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Methodenartikel

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

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DOI:

10.3791/65851

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1. Dezember 2023

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1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Zusammenfassung

Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von Mausmuskeln gewonnen werden, sind ein nützliches Modell für physiologische Experimente. Die meisten Arbeiten befassen sich jedoch mit den kurzen Fasern des Flexor digitorum brevis (FDB), was den Umfang der Ergebnisse einschränkt, die sich mit Fasertypen befassen, die Menge des verfügbaren biologischen Materials begrenzt und eine klare Verbindung zwischen zellphysiologischen Phänomenen und früheren biochemischen und dynamischen Erkenntnissen in anderen Muskeln verhindert.

In diesem Artikel wird beschrieben, wie intakte Fasern aus sechs Muskeln mit unterschiedlichen Fasertypprofilen und -längen gewonnen werden können. Anhand von erwachsenen C57BL/6-Mäusen zeigen wir das Muskeldissektions- und Faserisolationsprotokoll und demonstrieren die Eignung der Fasern für Ca2+ transiente Studien und ihre morphometrische Charakterisierung. Die faserartige Zusammensetzung der Muskeln wird ebenfalls vorgestellt. Bei der Dissoziation wurden alle Muskeln intakte, lebende Fasern, die sich länger als 24 Stunden schnell zusammenzogen. FDB ergab kurze (<1 mm), Peroneus digiti quarti (PDQA) und Peroneus longus (PL) ergaben intermediäre (1-3 mm), während Extensor digitorum longus (EDL), Extensor hallucis longus (EHL) und Soleus-Muskeln lange (3-6 mm) Fasern freisetzten.

Bei der Aufzeichnung mit dem schnellen Farbstoff Mag-Fluo-4 zeigten Ca2+ -Transienten von PDQA-, PL- und EHL-Fasern eine schnelle, schmale Kinetik, die an die Morphologie des Typs II (MT-II) erinnert, von der bekannt ist, dass sie den Fasern vom Typ IIX und IIB entspricht. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass diese Muskeln über 90% Typ-II-Fasern aufweisen, verglichen mit FDB (~80%) und Soleus (~65%). Über FDB hinaus zeigen wir zum ersten Mal die Dissoziation mehrerer Muskeln, die Fasern ergeben, die einen Längenbereich zwischen 1 und 6 mm umfassen. Diese Fasern sind lebensfähig und liefern schnelle Ca2+ -Transienten, was darauf hindeutet, dass das MT-II unabhängig von ihrer Muskelquelle auf IIX- und IIB-Fast-Fasern verallgemeinert werden kann. Diese Ergebnisse erhöhen die Verfügbarkeit von Modellen für Studien zur reifen Skelettmuskulatur.

Einleitung

Der reife Skelettmuskel von Säugetieren ist ein multifunktionales Gewebe. Es reguliert den Stoffwechsel stark, ist die Hauptquelle der Wärmeerzeugung und seine dynamischen Eigenschaften verleihen ihm eine Schlüsselrolle bei der Atmung, der Bewegung von Körpersegmenten oder der Verschiebung von einem Punkt zum anderen 1,2,3. Die Skelettmuskulatur ist auch für die Pathophysiologie vieler Krankheiten relevant, einschließlich erblicher und chronischer Erkrankungen wie Myopathien, Dystrophien oder Sarkopenie sowie vieler chronischer Erkrankungen außerhalb des Muskels, wie z. B. kardiometabolische Erkrankungen 3,4,5,6,7,8.

Die Ex-vivo-Untersuchung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften reifer Skelettmuskeln im Kontext von Gesundheit und Krankheit war hauptsächlich durch zwei experimentelle Modelle möglich: ganzer Muskel und isolierte Fasern. Im 20. Jahrhundert nutzten Forscher die Eigenschaften des ganzen, intakten Musculus extensor digitorum longus (EDL), des Soleus, des Tibialis anterior und des Gastrocnemius verschiedener kleiner Spezies als zentrale Modelle, um mehr über motorische Einheiten, Fasertypen und dynamische Eigenschaften wie Kraft und Kinetik von Kontraktion und Entspannung zu erfahren 9,10,11,12,13,14,15,16. Das Aufkommen verfeinerter zellbiologischer Studien verlagerte den Bereich jedoch in Richtung der Untersuchung einzelner Muskelfasern. Pionierarbeit ermöglichte dann die Isolierung von intakten Flexor digitorum brevis (FDB)-Fasern von Ratten durch enzymatische Dissoziation für die anschließende Charakterisierung 17,18,19. Obwohl FDB-Fasern auch durch manuelle Dissektion gewonnen werden können20, haben die Leichtigkeit und der hohe Durchsatz der enzymatischen Dissoziation von murinen Muskeln sowie ihre Eignung für eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen dazu geführt, dass das letztere Modell in den letzten zwei Jahrzehnten weit verbreitet ist.

