Methodenartikel

Räumliche hochauflösende Analyse der Genexpressionsniveaus in Sehnen

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DOI:

10.3791/65852

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8. März 2024

 , 
1Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird beschrieben, wie ein optimiertes In-situ-Protokoll für Sehnen durchgeführt wird. Diese Methode befasst sich mit der Gewebepräparation, der Schnittpermeabilisierung, dem Sondendesign und den Signalamplifikationsmethoden.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren wurden viele Protokolle für hochauflösende Transkriptomik in vielen verschiedenen Bereichen der Medizin und Biologie entwickelt. Matrixreiche Gewebe und insbesondere Sehnen blieben jedoch aufgrund ihrer geringen Zellzahl, der geringen RNA-Menge pro Zelle und des hohen Matrixgehalts zurück, was ihre Analyse erschwerte. Eines der jüngsten und wichtigsten Einzelzellwerkzeuge ist die räumliche Analyse der Genexpressionsniveaus in Sehnen. Diese räumlichen RNA-Werkzeuge sind besonders wichtig für Sehnen, um spezifische Zellen neuer und unbekannter Populationen zu lokalisieren, Einzelzell-RNA-Seq-Ergebnisse zu validieren und den Einzelzell-RNA-Seq-Daten einen histologischen Kontext hinzuzufügen. Diese neuen Methoden werden die Analyse von RNA in Zellen mit außergewöhnlicher Empfindlichkeit und den Nachweis von Einzelmolekül-RNA-Zielen auf Einzelzellebene ermöglichen, was dazu beitragen wird, Sehnen molekular zu charakterisieren und die Sehnenforschung zu fördern.

In diesem Methodenpapier konzentrieren wir uns auf die verfügbaren Methoden zur Analyse der räumlichen Genexpressionsniveaus in histologischen Schnitten, indem wir neuartige in situ Hybridisierungsassays verwenden, um Ziel-RNA in intakten Zellen auf Einzelzellebene nachzuweisen. Zunächst werden wir uns darauf konzentrieren, wie das Sehnengewebe für die verschiedenen verfügbaren Assays vorbereitet werden kann und wie man zielspezifische Signale ohne Hintergrundrauschen, aber mit hoher Sensitivität und hoher Spezifität amplifiziert. Anschließend werden spezifische Permeabilisierungsmethoden, die verschiedenen Sondendesigns und die derzeit verfügbaren Signalverstärkungsstrategien beschrieben. Diese einzigartigen Methoden zur Analyse der Transkriptionsniveaus verschiedener Gene in Einzelzellauflösung werden die Identifizierung und Charakterisierung der Sehnengewebezellen in jungen und älteren Populationen verschiedener Tiermodelle und menschlicher Sehnengewebe ermöglichen. Diese Methode wird auch dazu beitragen, die Genexpression in anderen matrixreichen Geweben wie Knochen, Knorpel und Bändern zu analysieren.

Einleitung

Sehnen sind Bindegewebe, das die Kraftübertragung zwischen Muskel und Knochen ermöglicht1. Entwicklungsbedingt stammen axiale Tenozyten aus mesenchymalen Zellen innerhalb des Sklerotoms der Somiten2; Die Gliedmaßensehnen stammen aus dem Mesoderm der lateralen Platte; und kraniale Sehnen entspringen der Linie der kranialen Neuralleiste 3,4. Die Sehne kann durch die Expression des Skleraxis-Transkriptionsfaktors5 charakterisiert werden, obwohl mehrere Marker auch eine Schlüsselrolle bei der Sehnenentwicklung spielen, darunter Tenomodulin, Irokesenschnitt und frühe Wachstumsreaktion 1/2 6,7,8,9.

Trotz der wenigen bekannten Marker der Sehne bleibt eine tiefergehende Charakterisierung im Allgemeinen eine Herausforderung, da die Sehne Zellen enthält, die sich über einen Gradienten biomechanischer Eigenschaften erstrecken. Vom myotendinösen Übergang über die Sehnenmitte bis hin zur stärker verkalkten Enthese befinden sich die Sehnenzellen in extrazellulären Matrizen, die sich in ihren Zugeigenschaften unterscheiden. Da die Sehne Zugbelastungen standhalten muss, die durch den Unterschied in der mechanischen Festigkeit zwischen Weich- und Hartgewebe entstehen, ist die räumliche Organisation der Zellen in der Sehne für ihre Funktion besonders wichtig. Über diese Sehnensubpopulationen ist jedoch nur wenig bekannt.

