Zwei-Photonen-Mikroskopie für die Untersuchung von Sehnen

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird der Prozess der Vorbereitung, Einrichtung und Bildgebung von Sehnen mithilfe der Multiphotonenmikroskopie beschrieben. Darüber hinaus wird die Anwendung von SHG zur Analyse der Kollagenfibrillenausrichtung und die Erstellung einer 3D-Darstellung von Sehnen behandelt. Diese Methodik erweist sich als sehr wertvoll für die Charakterisierung von Sehnenzellen und ihrer EZM während der Verletzung und Entwicklung.

Zusammenfassung

Die Zwei-Photonen-Mikroskopie hat sich als leistungsfähiges Werkzeug für die Bewertung tiefer Gewebezellen und die Charakterisierung der Ausrichtung der extrazellulären Matrix (EZM) in verschiedenen biologischen Systemen erwiesen. Diese Technik stützt sich auf nichtlineare Licht-Materie-Wechselwirkungen, um zwei unterschiedliche Signale zu detektieren: das zweite harmonisch erzeugte (SHG) Diffusionssignal, das die Visualisierung von Kollagenfasern und ihrer Ausrichtung erleichtert, und das Nahinfrarot-Anregungssignal zur Abbildung der ultraviolett angeregten Autofluoreszenz.

Die SHG-Bildgebung erweist sich aufgrund der nicht-zentrosymmetrischen kristallinen Struktur von fibrillärem Kollagen I als besonders effektiv bei der Visualisierung von Kollagenfasern. Da es sich bei Sehnen um matrixreiches Gewebe mit einer begrenzten Anzahl von Zellen handelt, sind sie aufgrund ihres hohen Kollagengehalts ideale Kandidaten für die Analyse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Daher bietet die Zwei-Photonen-Mikroskopie ein wertvolles Mittel, um Kollagenanomalien in Sehnen zu analysieren und zu charakterisieren. Seine Anwendung erstreckt sich auf die Untersuchung der Sehnenentwicklung, von Verletzungen, Heilung und Alterung und ermöglicht die umfassende Charakterisierung von Sehnenzellen und ihrer Wechselwirkungen mit der EZM unter verschiedenen Bedingungen unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie-Werkzeugen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz der Zwei-Photonen-Mikroskopie in der Sehnenbiologie und stellt eine angepasste Methodik vor, um eine effektive Bildgebung und Charakterisierung von Sehnenzellen während der Entwicklung und nach Verletzungen zu erreichen. Die Methode ermöglicht die Verwendung dünner mikroskopischer Schnitte, um ein umfassendes Bild der EZM in Sehnen und den Zellen, die mit dieser Matrix interagieren, zu erstellen. Vor allem wird in dem Artikel eine Technik zur Erzeugung von 3D-Bildern mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in Tiermodellen vorgestellt.

Einleitung

Um richtig zu funktionieren und die Kraft vom Muskel auf den Knochen^{zu übertragen 1}, sind Sehnen auf die intermolekularen und intramolekularen Bindungen zwischen den Kollagenfasern angewiesen. Die komplizierte Selbstorganisation, Vernetzung und Ausrichtung der Kollagenfasern führt zur Etablierung einer hochorganisierten Matrix, die zur biomechanischen Festigkeit und Flexibilität des Sehnengewebes beiträgt ^2,3,4. Obwohl auch andere EZM-Proteine zur Stabilität des fibrillären Netzwerks in den Sehnen^{beitragen 5}, besteht die Trockenmasse der Sehne zu etwa 86 % aus Kollagen⁶, wobei Kollagen I bis zu 96 % des Gesamtkollagengehalts ausmacht ^7,8. Dies macht die Kollagenstruktur letztendlich zu einem wichtigen Ergebnis für die normale Gesundheit und Funktion der Sehnen.

Einige klinische Bildgebungsverfahren, die für Sehnen verwendet werden, sind MRT und/oder Ultraschall. Während die Ultraschalltechnologie Bilder der faszikulären Struktur der Sehne liefert und einen Teil der fibrillären Struktur im Gewebe sichtbar macht⁹, ist die Auflösung für die Quantifizierung nicht ideal. Die MRT hat eine bessere räumliche Auflösung als die Ultraschallbildgebung, ist aber immer noch begrenzt. Allerdings sind diese Verfahren auch in ihrer potentiellen Bildgebungstiefe durch ein Gewebe begrenzt. Auf der Mikroskala können Klein- und Weitwinkel-Lichtstreuung und konfokale Mikroskopie verwendet werden, um die Struktur der Kollagenfibrillen und mögliche Anomalien zu beurteilen.

Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die SHG-Mikroskopie (Second-Harmonic Generation) von anderen bildgebenden Verfahren dadurch, dass sie die äußere Hülle der Kollagenfibrillen erfassen kann. Kollagen-I-Fibrillen in Sehnen sind einachsig parallel durch die Sehnen-ECM organisiert und von Natur aus nicht-zentrosymmetrisch ^4,10. Diese Eigenschaften können für die Bildgebung mit einem Multiphotonenmikroskop genutzt werden, das klare Bilder erzeugen kann, die bis zu 2-3 Mal tiefer sind als die konfokale Bildgebung¹¹. Dies ermöglicht es uns auch, optische Abschnitte der Sehne in besserer Qualität zu erzeugen. Wenn Licht in die interessierende Probe projiziert wird, wird ein SHG-Signal erzeugt, und diese Lichtstreuung kann erfasst werden. In den Sehnen entsteht so ein Bild der Kollagenstruktur und -ausrichtung, das es uns ermöglicht, mögliche morphologische und pathologische Folgen von Tendinopathien, Verletzungen usw. zu bewerten.

Da Kollagen den größten Teil der Trockenmasse der Sehnen ausmacht und zur Sehnenfunktion beiträgt ^6,12, kann eine Störung der Kollagenstruktur die biomechanischen Eigenschaften der Sehnen beeinträchtigen. Die Analyse seiner Struktur kann uns also helfen, die Auswirkungen und die Schwere von Verletzungen besser zu verstehen und eine Metrik für die Heilungswirksamkeit zu erstellen. In diesem Artikel wird eine Methode vorgestellt, die Multiphotonen- und SHG-Mikroskopie verwendet, um zu analysieren, wie sich Entwicklung und Verletzungen auf die Struktur und Ausrichtung von Kollagen-I-Fibrillen auswirken, und um 3D-Bilder der Sehnen-ECM in Tiermodellen zu erstellen. Daher kann unsere Methode zur Abbildung von Sehnen Forschern helfen, Sehnenzellen und EZM während der Entwicklung oder nach Verletzungen zu charakterisieren.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Protokoll #2013N0000062) und den AAALAC-Richtlinien am Massachusetts General Hospital durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden BHLHE40 null-Knockout- oder heterozygote weibliche Mäuse im Alter von 30 Tagen in einem Scx-GFP-Hintergrund verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Gewebevorbereitung und -fixierung

1. Um das Gewebe vorzubereiten, werden die Mäuse in einer CO₂ -Kammer eingeschläfert (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen), gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.
2. Um die Menge an Fell zu reduzieren, die an der Gewebeprobe haften bleiben kann, besprühen Sie die Maus mit 70 % EtOH, bis das Fell gesättigt ist. Enthäuten Sie die Hintergliedmaßen und entfernen Sie dann mit einer Schere die beiden Hintergliedmaßen, indem Sie am Hüftgelenk schneiden.
3. Legen Sie die beiden Hintergliedmaßen in ein 20-ml-Szintillationsfläschchen und tauchen Sie sie in 4 % PFA, so dass das Fläschchen gefüllt ist. Stellen Sie die Durchstechflaschen über Nacht bei 4 °C unter Rühren auf.
4. Waschen Sie die Hintergliedmaßen in 1x PBS bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren für 10 min und wiederholen Sie dies insgesamt 3 Mal. Tauchen Sie die Hinterbeine in 0,5 M EDTA (pH 8,0) bei 4 °C unter Rühren für bis zu 2 Wochen und ersetzen Sie sie alle 2-3 Tage durch frisches EDTA.
5. Waschen Sie die Hintergliedmaßen in 1x PBS bei RT unter Rühren für 10 min, wiederholen Sie die Wäschen insgesamt 3 Mal.
6. Tauchen Sie die Gliedmaßen in frisches 1x PBS und lagern Sie sie bei 4 °C, bis sie für die Bildgebung verwendet werden.