Die kurzen FDB-Fasern eignen sich für elektrophysiologische und andere biophysikalische Studien, biochemische, metabolische und pharmakologische Analysen, Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie-Experimente, Transfektion für zellbiologische Ansätze oder als Stammzellquelle in Myogenese-Studien 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Die ausschließliche Verwendung von FDB-Fasern in Muskelexperimenten schränkt jedoch den Umfang der Forschung ein, die sich mit Fasertypen befasst, und begrenzt die Menge an biologischem Material, das für einige methodische Techniken oder für die Gewinnung weiterer Informationen von einem Tier zur Verfügung steht. Diese Einschränkungen verhindern eine klare Korrelation zellphysiologischer Phänomene mit früheren biochemischen und dynamischen Studien, die an verschiedenen ganzen, intakten Muskeln (z. B. EDL, SOLEUS, PERONEI) durchgeführt wurden.

Durch die Überwindung dieser Einschränkungen gelang es einigen Gruppen, die längeren EDL- und Soleus-Muskeln 24,33,34,35,36,37,38,39,40 zu dissoziieren, was die Tür öffnete, um die Methode auf andere relevante Muskeln auszudehnen. Die Verwendung von EDL- und Soleus-Fasern ist jedoch immer noch selten, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an methodischen Details, um sie als intakte Fasern zu erhalten. Hier beschreiben wir detailliert, wie man Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln isoliert: drei davon bereits beschrieben (FDB, EDL und Soleus) und drei von ihnen wurden zum ersten Mal erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus [EHL], Peroneus longus [PL] und Peroneus digiti quarti [PDQA]). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass das Modell enzymatisch dissoziierter Fasern für eine Vielzahl von Studien und zukünftige Korrelationen mit bereits veröffentlichten Daten geeignet ist, wodurch die Verfügbarkeit von Modellen für Studien zur reifen Skelettmuskulatur erhöht wird.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Kommission für Ethik bei Tierversuchen der Universität von Antioquia (UdeA) (Protokoll 104 vom 21. Juni 2016 und 005 vom 15. April 2021) gemäß dem Gesetz 84 von 1989 und der Resolution 8430 von 1993 der kolumbianischen Regierung genehmigt und in Übereinstimmung mit den Tierversuchen durchgeführt und gemeldet: Richtlinien für die Berichterstattung über In-vivo-Experimente (ARRIVE)41. Alle hier vorgestellten Ergebnisse stammen von gesunden, 7-13 Wochen alten, 20-26 g schweren, männlichen C57BL/6-Mäusen. Abbildung 1 zeigt den allgemeinen Aufbau dieser Studie und die Reihenfolge der Verfahren. Alle Reagenzien, Materialien und Ausrüstungsdetails sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tiere

  1. Halten Sie maximal sechs Mäuse pro transparentem, rechteckigem Käfig aus Acryl mit Einstreu aus Holz, unter kontrollierten Temperatur- (21 ± 2 °C) und Hell-Dunkel-Zyklen (12:12 h).
  2. Geben Sie den Tieren freien Zugang zu Futter und Leitungswasser in speziellen pathogenfreien Tiereinrichtungen ohne Umweltbereicherung.