Viele hochauflösende räumliche Transkriptomik-Werkzeuge können verwendet werden, um mit der Aufklärung von Zellsubpopulationen zu beginnen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Einzelzell-RNA-Seq oder In-situ-Hybridisierung . Während diese räumlichen Profiling-Assays jedoch dazu beitragen, die RNA-Expression im Gewebe nach Mikrodissektion oder Schnitt aufzudecken, können diese Methoden bei der Durchführung von Sehnengewebe eine Herausforderung darstellen. Sehnen sind matrixreiche Gewebe, die zu fast 86 % aus Kollagen in der Trockenmasse10 bestehen, was es schwierig macht, die Zellen für die Sequenzierung zu extrahieren. Aufgrund der Komplikationen bei der Isolierung von Zellen aus der Matrix, der hypozellulären Natur der Sehne11 und der relativ niedrigen RNA-Anzahl ist die Sehne ein schwer zu analysierendes Gewebe.

In diesem Artikel stellen wir eine Methode zur Optimierung neuartiger in situ Hybridisierungsassays vor, um sie für Sehnen zu nutzen, indem wir Methoden zur Gewebepräparation, Permeabilisierung und Sondendesign bereitstellen. In Verbindung mit bestehenden Sequenzierungstechnologien kann dies Forschern helfen, Sehnensubpopulationen über sich entwickelnde, adulte oder verletzte Sehnen hinweg räumlich zu charakterisieren und dabei die Sensitivität und Spezifität des Assays zu erhöhen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und den AAALAC-Richtlinien durchgeführt. Die Experimente wurden nach dem genehmigten Protokoll #2013N000062 am Massachusetts General Hospital durchgeführt. In dieser Studie wurden C57BL/J6-Mäuse (5 Wochen alt und P0) verwendet. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Probenvorbereitung und -fixierung

  1. Euthanasieren Sie Mäuse in einer CO2 -Kammer, gefolgt von einer Gebärmutterhalsdislokation als sekundäre Methode der Euthanasie. Schneiden Sie dann mit einer Schere die Hintergliedmaßen der Maus entlang des Hüftgelenks12 ab. Tauchen Sie die Hintergliedmaßen der Maus in ein Szintillationsfläschchen in ausreichend 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung, um die Probe vollständig zu bedecken, und fixieren Sie das Gewebe für 24 Stunden.
    HINWEIS: Anstelle von 4 % PFA kann auch 10 % Formalin zur Fixierung verwendet werden. Nach der Fixierung kann die Probe bis zur weiteren Verarbeitung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelagert werden. Durch die Fixierung der gesamten Hintergliedmaße können wir die Spannung auf der Sehne aufrechterhalten und haben die Möglichkeit, die Enthese, die Sehnenmitte oder den myotendinösen Übergang zu untersuchen.
  2. Nachdem Sie das PFA aus dem Szintillationsfläschchen entfernt haben, waschen Sie die Probe 3 x 10 Minuten lang mit 1x PBS, indem Sie so viel PBS hinzufügen, dass die Probe bedeckt ist. Tauchen Sie dann die Hintergliedmaßen in 0,5 M EDTA bei 4 °C unter Rühren für 1-2 Wochen und ersetzen Sie sie alle 2-3 Tage durch frisches EDTA.
  3. Nach der Entfernung des EDTA waschen Sie die Probe 3 x 10 min mit 1x PBS, dehydrieren Sie die Proben in 70% EtOH und betten Sie sie in der gewünschten Ausrichtung in Paraffin ein. Verwenden Sie herkömmliche FFPE-Schnitttechniken, um das Gewebe mit einer Dicke von 3 μm zu schneiden und übertragen Sie die Schnitte auf einen behandelten, geladenen Objektträger (siehe Materialtabelle)13.
    HINWEIS: Die Abschnitte können bei 4 °C gelagert werden, bevor mit den nächsten Schritten fortgefahren wird.
  4. Entparaffinisierung
    1. Die Dias auf einer heißen Platte bei 60 °C 1 h backen und anschließend auf Raumtemperatur (RT) kommen lassen. Um das Paraffinwachs von den Objektträgern zu entfernen, legen Sie die Objektträger auf ein Objektträgergestell und senken Sie sie in eine mit Xylol gefüllte Färbeschale. In frischem Xylol 3 x 5 min wiederholen.
      ACHTUNG: Xylol ist gefährlich; Mit Vorsicht behandeln.
    2. Um die Schnitte zu rehydrieren, tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang pro Waschgang in die folgenden Objekte, alles bei RT: Waschen Sie 2x in 100 % EtOH, 1x in 75 % EtOH verdünnt in dH2O, 1x in 50 % EtOH verdünnt in PBS, 1x in 25 % EtOH verdünnt in PBS und 2x in PBS.
      HINWEIS: Alle Rehydratisierungsschritte werden mit den Objektträgern auf einem Objektträgergestell und mit den verschiedenen EtOH-Lösungen in Färbeschalen durchgeführt.

