Methodenartikel

Der Mikronukleus-Assay an kryokonserviertem Vollblut

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DOI:

10.3791/65855

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23. Februar 2024

 ,  ,  , 
1Radiobiology group, Department of Human Structure and Repair, Ghent University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll für den Zytokinese-Block-Mikronukleus-Assay an kryokonservierten Vollblutproben vor. Diese optimierte Methode der Kryokonservierung von Vollblut für die Mikronukleusanalyse ist eine zuverlässige Technik für groß angelegte Proben und multizentrische Studien und kann auch für andere blutbezogene Assays verwendet werden.

Zusammenfassung

Der In-vitro-Zytokinese-Block-Mikronukleus-Assay (CBMN) ist eine weit verbreitete Technik in der strahlenbiologischen Forschung, der biologischen Dosimetrie, Genotoxizitätsstudien und In-vitro-Strahlenempfindlichkeitstests. Diese zytogenetische Methode basiert auf dem Nachweis von Mikrokernen in zweikernigen Zellen, die aus Chromosomenfragmenten resultieren, die während der Zellteilung verzögert werden. Frische Vollblutproben sind der am meisten bevorzugte Probentyp für den CBMN-Assay. Zu den Nachteilen der Arbeit mit frischen Blutproben gehören jedoch die unmittelbare Verarbeitung nach der Blutentnahme und die begrenzte Anzahl von wiederholten Analysen, die ohne zusätzliche Blutentnahme durchgeführt werden können.

Da der Bedarf an frischen Blutproben eine logistische Herausforderung darstellen kann, wäre der CBMN-Assay an kryokonservierten Vollblutproben von großem Vorteil, insbesondere in groß angelegten Patientenstudien. In diesem Artikel wird ein Protokoll zum Einfrieren von Vollblutproben und zur Durchführung des CBMN-Assays an diesen gefrorenen Blutproben beschrieben. Blutproben von gesunden Probanden wurden zu verschiedenen Zeitpunkten eingefroren und aufgetaut und dann einem modifizierten Mikronukleus-Assay-Protokoll unterzogen. Die Ergebnisse zeigen, dass dieses optimierte Verfahren die Durchführung des CBMN-Assays an gefrorenen Blutproben ermöglicht. Das beschriebene Kryokonservierungsprotokoll kann auch für andere zytogenetische Assays und eine Vielzahl von funktionellen Assays, die proliferierende Lymphozyten erfordern, sehr nützlich sein.

Einleitung

Seit ihrer Entdeckung ist der Einsatz ionisierender Strahlung (IR) wegen ihrer schädlichen Auswirkungen auf Lebewesen umstritten. Die schädliche Wirkung äußert sich in der Regel durch DNA-Schäden wie Doppelstrangbrüche (DSBs), und das Versäumnis, diese DSBs zu reparieren, führt zu Chromosomenaberrationen und Mutationen, die wichtige Kennzeichen von Krebs sind 1,2. Solche Chromosomenaberrationen können durch zytogene Assays wie den Zytokinese-Block-Mikronukleus-Assay (CBMN) untersucht werden. Mikrokerne sind verzögerte Chromosomenfragmente, die nicht in Tochterkerne eingebaut werden können und daher während der Mitose zurückbleiben.

CBMN ist eine häufig verwendete, zuverlässige zytogenetische Technik zur Beurteilung von Chromosomenschäden bei Personen, die in vivo oder in vitro ionisierender Strahlung ausgesetzt sind. Im CBMN-Assay können entweder frisches Vollblut oder isolierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) verwendet werden. Frisches Vollblut ist meist das biologische Material der Wahl, da die Isolierung und Verarbeitung von PBMCs zeitaufwändig sein kann und mit einem Verlust von Serumplasma einhergeht, das als Stützmedium für das Überleben und Wachstum der Zellen fungiert. Um eine gute zweikernige Zellausbeute zu erzielen, sollte frisches Vollblut unmittelbar nach der Entnahme verarbeitet werden. Die Notwendigkeit einer sofortigen Bearbeitung kann jedoch unter Zeitdruck eine logistische Herausforderung darstellen. Wenn viele Proben über einen längeren Zeitraum entnommen oder an Orten außerhalb der Verarbeitungszentren entnommen werden sollen, kann die Lagerung frischer Blutproben ein limitierender Faktor sein 3,4.