2. Sezieren

  1. Lösungen, Materialien und Reagenzien
    1. Die Arbeitslösungen mit folgender Zusammensetzung (alle Konzentrationen in mM) werden vorbereitet und filtriert (0,22 μm):
      1. Tyrod: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 Glukose, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Dissoziation: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Bereiten Sie zwei Sezierkammern vor; Stereoskop; Bedienen einer Schere; feine Schere; feine Pinzetten; und saubere, transparente, nicht konische, 1-1,5 cm breite Glasfläschchen mit 3-4 ml Gesamtvolumen mit Kappen. Richten Sie ein System zur elektrischen Stimulation der Muskeln in den Präparierkammern ein.
    3. Bereiten Sie feuerpolierte Pasteurglaspipetten mit unterschiedlich breiten Spitzen vor: 5, 4, 3, 2 und 1 mm.
    4. Stellen Sie das Wasserbad auf 37 °C ein. Wiegen Sie Aliquote von 3 mg Kollagenase Typ 2.
  2. Verfahren
    1. Opfern Sie die Maus mit Methoden, die von der örtlichen Ethikkommission genehmigt wurden. Eine Zervixluxation wird empfohlen, da sie schnell und weniger stressig ist und die Exposition gegenüber Medikamenten vermeidet, die das Muskelgewebe beeinträchtigen können (wie CO2 oder einige Anästhetika). Beginnen Sie sofort mit der Sektion, um bessere Ergebnisse zu erzielen.
    2. Legen Sie die Maus auf eine Schaumstoffoberfläche und kleben oder stecken Sie die Vordergliedmaßen fest. Schneiden Sie beide Hinterbeine mit der Operationsschere über die Knie, bringen Sie sie jeweils in eine separate Sezierkammer und fügen Sie kalte (10-20 °C) Tyrode hinzu, um das Gewebe zu bedecken.
      HINWEIS: Jede Hintergliedmaße gibt sechs verschiedene Muskeln in der folgenden Reihenfolge: FDB, Soleus, EDL, EHL, PL und PDQA. Detaillierte anatomische Referenzen zur Analyse der sechs von Sehne zu Sehne intakten Muskeln sind in Abbildung 2 und an anderer Stelle42 angegeben.
    3. Stecken Sie die erste Hintergliedmaße in einer Position, in der die hintere Seite der Beine sichtbar ist, an die Präparierkammer. Entfernen Sie die Haut unter Vergrößerung; Legen Sie dann das FDB frei und entfernen Sie es (Abbildung 2). Bewahren Sie es in einer beschrifteten Durchstechflasche mit 1 ml Tyrodelösung auf.
      HINWEIS: Eine angemessene Vergrößerung und vorheriges Training sind erforderlich, um unerwünschte Schnitte im Muskelgewebe zu vermeiden.
    4. Den Soleus freilegen, entfernen und in einer separaten Durchstechflasche mit 1 ml Tyrode aufbewahren. Verwenden Sie eine feine Schere, um zuerst den Gastrocnemius zu trennen und dann den Soleus zu entfernen, wie in Abbildung 2 gezeigt.
    5. Legen Sie die vordere Seite des Beins frei, entfernen Sie die Haut und identifizieren Sie die distalen Sehnen des Tibialis anterior und die EDL-Muskeln im Knöchel. Entfernen und entsorgen Sie das Tibialis; dann die distalen Sehnen der EDL durchtrennen (Abbildung 2). Setzen Sie die Dissektion fort, bis das EDL entfernt wird, und legen Sie es in ein separates Glasfläschchen mit 1 ml Tyrode.
    6. Entfernen Sie den EHL-Muskel, der direkt hinter und medial der EDL liegt. Beginnen Sie mit der Dissektion, indem Sie die Sehne identifizieren und bis zur 1. Ziffer verfolgen, wie im entsprechenden Feld in Abbildung 2 gezeigt. Bewahren Sie den Muskel in einer separaten Durchstechflasche mit 1 ml Tyrode auf.
    7. Identifizieren und folgen Sie der äußersten Sehne des Peronei, um sie zu durchtrennen und den PL-Muskel zu entfernen (Abbildung 2). Legen Sie den Muskel in eine separate Durchstechflasche mit 1 ml Tyrode.
    8. Identifizieren Sie die Sehne und folgen Sie ihr bis zur 4. Stelle; schneiden Sie es und entfernen Sie den PDQA-Muskel (Abbildung 2). Geben Sie es in eine separate Durchstechflasche mit 1 ml Tyrode.
    9. Wiederholen Sie den Vorgang mit der zweiten Hintergliedmaße.
    10. Sammeln Sie beide Muskeln des gleichen Typs in einem beschrifteten Glasfläschchen oder einer kleinen Petrischale mit Tyrodelösung.
      HINWEIS: Wenn während einer Arbeitssitzung mehr als zwei Muskelpaare präpariert werden sollen, rekrutieren Sie zwei Forscher für das Sezierverfahren.

