Methodenartikel

Modellierung fetaler Alkoholspektrumstörungen beim Zebrafisch, um den Einfluss einer ungünstigen embryonalen Umgebung auf das Sozialverhalten von Erwachsenen zu charakterisieren

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DOI:

10.3791/65834

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9. Februar 2024

 , 
1Department of Biology, University of South Dakota

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, die notwendigen Schritte zur Etablierung und Verwendung eines Assays für soziale Präferenzen für adulte Zebrafische zu skizzieren und zu zeigen, dass er zur Charakterisierung von Ethanol-induzierten sozialen Defekten verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Die fetale Alkoholspektrumstörung (FASD) beschreibt alle alkoholbedingten Geburtsfehler. Geburtsfehler wie Wachstumsstörungen, kraniotaktische, Verhaltens- und kognitive Anomalien sind mit FASD verbunden. Soziale Schwierigkeiten sind häufige Verhaltensauffälligkeiten, die mit FASD verbunden sind und oft zu ernsthaften Gesundheitsproblemen führen. Tiermodelle sind entscheidend für das Verständnis der Mechanismen, die für ethanolinduzierte soziale Defekte verantwortlich sind. Zebrafische sind soziale Wirbeltiere, die von außen befruchtete durchsichtige Eier produzieren; Diese Eigenschaften bieten den Forschern ein präzises und dennoch einfaches Verfahren zur Erstellung des FASD-Phänotyps und eines angeborenen Verhaltens, das zur Modellierung der mit FASD verbundenen sozialen Defizite genutzt werden kann. Zebrafische eignen sich daher hervorragend, um die sozialen Defizite der FASD zu charakterisieren. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, dem Benutzer einen einfachen Verhaltenstest zur Verfügung zu stellen, mit dem die Folgen einer negativen Umgebung in einem frühen Stadium der Entwicklung und die Auswirkungen, die sie auf das Sozialverhalten im Erwachsenenalter haben kann, charakterisiert werden können. Das Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung von Mutationen oder Teratogenen auf das Sozialverhalten von Erwachsenen zu charakterisieren. Das hier skizzierte Protokoll zeigt, wie das Sozialverhalten einzelner Fische während eines 20-minütigen Sozialtests charakterisiert werden kann. Darüber hinaus liefern die mit dem aktuellen Protokoll gewonnenen Daten den Hinweis, dass das Protokoll zur Charakterisierung der Auswirkungen embryonaler Ethanol-induzierter sozialer Defekte bei adulten Zebrafischen verwendet werden kann.

Einleitung

Pränatale Alkoholexposition kann zu einer Vielzahl von Geburtsfehlern führen, die als fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) bekannt sind1. Beeinträchtigtes Verhalten, wie z. B. soziale Schwierigkeiten, sind häufige Geburtsfehler im Zusammenhang mit FASD 2,3. Leider führen soziale Schwierigkeiten häufig zu schwerwiegenden psychischen Problemen4, die sich negativ auf die Lebensqualität von Menschen mit FASD auswirken können. Daher ist es von größter Bedeutung, die Mechanismen zu verstehen, die für ethanolinduzierte soziale Defekte verantwortlich sind.