2. Adaption des RNAscope-Protokolls (kommerzialisiertes ISH)14

  1. Vorbereiten von Lösungen und Sonden
    1. Bereiten Sie die TEG-Lösung für die Vorbehandlung von geschnittenen Proben vor, indem Sie 25 mM Tris-HCl bei pH 8, 10 mM EDTA und 50 mM Glukose kombinieren. Es ist ein ausreichendes Volumen für alle zu behandelnden Proben herzustellen oder überschüssige Proben vorzubereiten. Filter-sterilisieren und bei RT lagern; Mischen Sie die Lösung richtig, bevor Sie sie verwenden.
    2. Bereiten Sie genügend 1x Waschpuffer (siehe Materialtabelle) für alle Wäschen vor und lagern Sie ihn bei RT.
    3. Erwärmen Sie die Sonden in einem 40 °C heißen Wasserbad oder Inkubator 10 Minuten lang. Bereiten Sie dann die Sonden gemäß dem ISH-Protokoll14 vor.
  2. Vorbehandlung von Proben
    1. Anstatt die empfohlene Vorbehandlungslösung zu verwenden, tauchen Sie die Objektträger 4 h lang bei 60 °C in eine Färbeschale mit TEG-Puffer.
      HINWEIS: Die Inkubation des TEG-Puffers kann um bis zu 6 Stunden verlängert werden, wenn das Gewebe besonders dicht ist oder wenn die Antigengewinnung des interessierenden RNA-Bindungsmotivs eine Herausforderung darstellt. In diesem Fall kann hier ein Stopppunkt eingebaut werden, bei dem die Objektträger getrocknet und über Nacht im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt werden.
    2. Nehmen Sie die Proben aus dem Puffer und lassen Sie sie trocknen. Ziehen Sie dann mit einem hydrophoben Barrierestift um die Proben herum, tauchen Sie sie in eine andere Färbeschale mit Protease IV und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang bei 40 °C in einem Ofen.
      HINWEIS: Wir empfehlen Protease IV für erwachsene Mäuse. Bei der Verwendung jüngerer Mäuse, wie z. B. P0, empfehlen wir, ein milderes Enzym, wie z. B. Protease III, für 30 Minuten zu verwenden. Beobachten Sie bei der Fehlerbehebung für verschiedene Altersgruppen die Unversehrtheit der Sehne und prüfen Sie sie auf Degradation. Wenn das Gewebe dissoziiert oder abgebaut wird, verkürzen Sie die Inkubationszeit oder wechseln Sie die verwendete Protease.
    3. Waschen Sie die Proben erneut 30 Minuten lang in TEG-Puffer und hybridisieren Sie dann die Sonden gemäß dem ISH-Protokoll14.
    4. Geben Sie 50-100 μl Einbettreagenz auf die Probe. Legen Sie ein Deckglas auf die Proben für die Mikroskopie. Verwenden Sie bei der Bildgebung eine hohe Vergrößerung (40-faches Objektiv oder höher), um das Signal zu betrachten.