3. Protokoll zur Isolierung von Muskelfasern

  1. Erneuern Sie die Tyrode-Lösung in den Sezierkammern, um Schmutz und Mäusefell zu entfernen. Gießen Sie die FDB-Muskeln in eine Sezierkammer, überprüfen Sie ihre Unversehrtheit und übertragen Sie sie in ein neues Glasfläschchen mit 1 ml Dissoziationslösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den EHL-, PL- und PDQA-Muskeln.
    HINWEIS: Wenn ein Muskel überkontrahiert oder durchtrennt aussieht oder nicht auf die elektrische Stimulation reagiert, fahren Sie nicht mit dem nächsten Protokollschritt fort. Optimieren Sie stattdessen das Sezierprotokoll, indem Sie die Qualität der Lösungen (pH-Wert, Kontamination, Osmolarität) überprüfen und mehr Sezierfähigkeiten erwerben (Abbildung 1C und ergänzendes Video S1).
  2. Führen Sie Längs- oder Diagonalschnitte an den Soleus- und EDL-Muskeln durch, wobei Sie der Ausrichtung der Fasern folgen (Abbildung 2). Folgen Sie für den Soleus der zentralen Sehne und schneiden Sie ~80% seiner Länge ab. Folgen Sie bei EDL einfach einer oder zwei Sehnen und schneiden Sie ungefähr die gleiche Länge wie bei Soleus. Geben Sie jedes Muskelpaar in Glasfläschchen mit 1 ml Dissoziationslösung.
    HINWEIS: Dieses Verfahren verkleinert die EDL und den Soleus und ermöglicht es der Kollagenase, besser in das Gewebe einzudringen. Eine ausreichende Vergrößerung (40-50x) sowie eine feine Schere und Pinzette sind obligatorisch. Überprüfen Sie die Probenintegrität immer durch Sichtprüfung und elektrische Stimulation, bevor Sie mit dem nächsten Schritt des Dissoziationsprotokolls fortfahren.
  3. Geben Sie 3 mg Kollagenase Typ 2 (mit einer Aktivität von 250-300 U/mg) in jede Durchstechflasche mit 1 ml Dissoziationslösung und einem Muskelpaar. Standardisieren Sie die genaue Menge an Kollagenase unter Berücksichtigung der Aktivität der verwendeten Enzymcharge.
  4. Die Muskelpaare im Wasserbad 65-90 min bei 36,8-37 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
    Anmerkungen: Seien Sie streng bei der Temperaturregelung. Standardisieren Sie das Verfahren, damit die Muskeln nicht länger als 100 Minuten in der Kollagenase verbleiben, um Schäden zu vermeiden.
  5. Überprüfen Sie die Fläschchen unter Stereoskopvergrößerung alle 5 Minuten nach der 65. Minute der Inkubation. Wenn die Muskeln leicht gewellt, zerlumpt und locker aussehen, schütteln Sie die Durchstechflasche vorsichtig und überprüfen Sie, ob sich einige Fasern leicht lösen. Wenn dies der Fall ist, waschen Sie die Muskeln bei Raumtemperatur mit Tyrode, um die Kollagenase zu inaktivieren und zu entfernen.
    Anmerkungen: Das Waschen muss sorgfältig erfolgen, ohne die Muskeln mit den Pipetten zu berühren. Beginnen Sie mit der Zugabe von 0,8 ml Tyrode und entfernen Sie dann 0,8 ml der Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4-5x und stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig transparent wird.
  6. Trennen Sie mehr Fasern von der Masse der Muskeln mit sehr sanfter Verreibung in Tyrode mit Hilfe des Satzes feuerpolierter Pasteurpipetten. Beginnen Sie damit, die Lösung mit der breitesten Pipette (5 mm Spitze) um den Muskel herum zu rühren und ziehen Sie dann die Muskeln 3-4x vorsichtig in die Pipette hinein und wieder heraus. Wenn der Muskel beginnt, Fasern freizusetzen und dünner wird, wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Pipette (4-mm-Spitze).
    HINWEIS: Fasern, die mit diesem Verfahren gerendert werden, bleiben erregbar und ziehen sich länger als 24 Stunden zügig zusammen, wie z. B. mit PL-, EDL-, EHL- und Soleus-Fasern in Supplemental Video S2, Supplemental Video S3, Supplemental Video S4 und Supplemental Video S5.

4. Experimentelle Verfahren

HINWEIS: Isolierte Fasern wurden für sarkoplasmatische Ca2+ -Konzentrationsschätzungen, morphometrische Messungen und Myosin-Schwerketten-Expressionsstudien (MHC) verwendet.