Um eine wiederholte MN-Analyse bei derselben Person/demselben Patienten zu ermöglichen, wäre das Einfrieren von Blutproben von Vorteil. Eine Möglichkeit, Lymphozyten für die spätere Anwendung des CBMN-Assays zu lagern, ist das Einfrieren isolierter PBMCs 5,6. Diese Technik erfordert jedoch mehrere Verarbeitungsschritte, bevor die PBMCs eingefroren werden können. Daher würde die Kryokonservierung von Vollblut eine einfache und zeiteffiziente Alternative zur Kryokonservierung von isolierten PBMCs darstellen. Es liegen nur wenige Informationen über die Verwendung von gefrorenem Vollblut für zytogenetische Assays oder Assays, die die Proliferation von Lymphozyten erfordern, vor. Nur eine Studie berichtet über die Verwendung von kryokonserviertem Vollblut für die Metaphasenanalyse7.

Da die Kryokonservierung von Vollblut viele Vorteile im Bereich des Biomonitorings, der Biodosimetrie und der Strahlenempfindlichkeitsbewertung bieten würde, hat unsere Gruppe ein Kryokonservierungsprotokoll für Vollblut optimiert, das die Anwendung des CBMN-Assays8 ermöglicht. Wir konnten zeigen, dass Lymphozyten, die in kryokonservierten Vollblutkulturen vorhanden sind, ihre genomische Integrität und Proliferationskapazität für mindestens 1 Jahr behalten. In diesem Methodenpapier beschreiben wir detailliert das Kryokonservierungsverfahren und das CBMN-Assay-Protokoll, das von Beyls et al.8 optimiert wurde, und berichten über Ergebnisse, die für gefrorene Blutproben von 30 gesunden Personen erzielt wurden. Für den CBMN-Assay wurden die Blutkulturen in vitro mit Dosen von 0,5, 1 und 2 Gy bestrahlt, um die MN-Reaktion in Lymphozyten von kryokonservierten Vollblutproben zu beurteilen.

Protokoll

Für diese Studie wurden Blutproben von 30 gesunden Spendern im Alter zwischen 17 und 65 Jahren durch Venenpunktion entnommen. MN-Daten von 20 Spendern wurden aus der Arbeit von Beyls et al. wiederverwendet.8 Die Entnahme der Blutproben erfolgt in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Ethikkommission des Universitätskrankenhauses Gent (Registrierungsnummer: 2019/1565), Belgien. Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Entnahme von Blutproben

  1. Stellen Sie vor Beginn sicher, dass eine schriftliche Einverständniserklärung der Teilnehmer vorliegt und die ethischen Richtlinien ordnungsgemäß befolgt werden.
  2. Sammeln Sie Blut in Li-Heparin-Röhrchen und lagern Sie es bei Raumtemperatur, bis es für die Verarbeitung zur Kryokonservierung bereit ist.

2. Kryokonservierung von Vollblut

HINWEIS: Alle Schritte bis zur Zellernte werden aseptisch im sterilen laminaren Luftstrom durchgeführt.

  1. Um 1 ml Blut kryokonserviert zu bekommen, stellen Sie 1 ml Gefriermedium her, indem Sie 800 μl fötales Kälberserum (FCS) und 200 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) mischen.
    HINWEIS: Das Gefriermedium wird in einem Volumen hergestellt, das den Blutproben entspricht, die eingefroren werden müssen.
  2. Für die Kryokonservierung von Vollblut wird die Blutprobe aus dem heparinisierten Röhrchen in 15- oder 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt
    HINWEIS: Das Fassungsvermögen des Röhrchens hängt vom Volumen des Blutes ab.
  3. Das Blut mit niedriger Geschwindigkeit vorwirbeln, wobei kontinuierlich, aber tropfenweise ein gleiches Volumen des Gefriermediums zugegeben wird.
  4. 2 ml Blutgefriermischung in Kryoröhrchen (2 ml) überführen, wobei jedes Aliquot 1 ml Blutprobe mit 1 ml Gefriermischung vermischt hat.
  5. Schrittweise schrittweises Einfrieren
    1. Kryoröhrchen in eine Kryobox mit Isopropanol umfüllen und über Nacht in einen Gefrierschrank (-80 °C) stellen.
    2. Füllen Sie die Kryoröhrchen für den Langzeitgebrauch in flüssigen Stickstoff um.