Zebrafische haben biologische und verhaltensbezogene Eigenschaften, die sie gut geeignet machen, unser Verständnis der Mechanismen zu verbessern, die für ethanolinduzierte soziale Defekte verantwortlich sind. Zum Beispiel produzieren Zebrafische große Mengen an transparenten, von außen befruchteten Eiern; Diese biologischen Eigenschaften ermöglichen es den Forschern, auf einfache Weise präzise und replizierbare FASD-Phänotypen zu erstellen5. Um Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) Ethanol auszusetzen, muss man einfach ein Präpariermikroskop verwenden, um die durchsichtige Eizelle zu untersuchen und den Embryo auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Arbeiten wie Kimmel et al.6 zu inszenieren, dann die Eizelle für die gewünschte Dauer in die gewünschte Ethanolkonzentration zu bringen. Da das Chorion eine schwache Barriere für Alkoholdarstellt 7, badet das Ethanol den Embryo bereitwillig. Um die Exposition zu stoppen, muss man einfach die Eier aus der Ethanollösung nehmen. Zebrafische bieten den Forschern nicht nur eine einfache, aber genaue Methode zur Erstellung von FASD-Phänotypen, sondern ermöglichen es den Forschern auch, genetische Vergleiche mit dem Menschen anzustellen, da 70 % der menschlichen Gene einen Zebrafisch-Ortholog haben, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für das Verständnis menschlicher krankheitsbezogener Gene darstellt8. Darüber hinaus bilden Zebrafische im Gegensatz zu anderen Tiermodellen soziale Gruppen9 , die als Schwärme10 bezeichnet werden. Das Schwarmverhalten kann verwendet werden, um die Auswirkungen der embryonalen Ethanolexposition auf das Sozialverhalten zu charakterisieren11. Darüber hinaus kann bei Zebrafischen eine soziale Reaktion durch die Verwendung von computergesteuerten sozialen Reizen12 oder einem lebenden sozialen Reiz13 hervorgerufen werden.

Frühere Arbeiten haben die soziale Reaktion adulter Zebrafische in Gruppencharakterisiert 14, eine Einschränkung dieses Ansatzes ist jedoch die Unfähigkeit, das Verhalten eines einzelnen Fisches mit einem bestimmten Maß wie Veränderungen der Neurotransmitterspiegel zu korrelieren11. Das folgende Protokoll gibt den Benutzern die Möglichkeit, das Sozialverhalten eines einzelnen erwachsenen Zebrafisches zu charakterisieren. Da das Sozialverhalten für einzelne Fische erfasst wird, können die Benutzer des Protokolls nun das erworbene Verhaltensprofil jedes Fisches mit einem abhängigen Ergebnis korrelieren. Frühere Arbeiten haben beispielsweise gezeigt, dass die Exposition gegenüber embryonalem Ethanol die dopaminerge Reaktion auf einen sozialen Reiz beeinträchtigt11. Während die hier gezeigten Daten die embryonale Ethanolexposition als unabhängige Variable verwendet haben, können Protokollbenutzer die Auswirkungen anderer pharmakologischer Behandlungen oder genetischer Mutationen auf das Sozialverhalten charakterisieren. Darüber hinaus sind die Benutzer des Protokolls nicht darauf beschränkt, zu untersuchen, wie embryonale Behandlungen das Verhalten verändern, sondern können auch bestimmen, wie akute pharmakologische Behandlungen bei adulten Zebrafischen das Sozialverhalten beeinflussen15.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of South Dakota genehmigt.

1. Unterbringung, Pflege und embryonale Ethanolexposition von Zebrafischen

  1. Aufzucht und Zucht von Zebrafischen wie beschrieben16.
  2. Exposition gegenüber Ethanol
    1. Wählen Sie das geeignete Entwicklungsstadium, in dem die Ethanolexposition durchgeführt werden soll. In diesem Protokoll wurden die Embryonen mit Ethanol bei 24 hpf exponiert.
    2. Eier in 1,0 % Ethanol Volumen/Volumen für 2 h15 legen. Ein Verhältnis von 1 Ei pro ml EM ist eine gute Praxis. Konkret legen Sie die Embryonen in 50 ml Embryomedium (EM; siehe Westerfield16 für das EM-Rezept), entfernen Sie dann 500 μl EM und ersetzen Sie es durch 500 μl Ethanol.
    3. Nach der Ethanolexposition die Embryonen wie beschriebenaufziehen 17. Assay des Sozialverhaltens, wenn Fische 16 Wochen alt sind.