  1. Messung des sarkoplasmatischen Ca2+ Konzentration während eines Zuckens
    1. Montieren Sie einen sauberen Glasobjektträger auf der experimentellen Badkammer. Beschichten Sie den Objektträger mit 2-3 μl Laminin und lassen Sie ihn 30 s trocknen, bevor Sie ~400 μl der Fasersuspension auf den Objektträger gießen. Lassen Sie die Fasern 10-15 Minuten bei Raumtemperatur am Laminin haften.
    2. Montieren Sie die Experimentierkammer auf dem Tisch eines inversen Mikroskops, das für Epifluoreszenz ausgestattet ist (Abbildung 3A).
    3. Evozieren Sie einzelne Zuckungen, um die Lebensfähigkeit der Fasern zu überprüfen, indem Sie rechteckige Stromimpulse (0,8-1,2 ms) durch die beiden Platinelektroden entlang beider Seiten der Experimentierkammer anlegen. Selbst wenn es an Laminin gebunden ist, ist die Kontraktion der Fasern immer noch vor allem an den Extremen sichtbar.
    4. Laden Sie die Fasern mit 3,5-4,5 μM des schnellen Ca2+ Farbstoffs Mag-Fluo-4, AM für 4-5 min in Tyrodelösung. Nach dieser Zeit vorsichtig mit Tyrode waschen, um den extrazellulären Farbstoff zu entfernen. Lassen Sie den intrazellulären Farbstoff unter dunklen Bedingungen ~15-20 min entesterifizieren. Halten Sie die Temperatur immer unter 22 °C, um eine Farbkompartimentierung zu vermeiden.
      HINWEIS: Bereiten Sie einen Vorrat an Mag-Fluo-4, AM nur in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor, so dass die Endkonzentration von DMSO in der Beladungslösung weniger als 0,5 % beträgt.
    5. Beleuchten Sie die Faser mit einer weißen Leuchtdiode (LED) und einem Filterset mit den folgenden Wellenlängen für Anregung/dichroit/Emission: 450-490/510/515 nm (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Alternative Anregungsquellen sind Quecksilber- und Xenon-Fluoreszenzlampen. Verwenden Sie die geringstmögliche Intensität und Größe des Anregungsflecks, um ein Photobleichen des Farbstoffs und eine Schädigung der Zelle zu vermeiden.
    6. Rufen Sie die Ca2+ -Reaktion der Faser (sarkoplasmatische Ca2+- Transienten) hervor, indem Sie rechteckige Stromimpulse (0,8-1,2 ms) durch die beiden Platinelektroden anlegen, die auf beiden Seiten der Experimentierkammer bei 20-22 °C platziert sind.
    7. Sammeln und speichern Sie die Lichtsignale mit einem für Fluoreszenz geeigneten 40-fachen Ölimmersionsobjektiv und einer Photomultiplier-Röhre (PMT), die an einen Digitizer angeschlossen ist (Abbildung 3A und ergänzendes Video S6). Stellen Sie in der Erfassungssoftware eine Skala von 0-200 beliebigen Einheiten (AU) sicher und stellen Sie die Ruhefluoreszenz (F-Rest) des Experiments auf dieser Skala auf 10 AE ein, indem Sie die Größe des Anregungsflecks und die Verstärkung des PMT modulieren. Sobald das Verfahren standardisiert ist, lassen Sie die Verstärkung von einem Experiment zum anderen unverändert und stellen Sie die Skala nur durch geringfügige Anpassungen der Spotgröße ein.
      HINWEIS: Wenn Bewegungsartefakte auftreten, verwenden Sie 20-30 μM N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid (BTS) in der Tyrodenlösung.
    8. Analysieren und kalibrieren Sie die Signale wie folgt:
      1. Tiefpassfilter der gesamten Leiterbahn bei 1 kHz.
      2. Berechnen Sie die F-Pause in 1 s der Leiterbahn, stellen Sie die F-Pause auf 0 ein und messen Sie die Amplitude der Peak-Sarkoplasma-Transienten Ca2+ (F-Peak). Stellen Sie die Amplitude wie in Gleichung (1) dar:
        Formel für das Fluoreszenzintensitätsverhältnis ΔF/F = Fpeak/Frest, mathematische Gleichung.(1)
      3. Berechnen Sie die maximale Ca2+-Konzentration ([Ca2+], μM) unter Verwendung von Gleichung (2)26 und den folgenden Parametern: In-situ-Dissoziationskonstante (Kd) = 1,65 × 105 μM2, maximale Fluoreszenz (Fmax) von 150,9 AE, minimale Fluoreszenz (Fmin) von 0,14 AE, Mag-Fluo-4-Konzentration [D]T von 229,1 μM26. DerF-Peak wurde bereits in Schritt 4.1.8.2 ermittelt.
        Formel zur Berechnung der Kalziumkonzentration in der biochemischen Analyse, die eine Gleichgewichtsgleichung zeigt.(2)
      4. Messen Sie die Anstiegszeit von 10 % bis 90 % der Amplitude (RT, ms), die Dauer bei halbem Maximum (HW, ms) und die Abklingzeit von 90 % bis 10 % der Amplitude (DT, ms). Schätzen Sie dann die Zerfallskinetik gemäß einer Anpassung mit der biexponentiellen Funktion (Gleichung 3):
        Exponentiale Zerfallsformel, Diagramm, Datenanpassungsanalyse, Modellierung transienter Dynamik.(3)
      5. Speichern Sie die Werte der Zeitkonstanten des Zerfalls τ1 und τ2 (ms) und der Amplituden A1 und A226.
  2. Morphometrische Messungen
    1. Montieren Sie einen sauberen Glasobjektträger auf der experimentellen Badkammer. Beschichten Sie den Objektträger mit 2-3 μl Laminin und lassen Sie ihn 30 s trocknen, bevor Sie ~400 μl der Fasersuspension auf den Objektträger gießen. Lassen Sie die Fasern 10-15 Minuten bei Raumtemperatur am Laminin haften.
    2. Evozieren Sie einzelne Zuckungen, um die Lebensfähigkeit der Fasern zu überprüfen, indem Sie rechteckige Stromimpulse (0,8-1,2 ms) durch die beiden Platinelektroden entlang beider Seiten der Experimentierkammer anlegen. Selbst wenn es an Laminin gebunden ist, ist die Kontraktion der Fasern immer noch vor allem an den Extremen sichtbar.
    3. Nehmen Sie Bilder der lebenden Fasern mit 10x- und 20x-Objektiven und einer Kamera mit mindestens 5 Megapixeln auf, die auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop montiert ist. Speichern Sie die Bilder in . TIFF-Format für Offline-Analysen.
      HINWEIS: Möglicherweise ist ein Satz von ~2-6 Bildern erforderlich, um eine lange Faser vollständig zu erfassen.
