Transienter mittlerer Hirnarterienverschluss Modell des Schlaganfalls

Der Schlaganfall ist eine verheerende Krankheit, von der nach Angaben der WHO jährlich etwa 15 Millionen Menschen weltweit betroffen sind. Etwa ein Drittel der Patienten erliegt der Erkrankung, ein weiteres Drittel erleidet eine dauerhafte Behinderung. Der Schlaganfall ist eine komplexe Pathologie, an der verschiedene Zelltypen beteiligt sind, wie z. B. neuronale und periphere Immunzellen, Gefäße und systemische Reaktionen¹. Das komplizierte Netzwerk von Reaktionen, die durch Schlaganfälle auf Systemebene ausgelöst werden, kann derzeit nicht mit In-vitro-Modellen repliziert werden. Daher sind experimentelle Tiermodelle unerlässlich, um die Mechanismen der Krankheit zu erforschen und neue Therapien zu entwickeln und zu testen. Derzeit ist die frühe Gewebereperfusion die einzige zugelassene Intervention, entweder durch Thrombolyse mit Gewebeplasminogenaktivator (tPA) oder endovaskuläre Thrombektomie¹.

Verschlüsse der mittleren Hirnarterie (MCA) sind bei Schlaganfallpatienten häufig. Folglich wurden zunächst Nagetiermodelle für transiente MCA-Okklusion (tMCAo) bei Ratten entwickelt ^2,3,4. Genetisch veränderte Mäuse sind heute die am häufigsten verwendeten Tiere in experimentellen Schlaganfallmodellen. In dieser Studie beschreiben wir ein minimal-invasives Modell des intraluminalen tMCAo in Mäusen. Der Zugang erfolgt über die Halsschlagader auf Höhe des Halses, ohne Kraniektomie.

Die Dauer der Okklusionsperiode ist ein kritischer Faktor, der das Ausmaß der ischämischen Läsion bestimmt. Selbst kurze Okklusionen von 10 Minuten können einen selektiven neuronalen Tod ohne offensichtlichen Infarkt verursachen, während längere Okklusionen, die typischerweise 30 bis 60 Minuten dauern, zu einem gewissen Grad an Hirninfarkt führen. Im Gegensatz zu den proximalen und distalen Ästen des MCA, die den Kortex versorgen und Kollateralen haben, fehlen den lentikulo-striatalen Arterien, die das Striatum mit Blut versorgen, Kollateralarterien⁵. In der Folge kommt es nach tMCAo zu einer stärkeren Verminderung des Blutflusses im Striatum als im Kortex. So betreffen Okklusionen von 30 Minuten oder weniger in der Regel das Striatum, aber nicht den Kortex, während längere Okklusionen ab 45 Minuten oft eine ischämische Läsion im gesamten MCA-Territorium, einschließlich des Striatums und des dorsolateralen Kortex, hervorrufen.

Um das Wohlbefinden der Mäuse zu gewährleisten, verabreichen wir vor dem Eingriff Analgetika und verwenden während der Operation eine Narkose. Nichtsdestotrotz kann die Anästhesie möglicherweise künstliche Veränderungen in der Physiologie der Maus bewirken und einige Ergebnismaße beeinflussen⁶. Der chirurgische Eingriff, wenn er von erfahrenem Personal durchgeführt wird, dauert in der Regel etwa 15 Minuten, um MCAo zu induzieren. Anschließend hängt die Gesamtdauer unter Narkose von der Okklusionszeit ab. Bei Experimenten, bei denen die Minimierung der Anästhesie von entscheidender Bedeutung ist, besteht ein alternativer Schritt des Verfahrens darin, die Anästhesie während der Okklusionsperiode abzubrechen und sie nur auf die chirurgischen Schritte zum Einführen und Herausziehen des Filaments zu beschränken, das den MCA verschließt. Dieser Ansatz verkürzt die Dauer der Anästhesie und minimiert ihre potenziellen artifaktischen Auswirkungen auf das experimentelle Modell ^7,8. Daher wird die Methode zur Induktion einer transienten fokalen Ischämie durch intraluminalen Verschluss des MCA mit zwei Varianten vorgestellt: mit der Maus während der gesamten Okklusionsperiode anästhesiert oder mit der Maus wach während dieser Periode. In beiden Fällen sollte parallel zu dem Eingriff an den ischämischen Mäusen eine Scheinoperation durchgeführt werden. Darüber hinaus werden Daten zur Ergebnisbewertung bereitgestellt, die durch Verhaltenstests und MRT zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Reperfusion gemessen werden. Abschließend werden die wichtigsten Faktoren diskutiert, die bei der Durchführung des experimentellen Verfahrens zu berücksichtigen sind.