3. Auftauen von kryokonserviertem Blut

HINWEIS: Um die Gesamtzeit des Auftauvorgangs zu begrenzen, sollten maximal 8 Kryoröhrchen (je 2 ml) gleichzeitig gehandhabt werden.

  1. Präparat
    1. 200 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 37 °C vorwärmen, bevor das Blut aufgetaut wird.
    2. Bereiten Sie eine Arbeitslösung des benötigten Nährmediums unter sterilen Bedingungen vor. Stellen Sie sicher, dass das Medium pro Kultur 1,6 ml des vollständigen Mediums enthält: Medien des Rosewell Park Memorial Institute (RPMI), ergänzt mit Penicillin/Streptomycin (0,5 %), 0,2 ml FCS, 20 μl Natriumpyruvat und 2 μl β-Mercaptoethanol.
      HINWEIS: Da beim Auftauen eine beträchtliche Anzahl von Blutzellen verloren gehen kann, wird das aufgetaute Blut in kleinen Vertiefungen wie 24-Well-Platten mit einem Gesamtvolumen von 2 ml kultiviert. Es wird eine Multi-Well-Platte pro Dosis verwendet.
    3. Geben Sie für jede Kulturvertiefung den Spendercode und A/B auf dem Deckel zusammen mit dem Datum und der Dosis an, wie unten vorgeschlagen (Abbildung 1).

figure-protocol-1
Abbildung 1: Vorgeschlagenes Layout einer 24-Well-Platte zur Kultivierung von Vollblut für den Mikronukleus-Assay. Markieren Sie die Vertiefungen und geben Sie die Spendercodes an den entsprechenden Stellen auf dem Deckel an. Für jede Patientenprobe sollten doppelte Wells nebeneinander liegen. Beachten Sie, dass es sich um ein suggestives Layout für einen 10 x 10-Kollimator handelt, das je nach Größe des Kollimators oder der Proben geändert werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Schritte zum Auftauen und zur Kultivierung von Vollblut
    1. Das Wasserbad auf 37 °C erwärmen.
    2. Entnehmen Sie die benötigten Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff (die Anzahl hängt von den Anforderungen ab, wie z. B. der Anzahl der Dosen).
      HINWEIS: Ein Kryoröhrchen enthält 1 ml Blut und 1 ml Gefriermedium. Daher können zwei Kulturen mit Blut aus einem Kryoröhrchen eingerichtet werden.
    3. Die Kryoröhrchen im warmen Wasserbad teilweise auftauen (bis noch kleine Eiskristalle zu sehen sind).
    4. Nehmen Sie die Fläschchen aus dem Wasserbad und reinigen Sie die Außenseite der Fläschchen mit sterilem Seidenpapier.
    5. Öffnen Sie die Durchstechflaschen in einer sterilen Laminar-Airflow-Haube sehr langsam, um zu verhindern, dass Luftblasen, die sich in den Röhrchen gebildet haben, heraustreten.
    6. Resuspendieren Sie den Inhalt jeder Durchstechflasche und geben Sie ihn einzeln in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen (1 Röhrchen pro Durchstechflasche).
    7. In die jeweiligen Röhrchen tropfenweise 1 ml warmes (37 °C) PBS geben, während das Röhrchen vorsichtig geschwenkt wird. Resuspendieren Sie mit einer P1000-Pipette.
    8. Zur Verdünnung und gleichmäßigen Wäsche tropfenweise 7 ml vorgewärmtes PBS (37 °C) zugeben und mit einer P1000-Pipette resuspendieren.
    9. Das Blut wird 8 min bei 180 × g (mit Einstellung auf Beschleunigung 1, Bremse 1) bei Raumtemperatur zentrifugiert.
    10. Während dieses Warteschritts füllen Sie die leeren Vertiefungen (mit Ausnahme derjenigen, in der die Zellen kultiviert werden) mit 500 μl PBS.
    11. Legen Sie die Well-Platten zum Vorwärmen zurück in den Inkubator.
    12. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und lassen Sie ca. 1 ml zurück, um das Zellpellet nicht zu stören.
    13. Resuspendieren Sie das Pellet mit einer P1000-Pipette im verbleibenden Überstand.
    14. Tropfenweise 8 ml warmes PBS (37 °C) in die jeweiligen Röhrchen geben und dabei die Röhrchen vorsichtig schwenken. Anschließend mit einer P1000-Pipette resuspendieren.
    15. Das resuspendierte Blut wird 8 min bei 180 × g zentrifugiert (mit Einstellung auf Beschleunigung 9, Bremse 9).
    16. Während dieses Warteschritts werden 200 μl Nährmedium in jede der markierten Vertiefungen überführt.
    17. Bewahren Sie die Platten wieder im Inkubator auf, damit sie bei 37 °C bleiben.
    18. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in einer kontinuierlichen Bewegung entfernt (um eine Störung des losen Zellpellets zu vermeiden), aber ca. 80 μl des Überstandes zurückgelassen.
    19. Dem Pellet 280 μl FCS (Raumtemperatur) hinzufügen und resuspendieren (auf ein Gesamtvolumen von 360 μl).
    20. 180 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung überführen und resuspendieren (= 0,5 ml "Blut"/Kultur). Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung beträgt nun 380 μl, was zu einer 2 mm dicken Mittelschicht führt.
    21. Die Platten werden vor der Bestrahlung mindestens 10 min in einemCO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert.