    4. Stellen Sie ein Mikroskop-Mikrometer-Kalibrierungslineal unter derselben Vergrößerung vor. Speichern Sie die Bilder in . TIFF-Format für Offline-Analysen.
    5. Messen Sie die Längen und Durchmesser der Fasern mit dem Kalibrierungstool der kostenlosen Software für Bildanalysen wie folgt:
      1. Stellen Sie mit Hilfe des Mikroskop-Mikrometer-Kalibrierungslineals eine Beziehung zwischen Pixeln und dem bekannten Abstand (μm) in den Bildern her, indem Sie das Werkzeug Skalieren analysieren/einstellen verwenden, wie in der ergänzenden Abbildung S1 gezeigt.
      2. Messen Sie die Längen der Faser einmal von einer Spitze zur anderen und die Durchmesser an 2-6 verschiedenen Stellen entlang der Faser (1-2 Messungen pro Bild, abhängig von ihrer Länge), wie in der ergänzenden Abbildung S1.
      3. Geben Sie den Wert der Länge (μm oder mm) und den Durchschnitt aller pro Faser gemessenen Durchmesser (μm) an.
  3. Studien zur Expression von Myosin-Schwerketten
    HINWEIS: Einzelheiten zur Bestimmung von MHC durch Immunfluoreszenz43 und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)33,44,45,46 in ganzen Muskeln finden Sie in der ergänzenden Datei 1. Das Protokoll für die Fasertypisierung durch Immunfluoreszenzbestimmung von MHC in der Suspension von FDB-isolierten Fasern lautet wie folgt:
    1. Beschichten Sie jeden der fünf sauberen Objektträger mit 2-3 μl Laminin und lassen Sie es 30 s trocknen, bevor Sie ~300 μl der Fasersuspension auf jeden Objektträger gießen. Lassen Sie die Fasern 4 h bei Raumtemperatur am Laminin haften.
    2. Fixieren Sie die Zubereitungen mit gefriergekühltem Aceton für 30 min bei Raumtemperatur.
    3. 3x schonend mit PBS waschen.
    4. Permeabilisieren Sie die Zellmembranen mit PBS, ergänzt mit 0,7% Triton X-100 für 15 min bei Raumtemperatur.
    5. 3x vorsichtig mit PBS waschen, ergänzt mit 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,04 % Triton X-100, und anschließend mit PBS mit 2 % BSA, 2 % Ziegenserum und 0,4 % Triton X-100 30 min bei Raumtemperatur blockieren.
    6. 3x vorsichtig mit PBS mit 0,2 % BSA und 0,04 % Triton X-100 waschen und mit den primären Antikörpern wie folgt inkubieren:
      1. Verdünnen Sie jeden Anti-MHC-Primärantikörper in einer separaten Durchstechflasche in PBS mit 1 % BSA und 0,04 % Triton X-100: Anti-I (1:1.500), Anti-II (1:600), Anti-IIA (verwenden Sie das gesamte konditionierte Medium aus dem Hybridom) und Anti-IIB (1:500).
      2. Inkubieren Sie jeden Objektträger mit einem Antikörper und den restlichen Objektträger mit PBS als Kontrolle für 12-16 h bei 4 °C.
        HINWEIS: In diesem Protokoll blieben Fasern des Typs IIX in allen Proben unmarkiert.
    7. Waschen Sie vorsichtig 3x mit PBS und inkubieren Sie alle Objektträger mit dem sekundären Antikörper (1:800), der an ein fluoreszierendes grünes Molekül gekoppelt ist, für 1-2 h bei Raumtemperatur.
    8. Färbekern mit 1 μg/mL Hoechst für 15 min.
    9. 3x vorsichtig mit PBS waschen, vorsichtig 20-40 μl Eindeckmedium hinzufügen und ein Deckglas anbringen.
      HINWEIS: Sanfter Lösungswechsel und Waschen stellen sicher, dass Dutzende von Fasern am Objektträger haften, wodurch das Experiment statistisch fundiert ist.
    10. Visualisieren Sie jeden Objektträger mit einem 10x-Objektiv, das für Fluoreszenz geeignet ist, und einem Filtersatz mit den folgenden Wellenlängen für Anregung/dichroit/Emission: 450-490/510/515 nm und zählen Sie alle positiven und negativen Fasern. Alternativ können Sie Fluoreszenzbilder unter den gleichen technischen Bedingungen und mit einer Kamera von mindestens 5 Megapixeln aufnehmen, die auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop montiert ist, und speichern Sie sie in . TIFF-Format für Offline-Analysen.
    11. Zeichnen Sie die positiven und negativen Fasern jedes Objektträgers in einer Datenbank auf und berechnen Sie die Prozentsätze der positiven I-, IIA-, IIB- und Gesamt-II-Fasern basierend auf der Gesamtzahl der im entsprechenden Objektträger vorhandenen Fasern. Berechnen Sie den Prozentsatz der IIX-Fasern, indem Sie die Summe von IIA+IIB vom Prozentsatz der gesamten II-Fasern subtrahieren. Schätzen Sie den Prozentsatz der Hybrid-I/IIA-Fasern, indem Sie die Summe von I+II von einem Wert von 100% subtrahieren. Ziehen Sie schließlich den Prozentsatz der Hybridzellen von der Summe von I und II ab, um die reinen Fasern vom Typ I und II zu erhalten.
      HINWEIS: In MHC-Zusammensetzungsstudien werden Fasertypen mit einem Großbuchstaben bezeichnet, während Isoformen mit einem Kleinbuchstaben46 gekennzeichnet sind.
  4. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
    1. Beschichten Sie einen sauberen Objektträger mit 2-3 μl Laminin und lassen Sie ihn 30 s trocknen, bevor Sie ~300 μl der Fasersuspension auf den Objektträger gießen. Lassen Sie die Fasern 4 h bei Raumtemperatur am Laminin haften.
    2. Fixieren Sie das Präparat mit Carnoy-Lösung (60% absolutes Ethanol, 30% Chloroform, 10% Essigsäure) für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. 90 s mit Hämatoxylin inkubieren.
    4. 3x vorsichtig mit Leitungswasser waschen.
    5. Mit 1 % Eosin Y, hergestellt in 70 % Ethanol, 30 s lang inkubieren.
    6. 3x vorsichtig mit Leitungswasser waschen.
    7. Tauchen Sie 3x in absolutes Ethanol.
    8. 60 s in Xylol inkubieren.
    9. Fügen Sie 20-40 μl Eindeckmedium hinzu und visualisieren Sie es mit einem herkömmlichen Mikroskop. Nehmen Sie Bilder mit der gewünschten Vergrößerung mit einer Farbkamera von mindestens 5 Megapixeln auf.