Die Tierarbeit wurde nach den katalanischen und spanischen Gesetzen (Real Decreto 53/2013) und den europäischen Richtlinien durchgeführt, mit Zustimmung des Ethikkomitees (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) der Universität Barcelona und der lokalen Aufsichtsbehörden der Generalitat de Catalunya. Die Studien werden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien berichtet. Dieses Verfahren ist so konzipiert, dass es bei erwachsenen Mäusen ab einem Alter von 8 Wochen ohne Altersbeschränkung durchgeführt werden kann. Beispiele für das chirurgische Verfahren, das an C57BL/6-Mäusen im Alter von 10-12 Wochen entwickelt wurde, finden Sie hier. Anatomische Unterschiede je nach Mausstamm sollten berücksichtigt werden.

1. Zubereitung von Tieren

1. Bevor Sie mit dem chirurgischen Eingriff beginnen, sammeln und sterilisieren Sie alle erforderlichen Materialien und Werkzeuge. Richten Sie den OP-Tisch mit allen notwendigen chirurgischen Materialien ein (siehe Materialtabelle).
2. Betäubung des Tieres durch Isofluran-Inhalation in einem Gemisch aus Sauerstoff und Distickstoffmonoxid (30%/70%).
3. Verabreichen Sie Buprenorphin (siehe Materialtabelle) subkutan in einer Dosierung von 0,05 mg/kg Körpergewicht, um eine Analgesie zu gewährleisten und Schmerzen und Beschwerden zu lindern.
   HINWEIS: Analgesie ist obligatorisch, aber es werden unterschiedliche Protokolle akzeptiert. Auch Schmerz- und Unbehagenzeichen müssen in den ersten Tagen nach MCAo kontrolliert werden (siehe Schritt 4). Tragen Sie bei Bedarf Korrekturlösungen auf.
4. Legen Sie das Tier in eine Anästhesie-Induktionsbox (siehe Materialtabelle) mit 5% Isofluran, bis es einen Zustand tiefer Narkose erreicht hat (Verlust des Reflexes bei der Pfotenpunktion und des Augenreflexes).
5. Positionieren Sie die Maus auf dem Operationstisch und senken Sie den Isofluranspiegel auf 1,5 %, der von der Gesichtsmaske abgegeben wird. Tragen Sie Tierarztsalbe auf, um Augentrockenheit während des Eingriffs zu vermeiden.
6. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37 ± 0,5 °C, kontrolliert durch eine Rektalsonde, die an ein Heizkissen angeschlossen ist (siehe Materialtabelle).
7. Rasieren Sie den ventralen Teil des Halses und des Kopfes (Calvaria) mit einem elektrischen Rasierer. Fellreste vorsichtig entfernen und die Hautpartien dreimal in kreisenden Bewegungen mit Desinfektionsmittel auf Jodbasis und 70%igem Alkohol desinfizieren.
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2. Beurteilung des zerebralen Blutflusses (CBF) mit Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF)

1. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt auf der Haut des Kopfes in Richtung der sagittalen Naht, von den Ohren bis zum Bereich zwischen den Augen.
2. Ziehen Sie die Haut zurück und entfernen Sie die Knochenhaut auf der rechten Seite des Schädels.
3. Ermitteln Sie die Koordinaten (2,5 mm seitlich von Bregma) und befestigen Sie den Dopplerhalter (siehe Materialtabelle) mit Cyanacrylat. Nachdem der Kleber getrocknet ist, schließen Sie die Dopplersonde an und überprüfen Sie, ob das Signal korrekt ausgelesen wurde.

