Chemische affinitätsbasierte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Bioflüssigkeiten für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse

Summary

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) aus Bioflüssigkeiten haben in jüngster Zeit im Bereich der Flüssigbiopsie große Aufmerksamkeit erlangt. Sie werden von fast allen Zelltypen freigesetzt, liefern eine Echtzeit-Momentaufnahme der Wirtszellen und enthalten eine Fülle molekularer Informationen, darunter Proteine, insbesondere solche mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung, als Hauptakteur der zellulären Funktionen und des Ausbruchs und Fortschreitens von Krankheiten. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Bioflüssigkeiten ist jedoch aufgrund der geringen Ausbeuten und Verunreinigungen der derzeitigen Isolationsmethoden für Elektrofahrzeuge nach wie vor eine Herausforderung, was die nachgelagerte Analyse von EV-Fracht, wie z. B. EV-Phosphoproteinen, erschwert. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive EV-Isolierungsmethode, die auf funktionalisierten magnetischen Beads für die EV-Isolierung aus Bioflüssigkeiten wie menschlichem Urin und der nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse nach der EV-Isolierung basiert. Das Protokoll ermöglichte eine hohe Rückgewinnungsausbeute von EVs im Urin und empfindliche Profile des EV-Proteoms und Phosphoproteoms. Darüber hinaus werden hier auch auf die Vielseitigkeit dieses Protokolls und relevante technische Überlegungen eingegangen.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranverkapselte Nanopartikel, die von allen Arten von Zellen abgesondert werden und in Bioflüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel usw. vorhanden sind.1,2,3,4. EVs tragen eine Ladung verschiedener bioaktiver Moleküle, die den physiologischen und pathologischen Zustand ihrer Wirtszellen widerspiegeln und daher als entscheidende Faktoren für das Fortschreiten der Krankheit fungieren ^4,5,6. Darüber hinaus haben umfangreiche Studien gezeigt, dass EV-basierte Krankheitsmarker vor dem Auftreten von Symptomen oder der physiologischen Erkennung von Tumoren identifiziert werden können ^5,6,7.

Die Phosphorylierung ist ein Schlüsselmechanismus für die zelluläre Signalübertragung und Regulation. Daher stellen Phosphoproteine eine wertvolle Quelle für die Entdeckung von Biomarkern dar, da aberrante Phosphorylierungsereignisse mit dysregulierten zellulären Signalwegen und der Entwicklung metastasierender Krankheiten wie Krebs verbunden sind ^8,9,10. Obwohl die Profilierung der Phosphorylierungsdynamik die Identifizierung krankheitsspezifischer Phosphoproteinsignaturen als potenzielle Biomarker ermöglicht, stellen die geringe Häufigkeit und die dynamische Natur von Phosphoproteinen große Herausforderungen bei der Entwicklung von Phosphoproteinen als Biomarker dar^11,12. Bemerkenswert ist, dass die in EVs eingekapselten Phosphoproteine mit geringer Häufigkeit vor externer enzymatischer Verdauung in der extrazellulären Umgebung geschützt sind⁸. Folglich bieten EVs und EV-abgeleitete Phosphoproteine eine ideale Quelle für die Entdeckung von Biomarkern in der Früherkennung von Krebs und anderen Krankheiten.

Obwohl die Analyse der Proteinphosphorylierung in EVs eine wertvolle Ressource für das Verständnis von Krebssignalen und die Diagnose von Krankheiten im Frühstadium darstellt, stellt der Mangel an effizienten Methoden zur Isolierung von EVs ein großes Hindernis dar. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen wird in der Regel durch differentielle Ultrazentrifugation (DUC)¹³ erreicht. Diese Methode ist jedoch zeitaufwändig und aufgrund des geringen Durchsatzes und der schlechten Reproduzierbarkeit nicht für klinische Implikationen geeignet^13,14. Alternative EV-Isolierungsansätze, wie z. B. die polymerinduzierte Fällung¹⁵, sind durch eine geringe Spezifität aufgrund der Co-Präzipitation von Nicht-EV-Proteinen begrenzt. Affinitätsbasierte Ansätze, einschließlich Antikörper-basierter Affinitätserfassung¹⁶ und Affinitätsfiltration¹⁷, bieten eine verbesserte Spezifität, sind aber aufgrund des geringen Volumens auf eine relativ niedrige Wiederfindungsrate beschränkt.