3. Anpassung des HCR ISH-Protokolls15

  1. Nachfixierung
    1. Bereiten Sie 4 % PFA (in PBS), PBT-Lösung (0,1 % Tween-20 in PBS) und Proteinase K in PBS (Stammkonzentration von 10 mg/ml, Endkonzentration von 5 μg/ml) vor.
    2. Um den ersten Postfix-Schritt zu beginnen, tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in eine Färbeschale mit 4 % PFA; Entfernen Sie dann die 4%ige PFA-Lösung und lagern Sie sie für die Verwendung in späteren Schritten. Spülen Sie die Objektträger 2 x 5 min in PBT-Lösung und entfernen Sie die PBT-Lösung. Legen Sie die Objektträger für 5 min in eine Färbeschale mit Proteinase K-Lösung (5 μg/ml) und spülen Sie sie 2 x 5 min in der PBT-Lösung ab.
    3. Beginnen Sie mit dem zweiten Postfix-Schritt und tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in das 4%ige PFA.
      HINWEIS: Dies sind die gleichen 4 % PFA, die aus Schritt 3.1.2 eingespart wurden.
    4. Spülen Sie die Objektträger 3 x 5 min in der PBT-Lösung.
      HINWEIS: Alle Schritte nach der Fixierung werden mit den Objektträgern auf einem Objektträgergestell und in Färbeschalen mit den jeweiligen Lösungen durchgeführt.
  2. Acetylierung
    1. Bereiten Sie die Acetylierungslösung vor, die 625 μl Essigsäureanhydrid, 3,3 ml 1 M Triethanolamin (TEA)-Puffer und 246 ml ddH2O enthält. Achten Sie darauf, gut zu mischen und sofort nach der Zubereitung zu verwenden.
    2. Legen Sie die Objektträger 10 Minuten in die Acetylierungslösung und spülen Sie sie dann 3 x 5 Minuten in PBT-Lösung. Spülen Sie die Objektträger in ddH2O ab und lassen Sie sie 30 min an der Luft trocknen. Zeichnen Sie dann mit einem hydrophoben Barrierestift um die Proben herum.
      HINWEIS: Alle Acetylierungsschritte werden mit den Objektträgern auf einem Objektträgergestell und in Färbeschalen mit den jeweiligen Lösungen durchgeführt
  3. Hybridisierung
    1. Den Hybridisierungspuffer auf 37 °C vorheizen und eine befeuchtete Kammer auf 37 °C vorwärmen.
      ACHTUNG: Der Puffer enthält Formamid, ein gefährliches Material. Wenn die Objektträger nicht ausreichend trocken sind, tupfen Sie die Ränder mit einem Labortuch ab, um überschüssiges dH2O zu entfernen.
    2. Bereiten Sie Sondenlösungen vor, indem Sie 0,4 pmol jeder Sondenmischung zu 100 μl Hybridisierungspuffer hinzufügen.
      HINWEIS: Wenn Sie dHCR-Bildgebung verwenden, verwenden Sie eine höhere Sondenkonzentration, um die Effizienz der Sondenhybridisierung zu verbessern.
    3. Bereiten Sie 4 l Natriumchlorid-Natriumcitrat-Puffer (20x SSC) vor, indem Sie 3 M NaCl (701,1 g NaCl in einem Endvolumen von 4 l) und 0,3 M Na3CH6H5O7•2H2O (352,8 g) kombinieren und dann den endgültigen pH-Wert durch Zugabe von HCl oder 10 N NaOH auf 7 einstellen. Fügen Sie so viel H2O hinzu, dass es 4 l erreicht. Bereiten Sie 5x SSCT vor, indem Sie 20x SSC auf 5x verdünnen und so viel 10 % Tween 20 hinzufügen, dass es 0,1 % des Gesamtvolumens beträgt.
    4. Geben Sie 200 μl Hybridisierungspuffer in die Probe, legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammer und lassen Sie die Objektträger 10 Minuten lang inkubieren. Entfernen Sie die Hybridisierungslösung und lassen Sie den überschüssigen Puffer auf dem Objektträger abtropfen, indem Sie die Ränder mit einem Labortuch abtupfen.
    5. Geben Sie 100 μl der vorbereiteten Sondenlösung auf die Probe und legen Sie ein Deckglas auf die Probe. Über Nacht im Ofen oder ca. 12-16 h in einer Kammer inkubieren, die mit einer Lösung befeuchtet ist, die 5x SSC und 50% Formamid enthält. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
      HINWEIS: Da die Inkubation über Nacht erfolgt, soll die Zugabe des Deckglases die Verdunstung minimieren.
    6. Lassen Sie ein Aliquot aus 5x SSCT-Lösung in einem 37 °C warmen Wasserbad und ein zweites Aliquot bei RT. Antizipieren Sie das benötigte Volumen dieser Aliquote basierend auf der Probenanzahl und der Anzahl der Wäschen im nächsten Schritt.
  4. Waschen
    1. Bereiten Sie unter Verwendung der zuvor vorgewärmten 5x SSCT-Lösung 75 % Waschpuffer/25 % 5x SSCT, 50 % Waschpuffer/50 % 5x SSCT und 25 % Waschpuffer/75 % 5x SSCT-Lösungen vor.
    2. Um überschüssige Sonden zu entfernen, tauchen Sie die Objektträger 15 Minuten pro Waschgang bei 37 °C in Reihe in 75 % Waschpuffer/25 % 5x SSCT, 50 % Waschpuffer/50 % 5x SSCT und 25 % Waschpuffer/75 % 5x SSCT. Lassen Sie die Deckgläser von den Proben abschwimmen.
    3. Inkubieren Sie die Objektträger 2 x 15 min mit 100% 5x SSCT und tauchen Sie sie dann für 5 min bei RT in 5x SSCT ein.
      HINWEIS: Die Waschschritte können mit den Objektträgern auf einem Objektträgergestell und in Färbeschalen mit den jeweiligen Lösungen oder mit den Lösungen als Tröpfchen durchgeführt werden.
  5. Verstärkung
    1. Bereiten Sie 6 pmol Haarnadel h1 und 6 pmol Haarnadel h2 vor, indem Sie 2 μl eines 3 μM Stammes abkühlen lassen (90 s lang bei 95 °C erhitzen und auf RT abkühlen). Schützen Sie die Haarnadeln während dieses Vorgangs vor Licht.
      HINWEIS: Die HCR-Hairpins h1 und h2 werden in einem Hairpin-Speicherpuffer geliefert und sind bereit für die Schnappkühlung. Coole h1- und h2-Haarnadeln in separate Röhren stecken.
    2. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie die Ränder mit einem Labortuch abtupfen. Geben Sie dann 200 μl Amplifikationspuffer auf die Probe und legen Sie sie für 30 Minuten bei RT in eine befeuchtete Kammer. Bereiten Sie die Haarnadelmischung vor, indem Sie snapcooled h1 Hairpins und snapcooled h2 Hairpins zu 100 μl Amplifikationspuffer bei RT hinzufügen.
    3. Entfernen Sie den Amplifikationspuffer und lassen Sie die überschüssige Flüssigkeit auf dem Objektträger ab, indem Sie die Ränder mit einem Labortuch abtupfen. Fügen Sie 100 μl der zuvor vorbereiteten Haarnadelmischung hinzu und legen Sie Parafilm auf die Probe. Inkubieren Sie die Objektträger für mindestens 4 Stunden oder über Nacht in einer dunklen, befeuchteten Kammer bei RT.
    4. Um überschüssige Haarnadeln zu entfernen, tauchen Sie die Objektträger in 5x SSCT in eine Färbeschale und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei RT. Wiederholen Sie die Wäsche in frischem 5x SSCT für 30 min und ein drittes Mal für 5 min.
    5. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie die Ränder mit einem Labortuch abtupfen und 50-100 μl Einbettreagenz auf die Probe geben. Legen Sie ein Deckglas auf die Proben für die Mikroskopie. Verwenden Sie bei der Bildgebung eine hohe Vergrößerung (40-faches Objektiv oder höher), um das Signal zu betrachten.