3. Vorübergehender Verschluss der mittleren Hirnarterie (tMCAo)

1. Drehen Sie die Maus in Rückenlage und befestigen Sie sie mit medizinischem Klebeband auf dem Operationstisch.
2. Mache einen Schnitt in der Mittellinie am Hals. Ziehen Sie die Haut und die Speicheldrüsen mit Retraktoren (siehe Materialtabelle) seitlich zurück, um das Karotisgebiet freizulegen.
3. Identifizieren Sie die vaskuläre Anatomie der Arteria carotis communis (CCA), der ICA und der ECA sowie die verschiedenen Arterien, die von ihnen abgeleitet sind (Oberkiefer und Lingualartrie, obere Schilddrüse, Okzipitalartumor und Pterygopalatin) (Abbildung 1A).
4. Lösen Sie die Hauptarterien vom angrenzenden Bindegewebe, damit sie behandelt werden können.
   HINWEIS: Achten Sie besonders darauf, die Nerven nicht zu schädigen, insbesondere nicht den Vagusnerv, der parallel zum CCA verläuft.
5. Wickeln Sie ein 6-0-Seidennaht (siehe Materialtabelle) um die ECA an der Gabelung zwischen Oberkiefer und Zungen. Befestigen Sie einen Knoten fest, um den Kreislauf dauerhaft zu unterbrechen.
6. Führen Sie eine zweite Naht um dieselbe Arterie zwischen dem ersten Knoten und der CCA-Bifurkation und halten Sie diesen Knoten locker.
7. Lege einen dritten Faden um den CCA und binde einen Schlupfknoten, der sich leicht lösen lässt.
   HINWEIS: Dies kann auch mit einem Gefäßclip durchgeführt werden, allerdings lässt der Faden mehr Bewegung und Flexibilität zu. In diesem Stadium ist es möglich, eine erste Abnahme des CBF im LDF-Signal zu beobachten.
8. Platzieren Sie eine Gefäßklammer (siehe Materialtabelle), die die Durchblutung des ICA unterbricht.
9. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der ECA, in der Nähe des Bereichs, in dem sich der feste Knoten befindet.
10. Führen Sie das Monofilament ein, bis die dicke Beschichtung vollständig in das arterielle Lumen eingedrungen ist.
11. Ziehen Sie den zweiten Knoten fest, um das Monofilament in der Arterie zu halten und zu verhindern, dass der vom Blut ausgeübte Druck es herausdrückt (Abbildung 1B).
12. Entfernen Sie die Gefäßklammer vom ICA.
13. Schneiden Sie den ECA unterhalb des ersten Knotens ab und drehen Sie den Stumpf, um ihn in Richtung ICA auszurichten (Abbildung 1C).
14. Schieben Sie das Monofilament über den ICA bis zu dem Punkt, an dem sich der MCA verzweigt.
    HINWEIS: Die Okklusion spiegelt sich in einem abrupten Blutflussabfall in der LDF-Anzeige wider. Wir sprechen von einem erfolgreichen Verschluss, wenn der CBF-Abfall mehr als 70 % des Basalwerts beträgt. Wenn keine CBF-Messsysteme zur Verfügung stehen, kann der Punkt der Okklusion durch den Widerstand gegen den Vorschub festgestellt werden, der bei erwachsenen Mäusen in der Regel etwa 11 mm von der Bifurkation des CCA entfernt ist.
    1. Wenn die Anästhesie während der Okklusionsphase fortgesetzt wird, überwachen Sie die Maus und halten Sie sie 45 Minuten lang unter ständiger Beobachtung.
    2. Falls die Maus während der Okklusionsphase geweckt wird, nähen Sie die Haut des Halses mit mehreren Stichen. Ohne die LDF-Sonde zu trennen, legen Sie die Maus in die temperaturkontrollierte Box, um sich von der Anästhesie zu erholen.
       HINWEIS: Es ist üblich, dass die Maus während dieser Zeit ein spontanes Kreisverhalten zeigt, was auf eine erfolgreiche Okklusion hinweist.
    3. Nach 40 Minuten ist die Maus erneut zu betäuben, wobei die gleichen Anästhesie- und Desinfektionsverfahren wie in den Nummern 1.4, 1.5 und 1.7 beschrieben anzuwenden sind. Legen Sie es zurück auf den Operationstisch und entfernen Sie die Fäden aus dem Hals.
15. Lösen Sie nach 45 Minuten Okklusion den Knoten, der das Monofilament an Ort und Stelle hält. Ziehen Sie langsam und vorsichtig am Filament und prüfen Sie, ob eine Geweberekanalisation stattfindet.
16. Ziehen Sie das Filament heraus und ziehen Sie den Knoten fest, um Blutverlust zu verhindern.
17. Löse den CCA-Knoten. Stellen Sie sicher, dass keine Schäden an der Arterienwand vorliegen.
18. Entfernen Sie die Retraktoren und positionieren Sie die Muskeln, Drüsen und die Haut neu. Die Haut vernähen (6-0) und Desinfektionsmittel auftragen.
19. Trennen Sie die Dopplersonde und nehmen Sie die Halterung ab. Vernähen und desinfizieren Sie die Haut des Kopfes.
20. Lassen Sie die Maus während der Erholungsphase nach der Narkose in einem Käfig, der mit einer Heizung ausgestattet ist, um die Temperatur zu halten. Halten Sie es unter ständiger Beobachtung, bis es sich vollständig von der Narkose erholt hat. Nach der Genesung kann die Maus wieder in ihren Käfig zurückgebracht werden.
    HINWEIS: Wohnen mit sozialer Bereicherung wird dringend empfohlen. Mischen Sie jedoch niemals operierte Mäuse mit nicht operierten Mäusen im selben Käfig ohne physische Trennung, um Aggressionen zu vermeiden.