4. G0 MN-Assay

  1. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und bestrahlen Sie die Zellkultur mit den erforderlichen Dosen wie 0,5, 1 und 2 Gy Röntgenstrahlen (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) bei Raumtemperatur. Verwenden Sie scheinbestrahlte Proben als Kontrollen, um spontane MN-Ausbeuten zu identifizieren.
  2. Unmittelbar nach der Bestrahlung werden 1,62 ml Nährmedium (37 °C) in jede Vertiefung gegeben.
  3. Um die Zellteilung in T-Lymphozyten zu stimulieren, fügen Sie 40 μl Phytohämagglutinin (PHA) in jede Vertiefung hinzu und resuspendieren Sie gründlich.
  4. Stellen Sie diese Platten wieder in den Inkubator (5% CO2, 37 °C).
    HINWEIS: Dies ist die Startzeit des Assays.
  5. Blockieren Sie die Zytokinese 23 Stunden nach der Stimulation, indem Sie 8 μl Cytochalasin B (6 μg/ml) pro Vertiefung hinzufügen und ordnungsgemäß resuspendieren.
  6. Entnehmen Sie die Zellkulturen 70 Stunden nach der Stimulation/Kulturzeit. Resuspendieren Sie die Zellen und überführen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Spülen Sie jede Vertiefung mit 2 ml PBS aus und geben Sie dieses PBS in das entsprechende 15-ml-Röhrchen.
  7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 8 Minuten lang bei 180 × g bei Raumtemperatur.
  8. Den Überstand verwerfen, aber ca. 500 μl über dem Pellet lassen.
  9. Das Pellet bei voller Geschwindigkeit vortexen und während des Vortexens langsam 2 ml kaltes Kaliumchlorid (KCl, 4 °C) tropfenweise hinzufügen.
  10. Die Zellen werden sofort bei 180 × g für 8 min zentrifugiert.
  11. Verwerfen Sie den Überstand, wobei ca. 500 μl des Überstandes übrig bleiben.
  12. Das Pellet (bei voller Geschwindigkeit) vortexen und während des Vortexens langsam 2 ml kaltes Fixiermittel 1 (Methanol/Essigsäure/Ringerlösung in einem Verhältnis von 4:1:5) tropfenweise hinzufügen.
  13. Lassen Sie die Probenröhrchen über Nacht bei 4 °C (mindestens 12 h und maximal 96 h) stehen.
  14. 8 min bei 180 × g zentrifugieren.
  15. Verwerfen Sie den Überstand.
  16. Das Pellet (bei voller Geschwindigkeit) vortexen und während des Vortexens langsam 2 ml kaltes Fixiermittel 2 (Methanol/Essigsäure im Verhältnis 4:1) tropfenweise hinzufügen.
  17. 8 min bei 180 × g zentrifugieren.
  18. Verwerfen Sie den Überstand.
  19. Das Pellet (bei voller Geschwindigkeit) vortexen und dann langsam (tropfenweise) während des Vortexens 2 ml kaltes Fixiermittel 2 in das Pellet geben.
  20. Lassen Sie die Probenröhrchen bei 4 °C (mindestens 12 h und maximal 96 h).
  21. Reinigen Sie die Objektträger mit Isopropanol und beschriften Sie sie ordnungsgemäß.
    HINWEIS: Verwenden Sie gedruckte Aufkleber zum Beschriften, da sich die Markertinte während der Verarbeitung leicht abwischen lässt.
  22. Die Probenröhrchen werden 8 min bei 180 × g zentrifugiert.
  23. Füllen Sie den Überstand in ein anderes Röhrchen, um die Zellen entsprechend der Größe des Pellets zu konzentrieren.
  24. Wirbeln Sie das Pellet vor.
  25. Tropfen Sie 40 μl der fixierten Zellen auf einen trockenen und sauberen Objektträger.
  26. Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur trocknen. Bewahren Sie die Objektträger sofort zur Beobachtung in einer Schachtel oder einem Fleck auf.