2. Dissektion der Sehne und Vorbereitung des Gewebes für die Bildgebung

1. Während Sie den Fuß mit einer Pinzette festhalten, schieben Sie ein Ende der Federscherenklinge (siehe Materialtabelle) unter die Achillessehne und achten Sie darauf, so nah wie möglich an der myotendinösen Verbindung zu schneiden.
2. Halten Sie das abgetrennte myotendinöse Ende der Sehne mit einer Pinzette fest und schneiden Sie die Sehne mit der Federschere so nah wie möglich am Knochen heraus.
   HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf eine Pinzette, um die Achillessehne während des ersten Schnitts vom Rest der Hintergliedmaße fernzuhalten. Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu quetschen oder zu beschädigen, da dies die Kollagenausrichtung während der Bildgebung beeinträchtigt.
3. Um zu permeabilisieren und einen nuklearen Gegenfleck zu erhalten, tauchen Sie die präparierte Sehne in PBT (1 % Triton-X in PBS) mit 0,1 % Draq5 (Stammkonzentration, 5 mM, siehe Materialtabelle). Legen Sie die Sehne in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 1 μl Draq5 zu 1 ml PBT hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei RT auf einer Wippe. Da Draq5 lichtempfindlich ist, decken Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie ab und schützen Sie die Proben vor Licht.
4. Entfernen Sie vor der Bildgebung die Draq5-Lösung und ersetzen Sie sie durch dPBS. Stellen Sie sicher, dass die Probe weiterhin vor Licht geschützt ist.
   VORSICHT: Draq5 hat eine Toxizität der Kategorie drei und wird nach dem OSHA Hazard Communication Standard als gefährlich eingestuft. Vermeiden Sie den Kontakt und entsorgen Sie es in einem beschrifteten Abfallbehälter.
5. Schneiden Sie mit einem Biopsiestanzwerkzeug mit einem Innendurchmesser von 6 mm ein Stück Gelschaum aus (siehe Materialtabelle) und legen Sie es in eine kleine Petrischale von 60 x 15 mm. Geben Sie ddH₂O in die Schale, damit sich der Gelschaum ausdehnen kann.
6. Legen Sie die präparierte Achillessehne auf Gelschaum. Legen Sie mit einem Deckglas, das auf eine Unterlegscheibe geklebt ist, die Unterlegscheibe vorsichtig über die Sehne, bis das Deckglas das Gewebe berührt. Um Probleme bei der Bildgebung zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas befinden. Bei Bedarf mehr ddH₂O in die Schale geben, um die Probe und die Waschmaschine mit dem Deckglas abzudecken.

3. Bildgebung mit einem Multiphotonenmikroskop

1. Lokalisieren Sie mit einem Multiphotonen-Lasermikroskop FVMPE-RS, einem 25-fach-Objektiv, das in Wasser getaucht werden kann, einem gepulsten IR-Laser HPDS-O und einem gepulsten IR-Laser (siehe Materialtabelle) die Probe und den interessierenden Bereich, die mit dem EPI-Strahlengang abgebildet werden sollen. Sobald die Probe lokalisiert ist, richten Sie die Kamera entweder auf das myotendinöse oder auf das entheseale Ende der Achillessehne.
2. Schalten Sie den Strahlengang auf LSH um, stellen Sie die IR-Lasereinstellung von Laser 2 auf 840 nm ein und richten Sie ihn aktiv aus. Passen Sie die HV-Stärke an, um das Gewebe und das SHG-Signal sehen zu können, ohne 20 % zu überschreiten. Stellen Sie die Verstärkung nicht ein und halten Sie den Offset auf 0.
3. Konfigurieren Sie dann die Z-Stack-Parameter, um die Beispielbilder abzurufen. Verwenden Sie eine Scangröße von 1024 x 1024 und stellen Sie die Schrittweite auf 0,4 Mikrometer ein. Z-Stapel bestehen im Durchschnitt aus etwa 150 Schichten, und sie beginnen von der äußeren Hülle und bewegen sich in Richtung der Mitte der Sehne, bis das SHG-Signal nicht mehr klar ist, wodurch sagittale optische Abschnitte¹³ erzeugt werden.
4. Passen Sie die Laserleistung an den Bright Z-Modus an, um eine Standardisierung der Signalerkennung zu ermöglichen. Sobald die Start-/Stopp-Parameter des Z-Stapels festgelegt sind, stellen Sie die Laserintensität von 4 zu Beginn der Bildgebung und 6 zu Ende der Bildgebung ein. Dies trägt dazu bei, die Konsistenz der SHG-Signalübertragung aufrechtzuerhalten, wenn das Zielfernrohr tiefer in das Gewebe eindringt.
5. Nachdem die Z-Stapel erzeugt wurden, werden sie in ImageJ/FIJI weiter verarbeitet, um einen Film mit optischen Schnitten in der Querausrichtung zu erstellen. Öffnen Sie dazu die ImageJ/FIJI Software¹⁴ und klicken Sie auf Image > Stacks > Reslice. Dies ermöglicht uns eine transversale Ansicht der Achillessehne, die die Sternmorphologie der Tenozyten und ihre Ausrichtung in der Kollagenmatrix enthüllt.