4. Nachsorge nach der Operation

1. Beaufsichtigen Sie die Tiere regelmäßig gemäß den Verfahren und Vorschriften, die gemäß den örtlichen Vorschriften festgelegt wurden. Bieten Sie eine schmerzstillende Behandlung nach dem entsprechenden Zeitplan an, um die Schmerzen nach der Operation zu minimieren.
   HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde 6 h und 24 h nach der Operation das gleiche Analgetikum wie zu Beginn des Eingriffs (Buprenorphin 0,05 mg/kg KG) appliziert.
2. Euthanasie durchführen, wenn die Aufsichtsparameter dies anzeigen, gemäß den institutionell genehmigten Protokollen.
3. Überwachen Sie täglich das Gewicht der Tiere. Versorgen Sie die Tiere in den ersten Tagen nach der Operation mit weichem Futter. Darüber hinaus sollten sie unmittelbar nach der Operation und in regelmäßigen Abständen nach der Operation durch subkutane Injektion von Kochsalzlösung (200 μl) hydratisiert werden, wenn beobachtet wird, dass die Maus nicht von selbst hydratisiert. Ordnen Sie Futter und Wasser so an, dass es für das Tier leicht zugänglich ist.
4. Sobald die In-vivo-Studie abgeschlossen ist, werden die Mäuse anästhesiert, eingeschläfert und das Hirngewebe für weitere histopathologische Analysen (falls erforderlich) entfernt.