5. Färbung von Acridinorange (AO)

  1. Tauchen Sie die Objektträger 1 Minute lang in AO-Färbung, gefolgt von einer kurzen Wäsche im destillierten Wasser und legen Sie die Objektträger dann für 1 Minute in Phosphatpuffer (pH 6,8).
  2. Nehmen Sie die Objektträger aus der Pufferlösung und mit sauberem Seidenpapier heraus, trocknen Sie die Rückseite der Objektträger ab und legen Sie die Objektträger auf ein sauberes Seidenpapier.
  3. Tropfen Sie 20 μl des Phosphatpuffers auf den Objektträger und decken Sie ihn vorsichtig mit einem sauberen Deckglas ab, um Luftblasen zu vermeiden.
  4. Versiegeln Sie diese Objektträger mit Silikonzement.
    HINWEIS: Da AO lichtempfindlich ist und mit der Zeit verblasst, wird für einen schönen Kontrast und Fluoreszenz empfohlen, die Objektträger innerhalb von 5 Tagen nach der Färbung zu ritzen. Objektträger immer in einem kühlen Raum (4 °C) lagern, wenn sie nicht untersucht werden.

6. Einritzen von gefärbten Objektträgern

  1. Legen Sie Ihren Objektträger unter ein Fluoreszenzmikroskop und untersuchen Sie 1.000 zweikernige Zellen (BNs). Zählen Sie MNs manuell, die einer der sechs Biomarker für Toxizität sind. Lassen Sie dazu zwei unabhängige Scorer 500 BN-Zellen/Objektträger unter der gleichen Vergrößerung untersuchen.
    HINWEIS: Im Folgenden finden Sie einige Highlights der Bewertungskriterien, die von Fenech empfohlen wurden, um die gefärbten Objektträgerzu bewerten 9
    1. Wählen Sie eine BN-Zelle aus, indem Sie nach schön abgerundeten Zellen mit intaktem Zytoplasma suchen, mit zwei gut unterschiedenen Kernen von ungefähr gleicher Größe, regelmäßiger Form und Färbung. Stellen Sie sicher, dass das Zytoplasma der BN-Zelle vom Zytoplasma der benachbarten Zelle unterscheidbar ist.
    2. Bewerten Sie ein MN und beachten Sie, dass es morphologisch identisch mit den Hauptkernen ist, aber kleiner als diese; selbst der größte MN kann nicht mehr als 1/3 des Durchmessers der Hauptkerne betragen. Ein MN wird nur dann gewertet, wenn es die Hauptkerne nicht berührt oder zumindest die mikronukleare Grenze von der Grenze der Hauptkerne unterscheidbar ist.

Ergebnisse

Um die Reproduzierbarkeit des Protokolls zu validieren, führten wir den MN-Assay an kryokonservierten Blutproben von 30 gesunden Probanden im Alter zwischen 17 und 65 Jahren durch. Das Durchschnittsalter der Gruppe liegt bei 35 Jahren. Die Kryokonservierungszeit reichte von 1 Woche bis 154 Wochen. Nachdem die gesamte Blutzellkultur verschiedenen Strahlendosen (0,5, 1 und 2 Gy) ausgesetzt wurde, wurde die Mikrokernausbeute in 1.000 BN-Zellen unter dem Mikroskop untersucht. Schön abgerundete zweikernige Zellen (wie in Abbildung 2 zu sehen) deuten auf eine erfolgreiche Entnahme gesunder, lebensfähiger Zellen aus kryokonservierten Vollblutproben hin. Bemerkenswert ist, dass die Strahlenantwort der Lymphozyten nach längerer Lagerung bei ultratiefen Temperaturen (flüssiger Stickstoff) stabil blieb. Diese Beobachtung stimmt mit der Reaktion überein, die von frischen Blutproben erwartet wird.