Ergebnisse

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Abbildung 1: Poly-A-RNA-Expression in der Achillessehne adulter Mäuse mit RNAScope. Repräsentatives Bild der erfolgreichen Poly-A-Markierung in der Achillessehne der Maus (linkes Bild) unter Verwendung des kommerzialisierten ISH-Assays. Die Kolokalisierung mit DAPI bestätigt die Spezifität der Sonde (mittleres und rechtes Feld) und ermöglicht die Kontrolle von Hintergrundgeräuschen. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop Leica SPE bei 63x aufgenommen. Maßstabsleisten = 20 μm. Abkürzungen: ISH = in situ Hybridisierung; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Poly-A-RNA-Expression in der Achillessehne der P0-Maus mittels RNAScope. Repräsentatives Bild der erfolgreichen Poly-A-Markierung in Fersenbewesen der P0-Maus (linkes Bild) unter Verwendung des kommerzialisierten ISH-Assays. Die Kolokalisation mit DAPI und minimales Hintergrundrauschen bestätigen die Spezifität der Sonde (mittleres und rechtes Panel). Die Sehne ist durch eine gestrichelte Linie gekennzeichnet. Die Bilder wurden mit einem ZEISS Axio Imager Mikroskop aufgenommen. Maßstabsleisten = 20 μm. Abkürzungen: ISH = in situ Hybridisierung; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dieses Protokoll wird Forschern helfen, kommerziell verfügbare In-situ-Hybridisierungswerkzeuge zu nutzen und sie für den Einsatz in adultem Sehnengewebe anzupassen. Dies ermöglicht es uns letztendlich, die Transkriptionsniveaus verschiedener Gene in räumlich informierter Einzelzellauflösung zu analysieren. Ein erfolgreicher Durchlauf eines ISH-Assays wird eine hohe Spezifität für die interessierenden Ziele und ein minimales Hintergrundrauschen aufweisen. Das Protokoll kann sowohl bei Erwachsenen als auch bei Neugeborenen an der Achillessehne angewendet werden (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4). Poly A kann als Kontrolle verwendet werden, um einen erfolgreichen Lauf zu validieren, indem qualitativ bestätigt wird, dass die erwarteten RNA-Konzentrationen in der Probe vorhanden sind.