5. Statistische Analysen und grafische Darstellung

HINWEIS: Die Versuchseinheit ist eine Muskelfaser.

  1. Geben Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung aus und berechnen Sie Konfidenzintervalle von 95 % (KI 95 %) für einige Analysen.
  2. Um die Kinetik von Länge, Durchmesser und Ca2+ -Transienten zwischen Gruppen zu vergleichen, führen Sie eine Varianzanalyse (ANOVA) und Post-hoc-Tests mit der Korrektur von Bonferroni durch.
  3. Bewerten Sie die Normal- und Varianzgleichheit mit den Shapiro-Wilk- bzw. Levene-Tests.
  4. Betrachten Sie die Unterschiede als signifikant, wenn p 0,05 <.

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Ergebnisse

Sarkoplasmatische Ca2+ -Konzentration während eines Zuckens
Um die Durchführbarkeit physiologischer Experimente in der Menge dissoziierter Fasern zu demonstrieren und unsere bisherigen Erkenntnisse über die Erregungs-Kontraktions-Kopplung (ECC) und die Fasertypen zu erweitern, wurden Ca2+-Transienten in Fasern aller Muskeln erfasst. Erstens zeigten FDB (n = 5) und EDL (n = 7) eineCa-2+-Kinetik, die als Morphologietyp II (MT-II) bekannt ist. Dies sind schnelle, stacheli...