figure-results-1
Abbildung 2: Mikrokerne, wie sie in zweikernigen Zellen beobachtet wurden, die aus einer gefrorenen Vollblutprobe gewonnen wurden, die vor 1 Jahr kryokonserviert wurde. (A) Vergrößerung 200x, (B) Vergrößerung 400x; Pfeile, die auf die MNs zeigen. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bei erhöhten Strahlendosen (0,5, 1 und 2 Gy) wurde ein linear-quadratischer Anstieg der Mikrokernausbeute beobachtet (Tabelle 1 und Abbildung 3). Die MN-Ausbeuten in scheinbestrahlten Kontrollproben (0 Gy) stellen die Hintergrund-MN-Ausbeuten dar, die hauptsächlich das Ergebnis von verzögerten Chromosomen sind.

Dosis (Gy)00.512
Durchschnitt18107247601
SD10.823.953.3101.1
Lebenslauf (%)59.922.321.616.8
Bereich5-4162-140139-324395-755

Tabelle 1: Bereich und Variationskoeffizient zusammen mit der durchschnittlichen MN-Ausbeute, wie sie in kryokonservierten Vollblutproben von 30 gesunden Spendern beobachtet wurden, was auf eine interindividuelle Variabilität hinweist. Abkürzungen: CV = Variationskoeffizient; SD = Standardabweichung.

figure-results-2
Abbildung 3: Mikrokernausbeute, beobachtet in Kontroll- und bestrahlten kryokonservierten Vollblutproben von 30 Spendern. Die Kryokonservierungszeiträume reichten von 1 Woche bis 154 Wochen. Das Streudiagramm zeigt einzelne Werte. Linien in Clustern stellen den Mittelwert ± SD der Gruppe dar. Abkürzungen: MN = Mikrokerne; BN = zweikernig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um die interindividuelle Variation der MN-Ausbeute von Personen zu untersuchen, wurde der Variationskoeffizient (CV) berechnet (siehe Tabelle 1). Für strahleninduzierte MN wurde für alle Dosen (0,5, 1 und 2 Gy) eine CV < 25% erhalten, was auf eine gute Reproduzierbarkeit des modifizierten Protokolls hinweist.

Diskussion

Das modifizierte Protokoll für die Anwendung des CBMN-Assays ist eine relativ einfache und bequeme Möglichkeit, Blutproben in großen Mengen zu lagern. Das Verfahren beschreibt alle winzigen, aber wichtigen Details, die während der Kryokonservierung und des CBMN-Assays beachtet werden müssen. Andere Laborprotokolle verwenden normalerweise 10 % DMSO in der Gefriermischung, während unsere Gefriermischung 20 % DMSO zusammen mit 80 % FCS7 enthält. Da diese Gefriermischung in gleichen Mengen der Vollblutprobe zugesetzt wird, beträgt die Endkonzentration ebenfalls 10% DMSO. Um die Überlebensrate der Zellen zu verbessern und die Zellteilung anzuregen, fügen wir dem vollständigen Kulturmedium (cRPMI) 1 % Natriumpyruvat und 0,1 % Beta-Mercaptoethanol hinzu. Dies entspricht dem Zellkulturprotokoll, das von unserer Forschungsgruppe 6,8 erstellt wurde.

Obwohl das Problem der Zellverklumpung während des Auftauens in diesem Protokoll nicht vollständig gelöst werden konnte, war die Zelltrennung besser als bei den anderen herkömmlichen Protokollen. Anstelle einer konsistenten, abrupten Zugabe von Nährmedien zur Rückgewinnung der Zellen nach dem Auftauen erzielten wir bessere Ergebnisse, wenn während der Waschschritte vorgewärmtes PBS (37 °C) tropfenweise zugegeben wurde. Diese Verbesserung hilft bei der Reduzierung des zellulären Stresses und minimiert die Verklumpung mit einer nachweislich hohen Erholung der Zellen. Darüber hinaus konnte kein deutlicher Unterschied in der Zellviabilität beobachtet werden, wenn PBS gegenüber RPMI verwendet wurde. Es wurde von der Gruppe validiert, dass die Länge der Kryokonservierungsperiode (bis zu 1 Jahr) keinen Einfluss auf die MN-Ausbeute hat, sowohl in bestrahlten als auch in nicht bestrahlten Proben 6,8. Studien deuten darauf hin, dass eine gute Zelllebensfähigkeit und Proliferation von PBMCs durch allmähliches Einfrieren bei niedrigen Temperaturen (flüssiger Stickstoff) erreicht werden kann, gefolgt von einer allmählichen Zugabe von vorgewärmtem Medium während des Auftauens10,11. Forscher haben gezeigt, dass die Subpopulationen von T-Lymphozyten in aufgetautem Vollblut mit denen in aufgetauten PBMCs vergleichbar sind12. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass Zellsubtypen, die aus kryokonservierten Vollblutproben gewonnen wurden, denen ähneln, die in frischen Vollblutproben beobachtet wurden13,14.