Um die Probleme bei der Erforschung der Phosphoproteindynamik in EVs anzugehen, hat unsere Gruppe extrazelluläre Vesikel-Total-Recovery- und Reinigungstechniken (EVtrap) entwickelt, die auf chemischer Affinität basieren, um EVs auf funktionalisierten magnetischen Kügelchen einzufangen¹⁸. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass diese auf magnetischen Kügelchen basierende EV-Isolationsmethode bei der Isolierung von EVs aus einer Vielzahl von Bioflüssigkeitsproben sehr effektiv ist und im Vergleich zu DUC und anderen bestehenden Isolationsmethoden in der Lage ist, eine viel höhere EV-Ausbeute bei gleichzeitiger Minimierung der Kontamination zu erzielen^18,19. Wir haben EVtrap und eine von unserer Gruppe²⁰ entwickelte Methode zur Anreicherung von Phosphopeptiden auf Titanbasis erfolgreich eingesetzt, um das Phosphoproteom von EVs aus verschiedenen Bioflüssigkeiten zu profilieren und potenzielle Phosphoprotein-Biomarker für verschiedene Krankheiten zu erkennen 19,21,22.

Hier stellen wir ein auf EVtrap basierendes Protokoll zur Isolierung von zirkulierenden Elektrofahrzeugen vor. Das Protokoll konzentriert sich auf die EVs im Urin. Wir demonstrieren auch die Charakterisierung isolierter Elektrofahrzeuge mittels Western Blotting. Anschließend beschreiben wir die Probenvorbereitung und die Massenspektrometrie (MS)-Erfassung sowohl für Proteomik- als auch für Phosphoproteomik-Analysen. Dieses Protokoll bietet einen effizienten und reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Profilierung des EV-Proteoms und Phosphoproteoms im Urin, was weitere Studien zu EVs und ihren klinischen Anwendungen erleichtern^{wird 23}.

Protocol

Alle Urinproben wurden von gesunden Probanden nach Einverständniserklärung entnommen. Die Experimente entsprachen allen ethischen Standards mit menschlichen Proben und den Richtlinien des Purdue University Human Research Protection Program.

1. Probenentnahme

1. Zentrifugieren Sie 12 ml Urinprobe in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 2.500 x g, 4 °C, um Zelltrümmer und große apoptotische Körper zu entfernen.
2. 10 ml des Überstandes in ein neues 15-ml-Röhrchen überführen und mit der EV-Isolierung fortfahren.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, und die Proben können bei -80 °C gelagert und bei Verwendung bei 37 °C aufgetaut werden.

2. Isolierung von Elektrofahrzeugen mit dem EVtrap-Ansatz

1. 0,5 ml Ladepuffer (1:10 v/v-Verhältnis) und 100 μl EVtrap-Kügelchenaufschlämmung (1:50 v/v-Verhältnis) gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Probe geben.
2. Inkubieren Sie die Probe durch End-über-Ende-Rotation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Pelletieren Sie die Probe, indem Sie das konische 15-ml-Röhrchen auf ein Magnetabscheidergestell legen. Entfernen Sie den Überstand.
4. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 1 ml Waschpuffer und überführen Sie die Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig, um die EV-gebundenen Kügelchen wieder zu suspendieren.
5. Legen Sie das Röhrchen auf ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen-Magnetabscheidergestell und saugen Sie den Überstand ab. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um den Überstand vollständig abzusaugen und ein Ansaugen der Kügelchen zu vermeiden.
6. Waschen Sie die Perlen mit 1 ml Waschpuffer. Fügen Sie den Puffer sofort nach dem Ansaugen des Überstandes hinzu, um ein Austrocknen der Perlen zu verhindern.
7. Waschen Sie die Kügelchen 2x mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur.
8. Inkubieren Sie die Kügelchen mit 100 μl frisch zubereitetem 100 mM Triethylamin für 10 Minuten bei Raumtemperatur und sammeln Sie die eluierte Lösung, die EVs enthält, mit einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen-Magnetabscheidergestell.
   HINWEIS: Zur Herstellung von 1 ml 100 mM Triethylamin werden 14 μl Triethylaminlösung in Wasser verdünnt.
9. Wiederholen Sie Schritt 2.8 und kombinieren Sie die eluierten Lösungen. Das Eluat wird mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator bei 4 °C getrocknet.
   HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden. Getrocknete EV-Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden, ohne dass die folgenden Schritte oder die Ergebnisse beeinträchtigt werden.

3. Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch Western Blot

1. Resuspendieren Sie 5 % der getrockneten EV-Probe (entsprechend 0,5 ml der Urinprobe) in 20 μl 1x Lithiumdodecylsulfat (LDS)-Probenpuffer mit 10 mM Dithiothreitol (DTT).
   HINWEIS: EVs ab 0,5 ml Urin reichen aus, um das CD9-Signal (ein EV-Marker²⁴) im Western Blot zu erkennen.
2. Die Probe wird 5 min bei 95 °C gekocht. Laden Sie die Probe auf ein Polyacrylamid-Gel und führen Sie Elektrophorese und Immunoblotting gemäß den Standardprotokollen²⁵ durch.
3. Nachdem die Proteine auf eine niedrig fluoreszierende Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) übertragen wurden, blockieren Sie die Membran mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung Tween-20 (TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Um 1 l TBST-Puffer herzustellen, fügen Sie 19 mM Trisbase, 137 mM NaCl und 1 ml Tween-20 hinzu; Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein.
4. Membran mit Kaninchen-Anti-CD9-Antikörper im Verhältnis 1:5.000 in 1 % BSA in TBST bei 4 °C über Nacht oder 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit TBST. Die Membran wird 1 h lang bei Raumtemperatur mit Anti-Kaninchen-IgG, HRP-verknüpftem Sekundärantikörper im Verhältnis 1:5000 in 1% BSA in TBST inkubiert.
6. Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit TBST. Geben Sie die kommerziell erhältlichen ECL-Substrate (Enhanced Chemiluminescence) (Verhältnis 1:1) auf die Membran und detektieren Sie Signale auf einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem.

4. Probenvorbereitung für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse

1. Bereiten Sie frischen Lysepuffer mit 12 mM Natriumdesoxycholat (SDC), 12 mM Natriumlauroylsarcosinat (SLS), 100 mM Triethylammoniumbicarbonatpuffer (TEAB), 10 mM Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), 40 mM Chloracetamid (CAA) und 1x Phosphatase-Inhibitor-Cocktails vor.
   HINWEIS: Die Lagerlösungen sind in der Beschreibung der Materialtabelle aufgeführt. Der Lysepuffer wird durch Zugabe der Stammlösungen hergestellt, um die gewünschten Konzentrationen in Abhängigkeit vom erforderlichen Volumen zu erreichen.
2. Die getrocknete EV-Probe wird in 100 μl Lysepuffer gelöst und die Probe 10 Minuten lang bei 95 °C unter Schütteln bei 1.100 U/min erhitzt.
3. Nachdem Sie die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt haben, verdünnen Sie sie um das Fünffache, indem Sie 400 μl 50 mM TEAB hinzufügen.
4. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie den Lysepuffer fünffach verdünnt mit 50 mM TEAB als Blindwert.
5. Die Trypsin/Lys-C-Mischung wird mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:50 w/w zugegeben und die Probe wird über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 1.100 U/min inkubiert.
6. Fügen Sie 50 μl 10%ige Trifluoressigsäure (TFA) hinzu, um die Probe anzusäuern.
7. Geben Sie 600 μl Ethylacetat zu den Proben und wirbeln Sie die Mischung 2 Minuten lang auf.
8. Die Probe wird 3 min bei 20.000 x g zentrifugiert und die obere Schicht (organische Schicht) entfernt. Vermeiden Sie es, die Schnittstelle während der Aspiration zu stören.
9. Wiederholen Sie die Schritte 4.7 bis 4.8. Trocknen Sie die wässrige Phase mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator.
10. Resuspendieren Sie die getrocknete Probe in 200 μl 0,1 % TFA, um die Peptide anzusäuern, und entsalzen Sie die Probe mit einer C18-Entsalzungsspitze gemäß den Anweisungen des Herstellers. Konditionieren Sie die Spitze mit 200 μl 0,1 % TFA in 80 % Acetonitril, gefolgt von 2x 200 μl 0,1 % TFA. Laden Sie die angesäuerte Peptidprobe in die Spitze und waschen Sie die Spitze dann 3x mit 200 μl 0,1% TFA. Die Peptide werden mit 200 μl 0,1 % TFA in 80 % Acetonitril eluiert.
11. Trocknen Sie das Eluat mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator. Trocknen Sie 2 % der Peptidprobe (entsprechend 0,2 ml der Urinprobe) separat für die Proteomik-Analyse. Verwenden Sie den Rest (98 %) der Probe für die Phosphoproteomik-Analyse.
12. Reichern Sie Phosphopeptide aus der Probe mit einem Phosphopeptid-Anreicherungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers an. Führen Sie die unten beschriebenen Schritte für die Anreicherung aus.
    1. Resuspendieren Sie die getrocknete Probe in 200 μl Ladepuffer. 50 μl der Kügelchen zur Probe geben und 20 min bei Raumtemperatur kräftig schütteln. Die Probe mit den Kügelchen in die Frittenspitze geben und 1 min bei 100 x g zentrifugieren.
    2. Waschen Sie die Spitze mit 200 μl Ladepuffer, gefolgt von Waschpuffer 1 und dann Waschpuffer 2. Alle drei Waschschritte werden durchgeführt, indem Sie einmal für 2 Minuten bei 20 x g und einmal für 1 Minute bei 100 x g zentrifugieren.
    3. Stecken Sie die Spitze mit den Perlen in ein neues Röhrchen, um die eluierten Phosphopeptide aufzufangen. Geben Sie 50 μl Elutionspuffer in die Spitze und zentrifugieren Sie einmal 2 Minuten lang bei 20 x g. Geben Sie weitere 50 μl Elutionspuffer in die Spitze und zentrifugieren Sie einmal 2 Minuten lang bei 20 x g. Ein letztes Mal 1 min bei 100 x g zentrifugieren.
13. Trocknen Sie die eluierten Phosphopeptide mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator.