2. Randomisierung und Panzeraufbau

  1. Mit Hilfe eines Online-Zufallssequenzgenerators randomisieren Sie alle Versuche a priori zur Durchführung der Verhaltensassays. Achten Sie darauf, dass die Stimulusseite und die Behandlungsgruppen zufällig variieren.
  2. Um Störfaktoren wie Tageszeit oder Testtag zu vermeiden, starten und beenden Sie den Verhaltenstest jeden Tag zur gleichen Zeit und führen Sie den Verhaltenstest an aufeinanderfolgenden Tagen durch, bis alle Versuchsfische getestet wurden.
  3. Für diesen Assay (Abbildung 1) wird ein 37-Liter-Tank (50 cm x 25 cm x 30 cm, L x B x H) mit 1,4-Liter-Tanks verwendet, die entlang der Breite des Tanks nach außen gestellt werden, wie zuvor beschrieben17.
  4. Legen Sie den Rücken und den Boden des 37-Liter-Beckens mit weißer Wellpappe aus, um den Kontrast zwischen dem Versuchsfisch und dem Hintergrund zu erhöhen und so die Videoverfolgung zu verbessern.
  5. Legen Sie die Wellpappe auf die Außenwand der 1,4 L Becken, um den Kontrast des sozialen Stimulus für die Versuchsfische zu erhöhen. Legen Sie zum Schluss weißen Wellkunststoff zwischen die 1,4-Liter-Tanks und die 37-Liter-Tanks; Diese undurchsichtige Barriere wird verwendet, um zu verhindern, dass die Versuchsfische den sozialen Reiz während der Gewöhnung sehen.
  6. Platzieren Sie die Kamera in einem Abstand, der weit genug ist, um die gesamte Länge des 37-Liter-Tanks plus die Hälfte der 1,4-Liter-Becken zu erfassen und den erwachsenen Versuchsfisch genau zu verfolgen.
    HINWEIS: Wenn Sie sehen, auf welcher Seite der Stimulus gehalten wird, wird sichergestellt, dass die Forscher die Tracking-Zonen korrekt beschriftet haben, und bietet Redundanz als Backup.
  7. Wenn keine Infrarot-Nachführung verwendet wird, stellen Sie sicher, dass der 37-Liter-Tank beleuchtet ist. Verwenden Sie alle handelsüblichen Aquarienhaubenleuchten mit einer 15 W T8 Vollspektrumlampe.
    HINWEIS: Wenn mehrere Arenen eingerichtet werden, verwenden Sie identische Aquarienabdeckungen mit identischen Lampen.