Wenn wir die indikativen Ergebnisse des Berichts untersuchen, sehen wir, dass der lineare quadratische Anstieg mit der Dosis (Abbildung 3) mit anderen Literaturberichten über lineare Energieübertragung (LET)-induzierte Mikrokerne übereinstimmt15,16. Die Variabilität der MN-Ausbeute, die in den kryokonservierten Vollblutproben beobachtet wurde (Tabelle 1), liegt im Bereich derjenigen, die für frische Vollblutkulturen berichtet wurde 8,17,18. Das hier ausführlich beschriebene Protokoll wurde an frischem und kryokonserviertem Vollblut von 20 gesunden Probanden validiert8. Der Kernteilungsindex (NDI), der ein wichtiger Parameter für die Zellproliferation ist, der in diesem Bericht8 beobachtet wurde, stimmte mit dem für frisches Vollblut vorgeschlagenen Index überein19,20. Zusammengenommen bietet dieses optimierte Protokoll der Kryokonservierung von Vollblut und des modifizierten Mikronukleus-Assays eine bessere Zellausbeute, weshalb eine Anpassung dieses Protokolls für Strahlenempfindlichkeitsbewertungen empfohlen wird. Da die Reproduzierbarkeit des Protokolls bereits validiert wurde8, wird eine Anwendbarkeit in groß angelegten und multizentrischen Studien vorgeschlagen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Danksagungen

Die Autoren danken L. Pieters, T. Thiron und G. De Smet für ihre technische Unterstützung. Wir danken allen Freiwilligen, die für die Studie Blut gespendet haben. Die Arbeit wurde von der Forschungsstiftung Flandern (FWO) im Rahmen von Grant (T000118N) finanziell unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL ZentrifugenröhrchenGreiner188271
24-Well-Zellsuspensionsplatte VWR734-2779
96% AlkoholChemLabCL00.1807.2500
EssigsäureMerck life science8,18,75,52,500
Acridin orangeMerck life science235474-5g
CaCl2Merck life scienceC5670-100g
DeckgläserVWR631-136522 x 50
Kryobox (Mr.Frosty)Nalgene, Sigma Aldrich
Kryoröhrchen 2mlNovolabA04573
Cytochalsin B Merck life scienceC6762-1010 mg
Dimethylsulfoxid (DMSO)Merck life scienceD4540-500ml
Fötales Kälberserum (FCS)Thermo Fischer scientific10270-106
Fixiermittel 1Methanol/Essigsäure/Ringer im Verhältnis 4:1:5
Fixiermittel 2Methanol/Essigsäure im Verhältnis 4:1
GURR PufferThermo Fischer scientific10582013Phosphatpuffer (pH 6,8)
KClMerck life science1,04,93,60,25075 mM
KH2PO4Merck life science1,04,87,30,250
Li-Heparin-RöhrchenBD Life Sciences367526-LH170 I.U.BD Vacutainer
Methanolfisher scinetificM/4000/17
Na2HPO2Merck life science10,65,80,500
NaClMerck life scienceS7653-1kg
ObjektträgerVWRMENZAA00000112E04
Penicillin/StreptomycinThermo Fischer scientific15140-12210.000 U/ml + 10.000 &Mikro; g/mL
Phytohämagglutinin (PHA-M)Thermo Fischer scientific10576-015
Ringer-Lösungenthält NaCl, KCl, CaCl2 gelöst in destilliertem Wasser
RPMI-1640Thermo Fischer scientific52400041
Silikonkautschuk Kleb- und DichtstoffCollallCF-100
NatriumpyruvatThermo Fischer wissenschaftliche11360039
Steril warm PBS (37 &Grad; C)enthält NaCl,  Na2HPO2, KH2PO4 gelöst in destilliertem Wasser
β-MercaptoethanolThermo Fischer scientific31350-010

Referenzen

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