Es gibt verschiedene Ansätze, um das Ergebnis des tMCAo-Verfahrens zu bewerten. Hier kommen In-vivo-Verfahren der Neurobildgebung (MRT) und Verhaltenstests zum Einsatz.

Mäuse entwickeln ischämische Läsionen im Gehirn, die hauptsächlich das Gebiet betreffen, das vom MCA ipsilateral zur Okklusion versorgt wird, wie das Striatum und den dorsolateralen Kortex. Es gibt mehrere Methoden, um das Ausmaß der Läsion zu bestimmen, darunter die Gewebefärbung mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), die histologische Färbung (Hämatoxylin/Eosin, Thioninacetat) und In-vivo-Neuroimaging-Modalitäten wie MRT. Die MRT wurde hier aufgrund ihres nicht-invasiven Charakters und der Möglichkeit, dasselbe Gewebe für andere Studien zu verwenden, ausgewählt, um eine umfassende Beurteilung der Läsion bei jeder Maus zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht die MRT wiederholte Messungen an denselben Tieren, was die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöht und oft die Anzahl der für eine Studie erforderlichen Tiere reduziert.

Das gleiche Anästhesieprotokoll mit Isofluran (Induktion 5%, Erhaltungstherapie 1,5%) wurde in den MRT-Sitzungen verwendet. Für die Beurteilung des Läsionsvolumens wurde eine schnelle T2-gewichtete Sequenz (T2w turbo RARE fast spin-echo)9 verwendet, um die Zeit der Anästhesie des Tieres zu minimieren, was wichtig ist, wenn Längsschnittstudien mit MRT-Aufnahmen zu unterschiedlichen Zeitpunkten an denselben Mäusen durchgeführt werden sollen. Dieses Verfahren ermöglicht die Bewertung von Veränderungen der Läsion im Laufe der Zeit bei denselben Tieren und ist sehr nützlich, wenn es unter anderem für Neuroprotektionsstudien oder zum Testen der Wirksamkeit von Medikamenten angewendet wird. Bildexperimente wurden auf einem 7T horizontalen Tierscanner durchgeführt. Die technischen Spezifikationen der anatomischen Sequenz (kann je nach magnetischer Feldstärke abweichen): T2_TurboRARE; 22 koronale Schnitte; 0,5 mm dick; Echozeit (TE) = 33 ms; Wiederholungszeit (TR) = 2336,39 ms. 2 Mittelwerte. Kippwinkel, 90°; Sichtfeld (FOV) = 20 mm x 20 mm, bei einer Matrixgröße von 256 x 256. Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Beispiel für MR-Bilder der Läsionsentwicklung in derselben Maus, die 40 min, 6 h, 24 h und 48 h nach der Reperfusion beurteilt wurden. Das Fortschreiten des Läsionsvolumens dauert Stunden bis etwa zwei Tage. Die Quantifizierung des Läsionsvolumens zeigt diese Entwicklung im Zeitverlauf (Abbildung 2B).

Es wurde eine Vielzahl von neurologischen Skalen beschrieben, um die neurologische Beeinträchtigung durch ischämischen Insult zu beurteilen. Wir empfehlen die Verwendung von Neuroscore-Tests, die in früheren Manuskripten ausführlich beschrieben wurden. Zum Beispiel wird der von Orsini et al. (2012)10 ausführlich beschriebene Test empfohlen.