Es gibt jedoch mehrere Möglichkeiten, wie die ISH-Protokolle möglicherweise eine Fehlerbehebung erfordern. Zum Beispiel zeigt Abbildung 5 eine unzureichende Sondenhybridisierung von Poly A in der Sehne, so dass mehrere Bereiche der Sehne kein Poly A-Signal aufwiesen, obwohl die DAPI-Gegenfärbung zeigte, dass tatsächlich Zellen vorhanden waren. Darüber hinaus kann die Gewebemorphologie gestört werden, wenn das Gewebe in den Postfix-Schritten bei HCR durch verlängerte Proteinase-K-Inkubationszeit (Abbildung 6) oder in den Vorbehandlungsschritten bei RNAScope durch verlängerte Protease-IV-Inkubation überverdaut wird. Schließlich ist Abbildung 7 ein Beispiel dafür, wie eine Negativkontrolle aussehen würde, wenn die RNA-Hybridisierungssonde nicht hinzugefügt wird, aber immer noch eine nukleäre Gegenfärbung verwendet wird.

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Abbildung 3: Expression der Skleraxis-RNA in der Achillessehne der adulten Maus mittels HCR. Repräsentatives Bild der erfolgreichen Skleraxis-RNA-Markierung in der Achillessehne der adulten Maus (linkes Bild) mittels HCR. DAPI wird als nuklearer Gegenfleck (mittlere Platte) verwendet. Die Kolokalisation mit DAPI bestätigt die Spezifität der Sonde (rechtes Bild). Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop Leica SPE bei 63x aufgenommen. Maßstabsleisten = 20 μm. Abkürzungen: HCR = Hybridisierungskettenreaktion; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Poly-A-RNA-Expression in der P0-Achillessehne der Maus mittels HCR. Repräsentatives Bild der Poly-A-RNA-Markierung in der Achillessehne der P0-Maus mittels HCR. DAPI und Poly A markieren sowohl den Knochen als auch die Achillessehne am Fersenbein (linker bzw. rechter Bereich). Die Kolokalisation von DAPI- und Poly-A-Sonden über beide Gewebe und minimales Hintergrundrauschen bestätigen einen erfolgreichen HCR-Lauf (rechtes Bild). Die Bilder wurden mit einem ZEISS Axio Imager Mikroskop aufgenommen. Maßstabsleisten = 20 μm. Abkürzungen: HCR = Hybridisierungskettenreaktion; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Erfolgloser HCR-Lauf mit Poly-A-RNA-Sonden in der P0-Achillessehne der Maus. Repräsentatives Bild der erfolglosen Poly-A-RNA-Markierung in der Achillessehne der P0-Maus mittels HCR. Mit der DAPI wurden Kerne im Knochen und in der Sehne des Fersenbeins markiert (linkes Bild), aber die Poly A HCR-Sonde dringte nicht in die gesamte Sehne ein (mittleres und rechtes Bild, siehe weiße Pfeilspitzen). Poly A markierte jedoch erfolgreich den größten Teil des Knochens. Die Bilder wurden mit einem ZEISS Axio Imager Mikroskop aufgenommen. Maßstabsleisten = 20 μm. Abkürzungen: HCR = Hybridisierungskettenreaktion; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Beispiel für eine HCR-Poly-A-Markierung in einer überverdauten Achillessehne adulter Maus. Repräsentatives Bild der Poly-A-RNA-Markierung in einer überverdauten Achillessehne einer adulten Maus mittels HCR. Poly A und DAPI kolokalisieren in dieser Probe korrekt (rechtes Bild), aber die typische einachsige Morphologie der Sehne ist gestört (weiße Pfeilspitzen). Die Bilder wurden mit einem ZEISS Axio Imager Mikroskop aufgenommen. Maßstabsleisten = 20 μm. Abkürzungen: HCR = Hybridisierungskettenreaktion; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Negativkontrolle für das Poly-A-RNAscope in der Achillessehne adulter Mäuse. Repräsentatives Bild der Negativkontrolle für die Poly-A-RNA-Markierung, bei der die Poly-A-Sonde nicht hinzugefügt wurde, die Amplifikationssonden jedoch schon. Wie erwartet markierte DAPI den Zellkern erfolgreich (linkes Bild), aber es lag kein Signal für Poly A (mittleres Bild) vor. Die Bilder wurden mit einem ZEISS Axio Imager Mikroskop aufgenommen. Maßstabsleisten = 20 μm. Abkürzung: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