3. Durchführung des Social Assays

  1. Beginnen Sie damit, den 37-Liter-Tank, der für den Verhaltenstest verwendet wird, mit Wasser zu füllen, das mit dem Wasser identisch ist, das im Gehäusegestell verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass die Wassertemperatur innerhalb von 2 °C über dem Gehäusegestell liegt.
  2. Am Ende des Tages leeren Sie den 37-Liter-Tank. Beginnen Sie jeden Testtag mit frischem Wasser. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand im 37-Liter-Tank und der Wasserstand in den 1,4-Liter-Tanks identisch sind. Wenn die Raumtemperatur das Wasser im 37-Liter-Tank nicht auf 28,5 °C bis 2 °C hält, ersetzen Sie das Wasser durch warmes Wasser mit 28,5 °C.
  3. Richten Sie als Nächstes die Interessenzonen ein. Konsultieren Sie die manuelle Tracking-Software der Wahl des Benutzers, um Zonen zu erstellen. In diesem Protokoll wurde entlang der Länge des 37-Liter-Tanks oben und unten ein Maßband verwendet, um 5-cm-Schritte zu markieren. Da der Prüfbehälter 50 cm breit ist, führen 5-cm-Schritte zu 10 Zonen mit jeweils 5 cm.
  4. Verwenden Sie die Markierungen auf dem 37-Liter-Tank als Referenz und verwenden Sie die Software, um die Zonen zu konstruieren, indem Sie den 5-cm-Punkt oben mit dem entsprechenden 5-cm-Punkt unten verbinden. Erstellen Sie zusätzlich eine Zone entlang der Unterseite und entlang des Stimulus. Passen Sie die Interessenzonen an.
  5. Verwenden Sie die Tracking-Software in diesem Protokoll, um die Entfernung von einer Zone und die in der Zone verbrachte Dauer zu messen. In diesem Protokoll wurden 12 Zonen verwendet.
  6. Quantifizieren Sie die Zeit, die in den Zonen 1 bis 10 verbracht wird, und die Entfernung vom Stimulus und den Boden als Zone 1, als die Zone, die dem Stimulus am nächsten ist, während Zone 10 am weitesten vom Stimulus entfernt ist.
  7. Wählen Sie als Nächstes die beiden Männer und zwei Frauen aus, die für den sozialen Stimulus verwendet werden sollen. Am besten verwenden Sie Männchen und Weibchen aus derselben Kohorte wie die Versuchsfische. Wenn dies nicht möglich ist, versuchen Sie, Fische zu finden, die dem Stamm, dem Alter und der Größe der Versuchsfische entsprechen.
  8. Setzen Sie die Versuchsfische aus dem Haltungsbecken in die Versuchsarena (37 L Becken) um. Verwenden Sie ein Netz, um den Fisch im Haltungsbecken zu fangen. Legen Sie das Netz mit dem Fisch darin in einen Behälter mit Fischwasser.
    HINWEIS: Die Verwendung dieses Ansatzes reduziert den Stress für Versuchsfische beim Wechsel zwischen den Aquarien.
  9. Platzieren Sie den Versuchsfisch in der Mitte der Testarena.
  10. Sobald die Erkennungseinstellungen basierend auf der vom Benutzer gewählten Software zufriedenstellend sind (siehe Benutzerhandbuch), beginnen Sie mit der 20-minütigen Testversion. Lassen Sie während der ersten 10 Minuten die undurchsichtige Barriere zwischen dem 37-Liter-Tank und dem 1,4-Liter-Tank an Ort und Stelle. Dadurch wird verhindert, dass die Versuchsfische, bestehend aus zwei männlichen und zwei weiblichen Zebrafischen, den sozialen Reiz sehen, und ermöglicht es den Fischen, sich an die Versuchsarena zu gewöhnen13,17.
  11. Entfernen Sie nach 10 Minuten vorsichtig die undurchsichtigen Barrieren, indem Sie sie hinter dem Tank hervorziehen. So können die Versuchsfische den sozialen Reiz sehen.
  12. Verwenden Sie eine Tracking-Software, um das Verhalten der Versuchsfische 11, 12, 17 auf der Grundlage der Präferenzen des Benutzers und des Softwarehandbuchs zu verfolgen und zu quantifizieren. Quantifizieren Sie im aktuellen Protokoll die Entfernung vom sozialen Reiz und dem Boden des Tanks sowie die Zeit, die Sie in allen Zonen verbracht haben.
  13. Analysieren Sie Daten mit herkömmlichen Datenanalysetools.

Ergebnisse

Abbildung 2 wurde von Fernandes et al.17 modifiziert und zeigt, dass die embryonale Ethanolexposition die Schwarmreaktion abschwächt, indem sie den Abstand zum Stimulus untersucht. Die Daten in Abbildung 2 stellen den Abstand zum sozialen Stimulus während des 20-minütigen Versuchs dar. Die Y-Achse zeigt die Entfernung in Zentimetern an, während die X-Achse den 20-minütigen Versuch zeigt, der in 1-Minuten-Intervalle unterteilt ist. Der schwarze Balken entlang der X-Achse stellt den Zeitpunkt dar, zu dem die undurchsichtigen Barrieren entfernt wurden und der soziale Reiz für die Testfische sichtbar ist. In allen Gruppen kommt es zunächst zu einer raschen Abnahme des sozialen Stimulus, sobald er sichtbar gemacht wird, was durch die steile Abnahme des Abstands zwischen Minute 9 und 10 bestimmt werden kann, während Kontrollfische jedoch sehr nah am sozialen Stimulus bleiben, ist der behandelte Alkohol nicht betroffen; Dies deutet darauf hin, dass die embryonale Ethanolexposition das Sozialverhalten von Erwachsenen beeinflusst12,18.