Ergebnisse

Dieses Protokoll ist nützlich für die Charakterisierung von Sehnenzellen und ihrer extrazellulären Matrix (EZM) nach einer Verletzung, während der Entwicklung oder in einem mutierten Zustand. Bei sorgfältiger Dissektion und Aufbereitung der Probe können Z-Stack-Videos durch das Gewebe in sagittaler Ausrichtung erzeugt werden (Video 1 und Video 2). Durch die Verwendung von ImageJ/FIJI zur Verarbeitung und Neuschichtung der Bilder entsteht eine Queransicht der Achillessehne (Videos 3 und Video 4). Dies enthüllt die sternförmige Morphologie der Tenozyten und ermöglicht es uns, ihre einzigartige Architektur innerhalb der dichten Kollagenmatrix zu beobachten.

Durch den Einsatz der Multiphotonenmikroskopie und die Nutzung der nicht-zentrosymmetrischen kristallinen Eigenschaften von fibrillärem Kollagen I wurden hochauflösende optische Schnittbilder erstellt, die sowohl die Sehnenzellen als auch ihre Matrix erfassen. Diese optischen Abschnitte sind sowohl für die BHLHE40 +/-; Scx-GFP und BHLHE40 -/-; Scx-GFP-Mäuse (Abbildung 1A, B). Die Schnitte stammen aus dem ursprünglichen sagittalen Z-Stack, der durch 2-P-Imaging erstellt wurde, und aus dem mit ImageJ/FIJI erzeugten Re-Sliced Z-Stack. Darüber hinaus können wir diese bildgebende Methode auch verwenden, um mögliche Unterschiede in der Kollagenorganisation, der Zellmorphologie usw. zwischen den beiden Mäusen zu analysieren.

Abbildung 1: Optischer Schnitt von BHLHE40 +/-; Scx-GFP und BHLHE40 -/-; Scx-GFP Maussehne. Der Z-Stapel wurde mit einem Multiphotonenmikroskop erfasst. (A) Die vom Z-Stack erfassten optischen Abschnitte zeigen das SHG-Signal und die GFP+/Draq5+-Zellen in einem BHLHE40 +/-; Scx-GFP (P30, weiblich, 14,68 g) und (B) BHLHE40 -/-; Scx-GFP (P30, weiblich, 12,16 g). Sagittale Schnitte haben ein SHG-Signal, während Querschnitte dies nicht tun. Die Proben wurden mit Draq5 gegengefärbt. SHG fängt die Kollagenmatrix im Gewebe ein. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Z-Stack-Videos der sagittalen Ansicht von BHLHE40 +/-; Scx-GFP Maussehne. Der Z-Stapel wurde mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop erfasst. Das Video zeigt die sagittale Ansicht der Achillessehne. Die Proben wurden mit Draq5 gegengefärbt. SHG fängt die Kollagenmatrix im Gewebe ein. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Z-Stack-Videos der sagittalen Ansicht von BHLHE40 -/-; Scx-GFP Maus Achillessehne. Der Z-Stapel wurde mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop erfasst. Das Video zeigt die sagittale Ansicht der Achillessehne in einer BHLHE40 Null-KO-Maus. Die Proben wurden mit Draq5 gegengefärbt. SHG fängt die Kollagenmatrix im Gewebe ein. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 3: Z-Stack-Videos der Queransicht von BHLHE40 +/-; Scx-GFP Maussehne. Der Z-Stapel wurde mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop erfasst. Das Video zeigt die Queransicht der Achillessehne. Die Proben wurden mit Draq5 gegengefärbt. SHG fängt die Kollagenmatrix im Gewebe ein. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 4: Z-Stapel-Videos der Queransicht von BHLHE40 -/-; Scx-GFP Maus Achillessehne. Der Z-Stapel wurde mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop erfasst. Das Video zeigt die Queransicht der Achillessehne in einer BHLHE40 null KO-Maus. Die Proben wurden mit Draq5 gegengefärbt. SHG fängt die Kollagenmatrix im Gewebe ein. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