In diesem Artikel beschreiben wir Modifikationen, die vorgenommen wurden, um bestehende ISH-Werkzeuge so zu nutzen, dass sie mit einem hohen Maß an Spezifität und Sensitivität im Sehnengewebe eingesetzt werden können. Da es sich bei der Sehne um ein Gewebe mit hoher Matrixdichte handelt, müssen häufig Protokollanpassungen vorgenommen werden, um einen ähnlichen Grad an Sondenpenetration und Spezifität zu erreichen. Diese spezifischen Permeabilisierungsmethoden und Signalverstärkungsstrategien des Sehnengewebes sind ein wesentlicher Bestandteil der Verbesserung der Wirksamkeit der besprochenen ISH-Protokolle. Ohne diese Schritte ist es für Sonden schwierig, eine starke und spezifische Interaktion mit der RNA in der Sehne zu haben.

Im RNAscope14 muss der verwendete Vorbehandlungspuffer angepasst werden, damit das Protokoll im Sehnengewebe effektiver wirkt. Genauer gesagt verbessert die Verwendung des TEG-Puffers als Vorbehandlung den Zugang von Sonden zur Ziel-RNA. Zusätzlich zum TEG-Puffer wird die Protease-IV-Behandlung über die Standardzeit hinaus verlängert, so dass sie 45 min bis 1 h dauert. In HCR15 wurde die Länge der Waschungen erhöht, und vor dem Start des RNA-FISH-Assays wurden Postfix-Schritte hinzugefügt. Die Postfix-Schritte umfassten die Hinzufügung von Inkubationsschritten in 4% PFA, PBT, Proteinase K und Acetylierungslösung. Zusammengenommen tragen diese Modifikationen dazu bei, den Zugang der Sonde zur Sehnen-RNA zu verbessern und das Hintergrundrauschen zu reduzieren16,17. Obwohl diese Protokollmodifikationen dazu beitragen, die Spezifität und Sensitivität der in der ISH verwendeten Sonden zu erhöhen, indem sie die verwendeten Vorbehandlungslösungen modifizieren und Nachfixierungsschritte hinzufügen, um die Zugänglichkeit für die Sondenbindung an RNA zu erhöhen, gibt es Einschränkungen, die durch das Sondendesign entstehen.

Um die Herausforderungen zu verringern, die sich aus der Zugänglichkeit von RNA für Sonden ergeben, können zusätzliche Modifikationen vorgenommen werden, um ISH-Assays zu optimieren. Wenn dHCR-Bildgebung - eine Methode zur digitalen absoluten Quantifizierung von mRNA15 - verwendet wird, wird empfohlen, die Konzentration der Sonde zu erhöhen, um die Effizienz der Sondenhybridisierung zu verbessern. Darüber hinaus stellt die Verwendung einer kürzeren Zeitspanne in den Amplifikationsschritten sicher, dass Einzelmolekülpunkte beugungsbegrenzt sind. Längere Inkubationszeiten können bei der Bildgebung zu einer höheren Autofluoreszenz des Muskels führen. Wenn die gewählte Sehne dichter und/oder größer ist als die Achillessehne der adulten Maus, empfehlen wir, die Dauer des 4%igen PFA-Fixationsschritts zu verlängern.