Abbildung 3 wurde von Fernandes et al.17 modifiziert und verwendet Daten, die durch die Messung der Entfernung zum Stimulus gesammelt wurden, um den Effekt der embryonalen Ethanolexposition auf die Schwarmreaktion weiter zu zeigen. Die Daten in Abbildung 3 stellen die Verringerung der Distanz zum sozialen Reiz dar, sobald er sichtbar ist. Berechnung der durchschnittlichen Verringerung des Abstands zum Stimulus; Die durchschnittliche Distanz zum Reiz während der Reizperiode (wenn der Reiz sichtbar ist) wurde von der durchschnittlichen Distanz zum Reiz während der Gewöhnung (wenn der soziale Reiz nicht sichtbar ist) abgezogen, so dass ein größerer negativer Wert eine stärkere soziale Reaktion darstellt.

Abbildung 4 zeigt die in den Zonen verbrachte Zeit im Vergleich zur Entfernung zum Stimulus. Abbildung 4 wurde von Fernandes et al.17 modifiziert. Abbildung 4A zeigt die Zeit, die Fische in jeder Zone (X-Achse) verbringen, während der Stimulus sichtbar ist. Während Fische aus allen Gruppen eine Präferenz für die Zone zu zeigen scheinen, die der sozialen Stimuluskontrolle am nächsten liegt, verbringen Fische im Vergleich zu alkoholbehandelten Fischen fast doppelt so viel Zeit in Zone 1 (Abbildung 4B). Abbildung 4C zeigt, dass die embryonale Ethanolexposition die Mobilität nicht beeinträchtigte, da es keinen Unterschied zwischen den Gruppen in den Zonen gab. Schließlich zeigt Abbildung 4D , dass Fische in Abwesenheit eines sozialen Stimulus keine Zeit in der Zone verbringen, die dem sozialen Stimulus am nächsten liegt. Die Ergebnisse zeigen also, dass sich Kontrollfische dem sozialen Reiz nähern und sehr nah daran bleiben, wenn sie sichtbar sind, während dies bei mit Ethanol behandelten Fischen nicht der Fall ist. Darüber hinaus deuten die in Abbildung 2 und Abbildung 4C gezeigten Daten darauf hin, dass die embryonale Ethanolexposition die Fähigkeit der Fische, den sozialen Reiz zu sehen (Abbildung 2) oder sich zu bewegen (Abbildung 4C), nicht beeinträchtigt, was einen starken Beweis dafür liefert, dass die embryonale Ethanolexposition das Sozialverhalten bei erwachsenen Zebrafischen beeinträchtigt.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Verhaltensapparates. Ein 37-Liter-Tank wurde verwendet, um das Sozialverhalten von erwachsenen Zebrafischen (mit der Bezeichnung ZT140) mit und ohne embryonale Ethanolexposition zu testen. Diese Abbildung wurde von Fernandes et al.17 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Die Exposition gegenüber embryonalem Ethanol stumpft das Sozialverhalten bei erwachsenen Zebrafischen ab. Durchschnittliche Entfernung zwischen dem adulten Versuchsfisch und dem lebenden Schwarm, aufgetragen für 1-Minuten-Intervalle der 20-minütigen Verhaltenssitzung. Mittlere ± SEM werden angezeigt. Steuerung (n = 12); 1 % Ethanol (EtOH; n = 11). Der horizontale Balken über der X-Achse, von 10 bis 20 Minuten, zeigt eine Zeitleiste, in der der lebende Schwarm für die Versuchspersonen sichtbar ist. Die Alkoholkonzentration wird über den Grafiken angezeigt. Diese Abbildung wurde von Fernandes et al.17 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Mit Alkohol behandelte Fische sind deutlich weiter vom lebenden Schwarm entfernt. Die Balken stellen die Differenz zwischen dem Abstand der Fische vom lebenden Schwarm vor und nach dem sichtbaren lebenden Schwarm dar. Größere negative Werte deuten auf eine stärkere Reaktion auf die Artgenossen hin. Mittlere ± SEM werden angezeigt. Mittlere ± SEM werden angezeigt. Steuerung (n = 12); 1 % Ethanol (EtOH; n = 11). Diese Abbildung wurde von Fernandes et al.17 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Die Exposition mit embryonalem Ethanol verändert die Dauer der Verweildauer in Zone 1 nur dann, wenn der lebende Schwarm sichtbar ist. (A) Die Balken repräsentieren die Zeit, die in allen 10 Zonen während der Stimuluspräsentation verbracht wird. (B) Balken stellen die Zeit dar, die während der Stimuluspräsentation in Zone 1 verbracht wurde. Zone 1 ist die Zone, die dem lebenden Schwarm am nächsten liegt, während Zone 10 am weitesten vom lebenden Schwarm entfernt ist. Beachten Sie den signifikanten Unterschied in der Zeit, die Fischkontrollfische in der Zone verbringen. (C) Balken stellen den durchschnittlichen Prozentsatz der Zeit dar, die während der Gewöhnung in allen Zonen verbracht wurde, die ersten 10 Minuten. (D) Balken stellen die Zeit dar, die während der Gewöhnung in Zone 1 verbracht wurde. Mittlere ± SEM werden angezeigt. Die Stichprobengrößen lauten wie folgt: Kontrolle (n = 12); Ethanol (EtOH; n = 11). Diese Abbildung wurde von Fernandes et al.17 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Zebrafische haben eine Reihe von biologischen und verhaltensbezogenen Merkmalen, die sie zu einem äußerst attraktiven Organismus für die Erforschung von Genen, Umwelt und Verhalten machen 5,19. Dieses Protokoll gibt dem Endbenutzer einen relativ einfachen Leitfaden zur Beurteilung des Sozialverhaltens, mehrere Möglichkeiten zur Quantifizierung des Sozialverhaltens und hat das Potenzial, die Verhaltensreaktionen einzelner Fische mit Behandlungen wie embryonaler Ethanolexposition, genetischen Mutationen oder anderen pharmakologischen Substanzen zu verknüpfen.

