit zufriedenstellender Spezifität gegenüber Kallose, hoher Präzision und Reproduzierbarkeit angewendet werden. Diese Methode ergänzt die verschiedenen Callose-Quantifizierungsmethoden und kann verwendet werden, um Veränderungen der Callose-Werte während des Wachstums und der Entwicklung von Pflanzen sowie als Reaktion auf verschiedene Reize oder Behandlungen zu überwachen. Darüber hinaus reduziert die Verwendung der 96-Well-Platte subjektive Probennahmen und Analysen, wodurch die Methode für die Quantifizierung von Callose mit hohem Durchsatz geeignet ist. Bemerkenswert ist, dass Callose zwar leicht aus frisch geernteten Pflanzengewebenextrahiert werden kann, aber der Probenvorbereitungsschritt mit Gefriertrocknung gemäß diesem neuen Protokoll einen Hebel bietet, um die Proben sehr lange (bis zu einem Jahr) aufzubewahren und die Lagerung und Versand verderblicher biologischer Proben zwischen entfernten Laboren bei Umgebungstemperaturen ermöglicht. Dies ermöglicht wiederholte Callose-Extraktionen, ohne dass das gesamte Experiment wiederholt für eine frische Probenentnahme vorbereitet werden muss.

Die Immunfluoreszenzspektrophotometrie wird für Hochdurchsatz-Callose-Quantifizierungsexperimente empfohlen, während Epifluoreszenzmikroskopie und Immunfluoreszenzmikroskopie sowohl zur Quantifizierung von Callose als auch zur Histolokalisierung von Callose in Pflanzengeweben verwendet werden können. Um eine genaue, effiziente und zuverlässige räumlich-zeitliche Verteilung von Callose in Pflanzengeweben sicherzustellen, wird empfohlen, gleichzeitig verschiedene Methoden der Callose-Quantifizierung anzuwenden, darunter Mikroskopie, Spektrophotometrie und enzymbasierte Methoden. Folglich ermöglicht dies ein präzises und effizientes Verständnis der Rolle von Callose bei verschiedenen physiologischen und Stressreaktionen. Zukünftige Forschungen könnten mehrere Methoden zur Callose-Quantifizierung umfassend und gleichzeitig bewerten, darunter Epifluoreszenzmikroskopie, Immunfluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzspektrophotometrie, Immunfluoreszenzspektrophotometrie und enzymatische aktivitätsbasierte Methoden.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde von der Bill & Melinda Gates Foundation, Fördernummer INV 009894/OPP1134098, finanziert. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Planung der Studie; bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten; bei der Erstellung des Manuskripts; oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aluminiumfolie Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenia
Analytisches Gleichgewicht Mettler-Toledo AG, Greifensee, SchweizML204/01
Beadbeater 96BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK, USA1001 EUR
Löschpapier Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenia
Bovine Serum Albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USAB14
Zentrifuge, 5425REppendorf, Hamburg, Deutschland5406000240
Kombinierter Kühlschrank mit Gefrierschrank (4 & Grad; C und & Minus; 20 & Grad; C) Haier Medical and laboratory Co. Ltd., Qingda, ChinaHYCD-282
Diethanolamin  PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, Spanien191287
Digital Shaker, MixMateEppendorf, Hamburg, Deutschland5353000529
Dinatriumwasserstoffphosphat (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, Spanien141679
ELISA-Platten, 96-Well, flacher Boden, transparent, Polystyrol, HochbindungSarstedt AG & Co. KG, Nü mbrecht, Deutschland82.1581.200
Filter für den iMark-Mikroplattenleser, iMark 680, 405 nmLasec International Pty. Ltd., Kapstadt, SüdafrikaBRD1681011
Gefriertrockner, VirTis— BenchTop" K” Serien; Modell: 4KBTXLLabWrench, Kanada, USA448053
Salzsäure (HCl) PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, Spanien141020
Isothermer Zwangskonvektionsinkubator, IFA-54-8Esco Lifesciences Group, Singapur2100002
Laminarin Alfa Aesar, Massachusetts, USAJ66193
Mikrozentrifugenröhren 1,5 mL&nbl;Eppendorf, Hamburg, Deutschland022363204
Mikrozentrifugenröhren 2 mL Genesee Scientific Corp., Kalifornien, USA24– 283
Mikropipette (30 %; 300 μ L), 12-Kanal, 2100 Serien Eppendorf, Hamburg, DeutschlandEP-12-300R
Mikropipettenspitzen epT.I.P.S.  SinglesEppendorf, Hamburg, Deutschland022363204
Mikropipetten (0,5 & Strich; 1000 & mu; L), Forschung  PlusEppendorf, Hamburg, Deutschland3123000900
Mikroplatten-Absorptionsleser, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornien, USA1681135EDU
Microplate Manager 6 Version 6 Software Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornien, USA1689520
ParafilmPaul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Kö nigshofen, Deutschland740751
Paranitrophenylphosphat (pNPP)Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland20-106
pH-Messgerät, HI9126Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA02310048991
Polyvinylpyrrolidon (PVP) PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, SpanienA2260
Kaliumchlorid (KCl)PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, SpanienA2939
Kaliumdi-Wasserstoffphosphat (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, Spanien141509
Präzisionswasserbad, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Newinton, CT, USATSGP10
Primärer Antikörper (1-3-β-glucan-gerichtete Maus IgG) Bio liefert Australia Pty Ltd., Melbourne, Australien400-2
Reagenzien-Reservoirs Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA15075
Sekundärer Antikörper, konjugiert zu alkalischer Phosphatase (anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase) Sigma Life Sciences, New Jersey, USAA5153
Natriumazid (NaN3) PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, SpanienA1430
Natriumcarbonat (Na2CO3) PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, Spanien141648
Natriumchlorid (NaCl) PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, SpanienA2942
Natriumwasserstoffcarbonat (NaHCO3) PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, Spanien141638
Natriumhydroxid (NaOH)PanReac AppliChem ITW-Reagenzien, Quí mica SLU, Barcelona, Spanien141687.1210
Tween-20Biomatik Corporation, Ontario, KanadaA4031
Ultrareines, destilliertes WasserThermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA10-977-015

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Callose QuantificationCallose Specific AntibodiesFluorescence SpectrophotometryEpifluorescence MicroscopyBanana Corm TissueBiotic StressHigh Throughput Quantification
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