Diese Modifikationen an den oben genannten kommerziellen ISH-Protokollen sind besonders hilfreich für adultes murines Gewebe oder dichteres Gewebe, das längere Vorbehandlungs- oder Fixationsschritte erfordert. Obwohl diese Modifikationen an bestehenden Protokollen dazu beitragen, die Zugänglichkeit der Sonden zur RNA zu verbessern, können einige Sonden bei älteren Mäusen eine höhere Konzentration oder eine längere Inkubationszeit erfordern als bei jüngeren Mäusen oder Neugeborenen, abhängig von der Zugänglichkeit der Ziel-RNA-Motive, an die die Sonden in den verschiedenen Alterskohorten binden. In Bezug auf den Einsatz von Protease in den Vorbehandlungsschritten von RNAscope empfehlen wir die Verwendung von Protease IV für 45 min für adulte Maussehnen, aber Protease III für 30 min für Neugeborenensehnen. Um die Wirksamkeit des Assays zu bewerten, Anpassungen am Protokoll zu beurteilen oder die Expression zwischen Proben allgemein zu vergleichen, können mehrere Kontrollen verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Poly-A-Sonde mit einer nuklearen Gegenfärbung verglichen werden, die verwendet wird, um die Spezifität des Laufs zu beurteilen, die RNA-Verteilung/den RNA-Abbau in der Probe zu bewerten und zu bestätigen, dass die RNA für Sonden zugänglich war. In ähnlicher Weise können Sonden für Haushaltsgene auch als Kontrollen dienen, um Zugang zur RNA zu erhalten. Positive Kontrollen mit Zielen, die bekannte Expressionsmuster aufweisen, helfen bei der Bestätigung der Spezifität, und Negativkontrollen helfen bei der Bewertung potenzieller unspezifischer Bindungen.

Da mehrere Techniken entwickelt werden, um das räumliche Genexpressionsprofil von Geweben besser zu verstehen, sind insgesamt mehr Methoden erforderlich, um die Ergebnisse zu validieren. Insbesondere Assays wie Einzelzell-RNA-Seq entwickeln sich zu beliebten Werkzeugen zur Bewertung der Genexpression, aber ihre Ergebnisse müssen räumlich mit einer höheren Auflösung untersucht werden. Um dies zu unterstützen, können ISH-Assays verwendet werden, um den räumlichen Kontext der transkriptomischen Daten, die von quantitativeren Assays erzeugt werden, besser zu verstehen und zu validieren. In der Sehne wird die Paarung solcher Assays dazu beitragen, die Zellen, die sich in der Enthese, dem Sehnenmittelkörper und der myotendinösen Verbindung befinden, weiter zu charakterisieren, indem Marker räumlich validiert werden, die für einzigartige Zellpopulationen spezifisch sind.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Jenna Galloway und den Mitgliedern des Galloway Lab für ihre Unterstützung und Ermutigung bei der Entwicklung und Fehlerbehebung dieser Protokolle.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 M Triethanolamin-Puffer
10% Formalinlösung
10% Tween-20
20x Kochsalzlösung Natriumcitrat Puffer
4% PFA
ACD RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Fluoreszenz-Reagenzkit V2ACD323100
Essigsäure Anhydrid
Axio Imager MikroskopZEISS
C57BL/J6 Mäuse JAX-ID: 000664
DeckgläserFisher 12-541-042
ddH2O
ETDAThermofisherAM9262
EtOH
GlukoseVWR Chemicals BDHBDH9230-500G
HCR RNA-FISH BundleMolecular Instruments Inc.
HybEZ II HybridisierungssystemACD
Immedge Barrier PenVector LaboratoriesH4000
Leica SPE Konfokales MikroskopLeica
ParafilmFisher
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 1x)InvitrogenAM962510x PBS in Milli-Q-Wasser verdünnen, um 1x Lösung zu erhalten
Protease IV
Proteinase KRoche3115836001
RNAscope H2O2 und Protease-ReagenzienACDPN 322381im ACD RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Fluoreszenz-Reagenzien-Kit enthalten V3
RNAscope Multiplex-Fluoreszenz-DetektionskitACDPN 323110Enthalten im ACD RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Fluoreszenz-Reagenzien-Kit V2
RNAscope Target Retrieval-ReagenzienACD322000Enthalten im ACD RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Fluoreszenz-Reagenzkit V4
RNAscope Wash BufferACDPN 310091Enthalten im ACD RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Fluoreszenz-Reagenzien-Kit V5
RNAscope  Sonde VerdünnungsmittelACD300041
ObjektträgerhalterStatLab4465A
Färbeschale mit DeckelStatLabLWS20WH
Superfrost Plus ObjektträgerFisher1255015behandelte, geladene Objektträger
Tris-HCl
XylolSigma-Aldrich534056-4L

Referenzen

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