Um das Sozialverhalten bei adulten Zebrafischen zu bestimmen, befolgen Sie sorgfältig dieses Protokoll in Verbindung mit dem Benutzerhandbuch der Tracking-Software Ihrer Wahl. Für den Bau der Testarena braucht man lediglich einen 37-Liter-Tank mit Deckel und leichtem Wellpapp, zwei kleinere Tanks für den sozialen Stimulus und eine Kamera; Die meisten dieser Artikel können in Zoohandlungen und bei großen Einzelhändlern gekauft werden. Wenn ein einzelner Zebrafisch mit einer Gruppe von Zebrafischen konfrontiert wird, besteht das natürliche Verhalten des einzelnen Zebrafisches darin, den Abstand zur Gruppe zu verringern und gleichzeitig die Zeit zu erhöhen, die er in unmittelbarer Nähe der Gruppeverbringt 19. Dieses Verhalten wird als Schwarmreaktion19 bezeichnet. Die Schwarmreaktion ist ein soziales Verhalten, das auf zwei Arten charakterisiert werden kann: Erstens, wenn der soziale Reiz sichtbar ist, messen Sie den Abstand zwischen dem sozialen Reiz und dem einzelnen Fisch12 und zweitens messen Sie die Zeit, die in der Zone verbracht wird, die dem sozialen Reiz am nächsten ist, wenn er sichtbar ist. Die Fähigkeit, die Zeit zu quantifizieren, die Zebrafische in einer 5-cm-Zone verbringen, wenn der soziale Reiz sichtbar ist, ist ein starker Beweis für die soziale Reaktion, da diese Fische im Durchschnitt etwa 4 cm lang sind.