5. LC-MS/MS-Analyse

HINWEIS: Es können verschiedene LC-MS/MS-Systeme/-Einstellungen und Datenerfassungsmethoden, wie z. B. die datenabhängige Erfassung (DDA), verwendet werden.

1. Resuspendieren Sie die getrockneten Proteom-/Phosphoproteom-Proben in 0,1%iger Ameisensäure (Lösungsmittel A) und laden Sie die Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Injizieren Sie die Proben durch das Flüssigchromatographie-System (LC) in eine Flugzeit-MS mit gefangener Ionenmobilität und verwenden Sie die voreingestellte standardisierte Whisper-Methode mit 40 Proben pro Tag. Die Peptide werden auf einer 15 cm C18-Säule (75 μm Innendurchmesser, 1,9 μm Partikelgröße) getrennt, wie in der Materialtabelle angegeben.
3. Für die Proteomik-Analyse werden Daten mit einer parallelen akkumulationsseriellen Fragmentierung in Kombination mit einer datenunabhängigen Erfassungsmethode (dia-PASEF) mit einem Massenbereich pro Rampe von 300-1200 m/z und von 0,6-1,50 1/K0 mit einer Zykluszeit von 1,38 s erfasst.
4. Für die Phosphoproteomik-Analyse werden Daten mit einer dia-PASEF-Erfassungsmethode mit einem Massenbereich pro Rampe von 400-1550 m/z und 0,6-1,50 1/K0 mit einer Zykluszeit von 1,38 s erfasst.
5. Laden Sie die Rohdateien in die Proteomik-Software und führen Sie die Signalextraktion, -identifizierung und -quantifizierung mithilfe eines bibliotheksfreien, datenunabhängigen Erfassungs-Workflows durch.
   1. Verwenden Sie für die Sucheinstellungen die Homo sapiens-Datenbank , spezifische Verdaustypen mit Trypsin/P-Enzymen, 7 minimale Peptidlänge, 52 maximale Peptidlänge, zwei verpasste Spaltungen, Carbamidomethyl als feste Modifikation, Acetylprotein N-Term, Oxidation bei Methionin und Phosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin (für die Phosphoproteomik-Analyse) als variable Modifikationen und 5 als maximale variable Modifikationen. Legen Sie den FDR-Wert bei PSM, Peptid- und Proteingruppe auf 0,01 fest.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die Spectronaut-Software verwendet. Andere DIA-Datensuchsoftware wie DIA-NN und PEAKS werden ebenfalls häufig verwendet. Wenn Daten im DDA-Modus erfasst wurden, sind Software wie MaxQuant und Proteome Discoverer anwendbar.

