Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Präparation von post-kryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die subretinale Verabreichung dieser Zellen in rd10-Mäusen .
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Methodenartikel
Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Regeneration von Photorezeptorzellen mit humanen pluripotenten Stammzellen ist eine vielversprechende Therapie für die Behandlung von erblichen und alternden Netzhauterkrankungen in fortgeschrittenen Stadien. Wir haben gezeigt, dass die humane rekombinante retina-spezifische Laminin-Isoform-Matrix in der Lage ist, die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) zu Photorezeptor-Vorläuferzellen zu unterstützen. Darüber hinaus hat die subretinale Injektion dieser Zellen auch eine teilweise Wiederherstellung in den rd10-Nagetier - und Kaninchenmodellen gezeigt. Es ist bekannt, dass die subretinale Injektion eine etablierte Methode ist, die verwendet wurde, um pharmazeutische Verbindungen zu den Photorezeptorzellen und der retinalen pigmentierten Epithelschicht (RPE) des Auges zu bringen, da sie sich in der Nähe des Zielraums befindet. Es wurde auch verwendet, um Adeno-assoziierte virale Vektoren in den subretinalen Raum zu bringen, um Netzhauterkrankungen zu behandeln. Die subretinale Verabreichung von pharmazeutischen Verbindungen und Zellen im Mausmodell ist aufgrund der begrenzten Größe des murinen Augapfels eine Herausforderung. Dieses Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren zur Vorbereitung von hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen für die Injektion und die subretinale Verabreichungstechnik dieser Zellen in genetischen Retinitis pigmentosa-Mutanten, rd10-Mäusen . Dieser Ansatz ermöglicht die Zelltherapie in den Zielbereich, insbesondere in die äußere Kernschicht der Netzhaut, wo Krankheiten auftreten, die zu einer Degeneration der Photorezeptoren führen.
Einleitung
Erbliche Netzhauterkrankungen und altersbedingte Makuladegeneration führen zum Verlust von Photorezeptorzellen und schließlich zur Erblindung. Der retinale Photorezeptor ist die äußere Segmentschicht der Netzhaut, die aus spezialisierten Zellen besteht, die für die Phototransduktion (d. h. die Umwandlung von Licht in neuronale Signale) verantwortlich sind. Die Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptorzellen grenzen an die retinale pigmentierte Schicht (RPE)1. Die Photorezeptor-Zellersatztherapie zur Kompensation des Zellverlustes ist ein aufkommender und sich entwickelnder therapeutischer Ansatz. Embryonale Stammzellen (ESCs)
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Protokoll
Die In-vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) und der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung genehmigt wurden. Die Welpen wurden von P17 (vor der Transplantation) auf P30 (nach der Transplantation) immunsupprimiert, indem sie mit Ciclosporin (260 g/L) gefüttert wurden.
1. Präparation von Tag 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen nach Kryokonservierung
- Photorezeptor-Differe....
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Ergebnisse
Die 10-μl-Glasspritze wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammengebaut (Abbildung 1), und die stumpfe Nadel, die zur Abgabe der Zellsuspension/des Mediums verwendet wird, ist in Abbildung 1B dargestellt. Verschiedene Ansätze für die subretinale Injektion sind in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Protokoll beschreiben wir den Pars-Plana-Ansatz (Abbildung 2C). Die stumpfe Nadel, die auf einer G.......
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Diskussion
Die subretinale Injektion wurde für die Zellsuspensionstransplantation zur Behandlung von RPE und Netzhauterkrankungen verwendet 23,25,26,27,28,31,40. Dieser Ansatz ist in Studien an Nagetieren nicht nur für Zelltransplantations- und Gentherapieansätze, sondern auch für die Evaluierung neuar.......
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Offenlegungen
Hwee Goon Tay ist Mitbegründer von Alder Therapeutics AB. Andere Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.
Danksagungen
Wir danken Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee und Yingying Chung für die technische Unterstützung bei der Herstellung der 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen nach der Kryokonservierung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse des National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) und des National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) an H.G.T.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3,5 g) |
| 0,3 % Tobramycin und 0,1 % Dexamethason | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3,5 g) |
| 0,5 % Proparacainhydrochlorid | Alcon NDC | 0998-0016-15 | 0,5 % Alcain (15 mL) |
| 1 ml Tuberkulinspritze | Turemo | SS01T2713 | |
| 1 % Tropicamid | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1 % Mydriacyl (15 mL) |
| 2,5 % Phenylephrinhydrochlorid | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2,5 % Mydfrin (5 mL) |
| 24-Well-Gewebekulturplatte | Costar | 3526 | |
| 30 G Einwegnadel | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm lange stumpfe Nadeln | Hamilton | 7803-05 | |
| Automatisierter Zellzähler | NanoEnTek | Modell: Eve | |
| B27 ohne Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphin | Ceva | Vetergesic vet (0,3 mg/ml) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 & micro; M36 |
| Cyclosporin | Novartis | 260 g/L im Trinkwasser | |
| Tag 32 hESC-abgeleitete Photorezeptor-Vorläuferzellen | DUKE-NUS Medical School | Menschliche embryonale Stammzellen werden 32 Tage lang differenziert. Siehe Protokoll in Ref 36. | |
| Gaze Winner Industries Co., Ltd. | 1SNW475-4 | ||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710– 035 | |
| hESC-Zelllinie H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Vom menschlichen Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/ml36 |
| Humaner ziliärer neurotropher Faktor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/ml36 |
| Ketaminhydrochlorid (100 mg/ml) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µ g36 |
| mFreSR STEMCELL | Technologies | 5854 | |
| Mikroliter-Glasspritze (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorphenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycin-t-butylester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 & micro; M36 |
| N-2 Nahrungsergänzungsmittel | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) | Gibco | 11140– 050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operationsmikroskop | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | Mit eingebauter iOCT-Funktion |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | Siehe media composition36. Basalmedium, 10 & Mikro; M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0,5 &Mikro; M Retinsäure, 2% B27 und 1% N2. Basalmedium: 1x GMEM, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM B-Mercaptoethanol, 1x nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA). | |
| Pyruvat | Gibco | 11360– 070 | 1 mM36Rd10 |
| Mäuse | Jackson Laboratory | B6. CXB1-Pde6brd10/J Mäuse | Geschlecht: männlich/weiblich, Alter: P20 (Injektion), Gewicht: 3-6 g |
| Retinsäure | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0,5 & Mikro; M36 |
| Rund Deckglas (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0,5 µ M36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazinhydrochlorid (20 mg/ml) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985– 023 | 0,1 mM36 |
Referenzen
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15
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Nachdrucke und Genehmigungen