Die Unterteilung des 50-cm-Beckens in 10, 5 cm große Bereiche hilft bei der statistischen Analyse, da die Wahrscheinlichkeit, dass sich der Testfisch in jeder Zone aufhält, gleich ist. Auf den ersten Blick scheint es überflüssig zu sein, zwei Messungen für das gleiche Ergebnis zu haben. Redundanz kann jedoch eine Validierung bieten. Zusätzlich können die Abstands- und Dauermessungen während der Gewöhnung verwendet werden, um festzustellen, ob eine Behandlung das Sehvermögen oder die Bewegung beeinflusst. Dieses Protokoll verwendet eine kommerziell erhältliche automatisierte Tracking-Software13,18, ist aber auch für andere Tracking-Systeme oder sogar für die manuelle Verfolgung durch einen geschulten Beobachter zugänglich.

Unabhängig von der verwendeten Tracking-Software müssen wichtige Schritte unternommen werden, um das Tracking zu optimieren. Wählen Sie zunächst einen Hintergrund aus, der einen signifikanten Kontrast zu dem aufgenommenen Fisch bietet. Wildtyp-Zebrafische haben horizontale Streifen, die golden und blau sind20; Sie haben auch Mosaike aus gelben Xanthophoren, silbrigen oder blauen Iridophoren und schwarzen Melanophoren20. So verwenden Wildtyp-Fische bei der Charakterisierung des Verhaltens von AB-Wildtyp-Fischen einen weißen Hintergrund 12,13,17, zum anderen bei der Charakterisierung des Sozialverhaltens eines Casper-Zebrafisches, dem Pigment fehlt, einen schwarzen Hintergrund17. Stellen Sie zweitens sicher, dass genügend Licht vorhanden ist, um die Versuchsfische zu verfolgen. Wenn es mehrere Tracking-Arenen gibt, stellen Sie sicher, dass die Beleuchtung der Arenen identisch ist. Ein weiterer kritischer Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass der Wasserstand im 37-Liter-Becken mit dem Wasserstand in den 1,4-Liter-Becken übereinstimmt, um sicherzustellen, dass die Testfische nicht in Bereichen schwimmen können, in denen es keinen sozialen Reiz gibt. Stellen Sie außerdem sicher, dass sich der 1,4-Liter-Tank bei der Aufnahme der Videos im Bild befindet. Auf diese Weise steht ein Backup zur Verfügung, falls eine manuelle Codierung der Daten erforderlich ist oder eine Überprüfung der Stimulusseite erforderlich ist.

Typische Probleme innerhalb des Protokolls sind die nicht korrekte Verfolgung des Motivs, eine unzureichende Gewöhnungszeit und eine kurze Zeitverzögerung beim Ziehen der undurchsichtigen Barrieren, wenn mehrere Arenen eingerichtet sind. Um zu vermeiden, dass das Motiv nicht korrekt verfolgt wird, stellen Sie sicher, dass der Kontrast zwischen dem Fisch und dem Hintergrund ausreichend ist, wie bereits erwähnt, und befolgen Sie die Richtlinien der Software. Wenn die Software des Benutzers Infrarot-Tracking zulässt, kann dies außerdem Probleme im Zusammenhang mit dem Kontrast lindern. Während 10 Minuten für eine Gewöhnungsphase eine lange Zeit zu sein scheinen, deutet unsere unveröffentlichte Arbeit darauf hin, dass sich die Verkürzung der Gewöhnungszeit negativ auf das Protokoll auswirkt. Wenn schließlich die undurchsichtige Barriere zwischen den 37-Liter- und 1,4-Liter-Tanks manuell gezogen wird und mehrere Arenen aufgestellt sind, können nicht alle Barrieren gleichzeitig gezogen werden, es sei denn, mehrere Personen ziehen an den Barrieren. Wenn nur eine Person den Assay durchführt, sollte alternativ ein Gegengewicht dazu geschaffen werden, welche Arenabarrieren zuerst gezogen werden.