Results

Dieses Protokoll demonstriert einen umfassenden Arbeitsablauf von der Isolierung von EVs bis hin zu nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analysen (Abbildung 1). Die dreifachen Urinproben wurden einer EV-Isolierung unterzogen. Die isolierten EVs wurden mittels Western Blot charakterisiert und anschließend für die massenspektrometriebasierte Proteomik-Probenvorbereitung einschließlich Proteinextraktion, enzymatischer Verdauung und Peptidaufreinigung verarbeitet. Für die Phosphoprot...

Discussion

Eine effektive EV-Isolierung ist eine wesentliche Voraussetzung für den Nachweis von Proteinen und Phosphoproteinen mit geringer Häufigkeit in EVs. Trotz der Entwicklung zahlreicher Methoden, um diesen Bedarf zu decken, leidet die Mehrheit immer noch unter Einschränkungen wie schlechter Erholung oder geringer Reproduzierbarkeit, die ihren Einsatz in groß angelegten Studien und klinischen Routineumgebungen behindern. DUC wird im Allgemeinen als die gebräuchlichste Methode zur Isolierung von Elektrofahrzeugen angesehen, un...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Life Science Products	M-1700C-LB
1,5 mL Röhrchen Magnetabscheidergestell	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL konisches Zentrifugenröhrchen	Corning
15-ml-Röhrchen-Magnetabscheidergestell	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-verknüpfte	Antikörper-Zellsignaltechnologie	7074P2
Tischschüttler mit Inkubation	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mischblock MB-101
CD9 (D3H4P) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie		13403S
Chloracetamid	Sigma-Aldrich	C0267-100G	Wird zur Alkylierung von reduzierten Sulfidgruppen verwendet. 400 mM in Wasser als Stammlösung frisch zubereiten.
Ethylacetat	Fisher Wissenschaftlich	E145-4	Fällt Reinigungsmittel
Evosep One	Evosep		Flüssigchromatographie-System
Evotips	Evosep	EV2013	Probenbeladung für Evosep One System
EVtrap	Tymora Analytical		Funktionalisierte magnetische Kügelchen, Ladepuffer und Waschpuffer
Immobilon-FL PVDF-Membran	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting-Membran
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 bis 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Probenpuffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1,9	Bruker	1893473	Trennsäule
Phosphatase-Inhibitor Cocktail 2	Sigma-Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase-Inhibitor.
Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase-Hemmer.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrat	ThermoFisher	32106	HRP Substrat
PolyMAC Phosphopeptid-Anreicherungskit	Tymora Analytical		Polymer-based Metallionen-Affinitätserfassung (PolyMAC) für die Phosphopeptid-Anreicherung
Natriumdesoxycholat	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Reinigungsmittel für Lysepuffer. Bereiten Sie 120 mM in Wasser als Stammlösung vor.
Natriumlauroylsarkosinat	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Reinigungsmittel für Lysepuffer. Bereiten Sie 120 mM in Wasser als Stammlösung vor.
timsTOF HT	Bruker		Ionen-Mobilität Flugzeit-Massenspektrometrie mit gefangenen
Ionen TopTip C-18 (10-200 μ L) Tipps	Glygen	TT2C18.96	Entsalzungsmethode
Triethylamin	Sigma -Aldrich	471283-100ML	Für die EV-Elution.
Triethylammoniumbicabonat-Puffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoressigsäure	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid	Sigma -Aldrich	C4706	Wird zur Reduktion von Disulfidbindungen verwendet. Bereiten Sie 200 mM in Wasser als Stammlösung vor. Aliquotieren Sie die Stammlösung in ein kleines Volumen und lagern Sie sie bei -20 Grad; C (mehrfache Frost-Tau-Zyklen vermeiden).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007