Es gibt eine Vielzahl von Verhaltenstests, vor allem um Unterschiede in der Beeinträchtigung der motorischen und sensorischen Funktionen zu erkennen. Zu diesem Zweck wurden der Grifffestigkeitstest und der Eckentest verwendet. Der Griffkrafttest dient der Beurteilung der Motorik. Die Kraft der Vordergliedmaßen wird mit einem Griffkraftmessgerät gemessen, das an einen digitalen Kraftaufnehmer angeschlossen ist (siehe Materialtabelle). Die Maus hält sich mit beiden Vorderpfoten an einer horizontalen Stange fest, während sie sie sanft durch den Schwanz nach hinten zieht. Die maximale Festigkeit des Griffs vor dem Loslassen der Vorderpfoten wird notiert. Es werden fünf Versuche pro Tier durchgeführt, wobei der Hauptwert nach Ausschluss des Höchst- und des Minimalwerts berechnet wird. Der Eckentest wird verwendet, um einseitige Anomalien der sensorischen und motorischen Funktionen zu erkennen. Der Apparat besteht aus einer Ecke mit zwei Brettern (30 cm × 20 cm × 1 cm), die mit einem Winkel von 30° und einer kleinen Öffnung am Ende befestigt sind. Die Maus befindet sich in der Mitte der Ecke. Wenn die Maus tief in die Ecke eindringt, werden beide Seiten der Vibrissen gemeinsam stimuliert. Die Maus dreht sich dann zurück und wendet sich dem offenen Ende zu. Pro Tier werden insgesamt 10 Versuche durchgeführt, wobei die ausgewählten Seiten notiert werden. 50% Links- und Rechtsdrehungen werden unter physiologischen Bedingungen erwartet, während bei Mäusen mit dem rechten MCAo eine Rechtspräferenz erwartet wird. Ein Versuch gilt als gültig, wenn eine vollständige Drehung erreicht ist oder wenn die Maus ihren Kopf ≥ 90º dreht. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Rechtskurven (ipsilateral) angezeigt.

Die repräsentativen Ergebnisse, die den Kraftverlust der Mäuse 24 Stunden nach tMCAo, gemessen durch den Griffkrafttest, zeigen, werden vorgestellt (Abbildung 3A), ebenso wie ihre Präferenz, sich bei Stimulation im Eckentest auf die Seite ipsilateral der Läsion zu drehen (Abbildung 3B). Die Durchführung von Verhaltenstests am Tag der Operation kann weniger präzise sein, da einige Parameter aufgrund der Nähe der Anästhesie und der postoperativen Phase verändert werden können.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Gefäßbaums des Halses (rechts). (A) Das Bild zeigt die Hauptarterien (Arteria carotis communis-CCA, Arteria carotis externa, Arteria carotis interna-ICA) und die verschiedenen Äste (Arteria capitina pterygopalatina Pt; Arteria occipitalis Occ; Arteria thyreoidea superior St; Oberkiefer- und Lingualarterien Max/Lin). (B) In den ersten Schritten des chirurgischen Eingriffs wird die CCA durch Naht ligiert, die ICA-Zirkulation durch eine Gefäßklemme unterbrochen und das Monofilament über die ECA eingeführt. (C) Neuausrichtung des ECA, um das Monofilament in die Okklusionszone zu schieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative MRT-Bilder. (A) T2-w-Bilder derselben Maus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Reperfusion zeigen die Entwicklung der Läsion in der akuten Phase. Die vom Infarkt betroffene Fläche nimmt in den ersten Stunden schnell zu und unterliegt danach nur noch geringen Schwankungen. (B) Entwicklung des Läsionsvolumens in der akuten Phase nach MCAo. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD des Prozentsatzes (%) des Läsionsvolumens dar. Das Läsionsvolumen nimmt in den ersten 24 h nach der Reperfusion signifikant zu (*p = 0,0182; **p = 0,0088; 1-fach ANOVA/ Kruskal-Wallis-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Verhaltenstests vor (basal) und 24 h nach tMCAo (n = 16 Mäuse). (A) Der Griffkrafttest zeigt die maximale (Max.) Kraft pro Maus. (B) Der Kurventest zeigt den Prozentsatz (%) der Rechtsabbieger an. Die Diagramme zeigen Box und Whisker (Minimal- bis Maximalwerte) pro Gruppe, und die Punkte entsprechen den einzelnen Mäusen (****p < 0,0001; Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed Rank Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.