Obwohl das Protokoll einfach ist, sind die Kosten für die Tracking-Software und der zusätzliche Zeitaufwand für die individuelle Charakterisierung der Fische potenzielle Fallstricke. Dieses Protokoll verwendete kommerziell erhältliche Software, um das Verhalten von Versuchsfischen zu verfolgen, was eine Verzerrung des Beobachters vermeidet und den Durchsatz erhöht, indem mehrere Arenen eingerichtet und somit mehrere Fische aufgezeichnet werden. Obwohl in diesem Protokoll kommerzielle Software verwendet wurde, gibt es auch andere Tracking-Software, einschließlich kostenloser Software. Wenn Sie dieses Protokoll mit dem vom Endbenutzer gewählten Tracking verwenden, wird der Social-Media-Assay reproduziert. In diesem Protokoll wurde das Verhalten eines einzelnen Fisches charakterisiert; Andere haben sich auf die Untersuchung von Gruppen von Zebrafischen14 konzentriert, was eine Möglichkeit ist, die potenzielle Falle zu lösen, die mit der Charakterisierung eines Fisches nach dem anderen verbunden ist. Alternativ kann, wie bereits erwähnt, die gleichzeitige Verwendung mehrerer Testarenen den Durchsatz erhöhen und gleichzeitig die Möglichkeit erhalten, einem einzelnen Fisch ein Verhaltensprofil zuzuweisen. Die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, ein Verhaltensprofil eines einzelnen Fisches zu korrelieren, ist wichtig, da dies dem Forscher die Möglichkeit gibt, nach Variabilität innerhalb einer Behandlungsgruppe zu suchen. Obwohl die embryonale Ethanolexposition in den repräsentativen Daten als unabhängige Variable verwendet wurde, beschränken sich zukünftige Anwendungen der im aktuellen Protokoll beschriebenen Technik nicht auf die bloße Charakterisierung der Auswirkungen der embryonalen Ethanolexposition auf das Sozialverhalten. So kann man z. B. bestimmen, wie sich genetische Mutationen21 oder andere pharmakologische Behandlungen22 auf das Sozialverhalten auswirken. Darüber hinaus können zukünftige Arbeiten neben der embryonalen Ethanolexposition auch die Wirkung anderer Teratogene auf das Sozialverhalten charakterisieren. Daher ist das derzeitige Protokoll für jeden Forscher nützlich, der daran interessiert ist, zu verstehen, wie Gene und/oder die Umwelt das Sozialverhalten beeinflussen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Finanzierung dieser Forschung wurde von den National Institutes of Health (NIH)/National Institute on Alcohol Abuse (NIAAA) [R00AA027567] für Y.F. bereitgestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,4 l ZT140 AquaneeringAquaneering AquaneeringZT140 Panzer für soziale Anreize
Aqueon 20" Deluxe fluoreszierendes Vollhauben-Aquarienlichthttps://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740Licht für das 37-I-Aquarium
Aqueon Standard Open-Glass Aquarium Tank, 10 Gallonenhttps://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-17091737-l-Tank für den Social Assay
Ethanol Fisher Scienticfic 
Ethovision XT Tracking-Systemhttps://www.noldus.com/ethovision-xt
R-Capable Color Basler GigE Kamerahttps://www.noldus.com/ethovision-xt
weißer WellpappeKunststoff zur Auskleidung des Rückens und des Bodens des 37-I-Tanks und der Rückseite der Tanks, die für den sozialen Stimulus verwendet werden
BP28184 https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Zebrafisch Modellembryonale Ethanol ExpositionAssay zum SozialverhaltenGen Umwelt InteraktionVerhaltensdefiziteautomatisiertes TrackingCRISPR Technologiesozialer StimulusSchwarmreaktion
Modellierung fetaler Alkoholspektrumstörungen beim Zebrafisch, um den Einfluss einer ungünstigen embryonalen Umgebung auf das Sozialverhalten von Erwachsenen zu charakterisieren
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