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Diskussion

Als Ergänzung zu den Modellen, die für die Untersuchung der Biologie der reifen Skelettmuskulatur zur Verfügung stehen, zeigen wir hier die erfolgreiche enzymatische Dissoziation einer Reihe von Mausmuskeln mit kurzen, mittleren und langen Fasern. Diese Fasern ermöglichen den Nachweis der Generalisierbarkeit der MT-II-Kinetik der Ca2+ -Transienten im Skelettmuskel. Weiterhin wurden die Fasertypen in den intakten, ganzen Muskeln klassifiziert. Da der FDB der am häufigsten verwendete Muskel für physiologische Ex...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Professor Robinson Ramírez von UdeA für die Hilfe mit Tieren und einigen Fotos und Carolina Palacios für die technische Unterstützung. Johan Pineda von Kaika half uns beim Aufbau der Farb- und Fluoreszenzkameras. Shyuan Ngo von der University of Queensland hat das Manuskript freundlicherweise Korrektur gelesen. Diese Studie wurde von der CODI-UdeA (2020-34909 vom 22. Februar 2021 und 2021-40170 vom 31. März 2022, SIU) und dem Planungsbüro-UdeA (E01708-K und ES03180101), Medellín, Kolumbien, an JCC finanziert. Die Geldgeber beteiligten sich nicht an der Datenerhebung und -analyse, dem Schreiben von Manuskripten oder der Einreichung von Manuskripten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
absolutes EthanolSigma Aldrich32221
AcetonMerck179124
AcrylamidGibco BRL15512-015
AmmoniumpersulfatPanreac141138.1610
Anti-Myosin I AntikörperSigma AldrichM4276Primärer Antikörper
Anti-Myosin II AntikörperSigma AldrichM8421Primärer Antikörper
Anti-Myosin IIA AntikörperAmerican Type Culture CollectionSC-71Primärer Antikörper. Abgeleitet von HB-277 Hybridom
Anti-Myosin IIB AntikörperEntwicklungsstudien Hybridoma BankBF-F3-c Primärer Antikörper
Bis-AcrylamidAMRESCO0172
RinderserumalbuminThermo ScientificB14
Bradford-ReagenzMerck1.10306.0500
BromphenolblauCarlo Erba428658
CalciumcarbonatMerck102066
Calciumdichlorid (CaCl2)Merck2389
ChloroformSigma Aldrich319988
Kollagenase Typ 2WorthingtonCLS-2/LS004176
Consul-MountThermo Scientific9990440
Coomassie Brillantblau R 250 Merck112553
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma AldrichD2650
Dithiothreitol (DTT)AMRESCO0281
Edetinsäure (EDTAAMRESCO0322
Eosin YSigma AldrichE4009
GlycerolPanreac 
GlycinPanreac151340.1067
ZiegenserumSigma AldrichG9023
HämatoxylinThermoScientific 6765015
HEPESAMRESCO0511
Hoechst 33258Sigma Aldrich861405
ImidazolAMRESCOM136
IsopentanSigma AldrichM32631
LamininSigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4, AMInvitrogenM14206Nur in DMSO hergestellt. Pluronsäure ist nicht erforderlich und sollte nicht verwendet werden, um eine Verschlechterung der Fasern zu vermeiden.
MercaptoethanolApplichemA11080100
MethanolProtokimicaMP10043
MäuseMehrereMehrereFür dieses Manuskript haben wir nur C57BL/6 Mäuse verwendet. Einige vorläufige Ergebnisse haben jedoch gezeigt, dass das Protokoll für Schweizer Webster-Mäuse gleichen Alters und Gewichts gut funktioniert.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N,N,N',N'-Tetramethylethan-1,2-diamin (TEMED)PromegaV3161
N-Benzyl-p-toluolsulfonamid (BTS)Tocris1870
Optimale Schneidverbindung (OCT)Thermo Scientific6769006
SekundärantikörperThermo ScientificA-11001Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488
NatriumdodecilsulfatPanreac 
TRIS 0,5 M, pH 6,8 AMRESCOJ832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethanAMRESCOM151
Triton X-100AMRESCOM143
Materials
Dissektionskammer Maßgeschneiderte
geladene ObjektträgerErie Scientific5951PLUS
Experimentelle BadkammerWarner InstrumentsRC-27NE2Schmale Badkammer mit Feldstimulation, kombiniert auf einer beheizten Plattform PH-6
Feine PinzetteWorld Precision Instruments500338, 500230
Feine SchereWorld Precision InstrumentsVannas Schere 501778
Glas Pasteur PipettenMehrerefeuerpolierte Spitzen
Glasfläschchen mit DeckelMehrere2-3 mL Volumen
OperationsschereWorld Precision Instruments501223-G
Equipment
ZentrifugeThermo ScientificSL 8R
KonfokalmikroskopOlympusFV1000
KryostatLeicaCM1850
DigitalkameraZeissErc 5s und Axio 305Der Axio 305, gekoppelt mit dem Stereoskop Stemi 508, wurde für die Aufnahme von Bildern während der Dissektion verwendet, während Erc 5s oder Axio 208, gekoppelt mit dem Axio Observer A1 Mikroskop, für die Aufnahme von Bildern der isolierten Fasern und der Immunfluoreszenz-Assays verwendet wurden
. DigitizerMolecular Devices1550A Digidata
ElektrophoresekammerBio RadMini-Protean IV
Inverses Mikroskop, gekoppelt an die FluoreszenzZeissAxio Observer A1Gekoppelt an eine geeignete Lichtquelle, Filter und Objektive für die Fluoreszenz
PhotomultiplierHoribaR928 Röhre, Hamamatsu, in einem D104 Photometer, HoribaGekoppelt mit der lateralen Öffnung des Fluoreszenzmikroskops
StereoskopZeissStemi 508
Stimulator Grass Instrumente S6
Wasserbad MemmertWNE-22
XilolSigma Aldrich808691
Software
Freie Software für ElektrophoresenanalysenUniversity of KentuckyGelBandFitter v1.7http://www.gelbandfitter.org
Freie Software für Bildanalyse undMorphometrie National Institutes of HealthImageJ v1.54https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Lizenzierte Software für Ca2+ Signalerfassung und -analyseMolecular DevicespCLAMP v10.05https://www.moleculardevices.com
Lizenzierte Software für statistische Analysen und grafische DarstellungOriginLabOriginPro 2019https://www.originlab.com/
) , 14232912111323631209

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Isolierung von MuskelfasernCalcium-TransientenFasertypzusammensetzungmorphometrische CharakterisierungErregungs-Kontraktions-KopplungCollagenase-VerdauEpifluoreszenzmikroskopie
Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis
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