In diesem Artikel wird eine Methode zur Präparation, Präparierung und Abbildung der Achillessehne der Maus vorgestellt, wobei die nicht-zentrosymmetrischen kristallinen Eigenschaften der Sehnen-ECM genutzt werden. Zu den wichtigsten Schritten bei der Gewebevorbereitung gehören die Permeabilisierung für Gegenfärbungen und die Sicherstellung der korrekten Gewebeplatzierung in einer Petrischale während der Bildgebung. Anstelle von Draq5 kann Hoechst 33258 in einer Verdünnung von 1:100.000¹³ verwendet werden, aber Draq5 wird aufgrund seiner hohen Permeabilität, Photostabilität und minimalen Photobleichung bevorzugt. Die richtige Platzierung des Gewebes ist entscheidend, um Blasen zwischen dem Deckglas und der Sehne zu vermeiden, da eine falsche Ausrichtung die resultierenden Bilder beeinträchtigen kann.

Im Vergleich zu anderen Mikroskopiemethoden ermöglicht die Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation (SHG) die Erfassung von Kollagenfibrillen und Sehnenzellen innerhalb der Matrix¹⁰. In Kombination mit Gegenfärbungen ermöglichen diese Daten die Analyse, wie sich Entwicklung, Verletzungen oder Mutationen auf die Sehnenstruktur auswirken. Die Erstellung von 3D-Bildern der Sehnen-ECM ermöglicht die Beobachtung optischer Schnitte, während sie durch die Sehne verlaufen. Die Multiphotonentechnologie bietet zwar eine überlegene Gewebepenetration, hat aber immer noch Einschränkungen bei der Bildgebung durch die gesamte Achillessehne, was zusätzliche Techniken wie Schnitte erfordert. Diese Methode ermöglicht jedoch die Herstellung von etwa 150 optischen Schnitten mit einer Größe von 0,4 Mikrometern mit Klarheit, wodurch eine Gewebestörung durch das Schneiden vermieden wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode wertvolle Einblicke in die Charakterisierung der Sehnenentwicklung, Verletzungen, Heilung und Alterung bietet, indem Sehnenzellen und EZM mittels Multiphotonenmikroskopie abgebildet werden. Die Verwendung von Multiphotonen-Bildgebung für optische Schnitte und Z-Stack-Videos im gesamten Gewebe ermöglicht ein besseres Verständnis der Veränderungen der Sehnenmorphologie unter experimentellen Bedingungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 M EDTA pH 8,0	Invitrogen	AM9262
2 mL Mikrozentrifugenröhrchen	USA Scientific	1620-2700
20 mL Szintillationsfläschchen	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	50-980-487	Verwenden Sie PFA-Amduol, um eine 4%ige PFA-Lösung herzustellen
6 mm Biopsie-Stanzwerkzeug	Ted Pella Inc.	15111-60
			60 x 15 mm
BHLHE40 Null-Knockout- oder heterozygoten Mäusen auf einem Scx-GFP-Hintergrund	The Jackson Laboratory	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Deckgläser	Fisher	12-544-F	Kann jedes Deckglas verwenden, das den Bereich der M20-Unterlegscheibe überspannt
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Feine Schere 21 mm Schneide	Fine Science Tools	14060-10
FVMPE-RS Multiphotonenlaser Rastermikroskop	Olympus
Gelfoam Steriler Schwamm Größe 50	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL IR-gepulster Laser	Olympus
MaiTai HPDS-O IR-Impulslaser	Olympus
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x)	Invitrogen	AM9625	10x PBS in Milli-Q-Wasser verdünnen, um 1x Lösung zu erhalten
M20 Unterlegscheibe aus Edelstahl	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Verdünnen Sie Triton X-100 in dPBS, um eine 1%ige Lösung zu erhalten
Vannas Federschere 4 mm Schneide	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP Objektiv