Dieses Protokoll demonstriert eine zuverlässige und effektive Technik zur Isolierung primärer Fibroblasten aus prämenopausalem oder postmenopausalem menschlichem Vaginalgewebe. Bestehende Protokolle für die Isolierung von vaginalen Fibroblasten berücksichtigen nicht die Herausforderungen der Zellisolierung aus seneszentem Gewebe. Vaginalgewebe wurde von Frauen nach einer Operation am Beckenorganprolaps gewonnen.
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Methodenartikel
Gewebeaufbereitung und Isolierung von primären Fibroblasten aus der menschlichen Vagina
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Beckenorganprolaps ist eine Erkrankung, die die Lebensqualität von Frauen stark beeinträchtigt. Es tritt auf, wenn Muskeln und Bänder schwächer werden und die Beckenorgane tiefer im Becken absinken, wodurch eine Ausbuchtung in der Vagina entsteht. Operationen zur Korrektur des Beckenorganprolaps sind eine der Hauptbehandlungen. In jüngster Zeit besteht ein wachsendes Interesse an der Untersuchung der Gewebezusammensetzung von Patienten mit Prolaps auf zellulärer Ebene.
Derzeit gibt es wenig Konsens über die Wirkung des Alters der Spender oder des Patienten auf zellbasierte Therapien. Die derzeit veröffentlichten Protokolle für die Isolierung von vaginalen Fibroblasten konzentrieren sich entweder auf prämenopausales Gewebe oder vernachlässigen es, das Alter des Spendergewebes zu kommentieren. Die meisten bestehenden Protokolle verwenden Tiermodelle. Die Konsistenz des menschlichen Vaginalgewebes ist dichter als das Gewebe, das in den meisten Protokollen verwendet wird. In dieser Studie wurde menschliches Vaginalgewebe hauptsächlich von älteren Spendern gewonnen, was wahrscheinlich zum Scheitern bestehender Protokolle beitrug.
Das Ziel dieser Studie ist es, ein Standardprotokoll für die zuverlässige Gewinnung humaner vaginaler Fibroblasten zu beschreiben, unabhängig vom Alter der Spenderin und dem Menopausenstatus. Die Ergebnisse wurden mit Gewebe von neun verschiedenen Spendern reproduziert, die sich einer Operation am Beckenorganprolaps unterzogen hatten. Sechs Patientinnen waren postmenopausal, wobei die älteste Spenderin 78 Jahre alt war. Das mittlere Alter der Gewebespender betrug 59 Jahre.
In dieser Arbeit beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Erzeugung einer mit Fibroblasten angereicherten Einzelzellsuspension unter Verwendung einer Kombination aus enzymatischer und mechanischer Dissoziation und Zellsuspensionspooling mehrerer vaginaler Biopsien von einem einzigen Spender. Die zuverlässige Isolierung humaner vaginaler primärer Fibroblasten kann bei der Untersuchung von Beckenorganprolaps sowie von Mikrobiom-Wirt-Interaktionen nützlich sein.
Einleitung
Die Ungleichheit zwischen den Geschlechtern in Wissenschaft und Forschung ist ein Dauerthema. Die Erforschung von Störungen, die hauptsächlich Menschen weiblichen Geschlechts betreffen, ist unterfinanziert1. Der Beckenorganprolaps ist eine Erkrankung, die stark mit dem weiblichen Geschlecht verbunden ist. Es tritt auf, wenn Muskeln und Bänder schwächer werden und die Beckenorgane tiefer im Becken absinken, wodurch eine Ausbuchtung in der Vagina entsteht2. Es ist wenig über zelluläre Wechselwirkungen im Rahmen dieser Pathophysiologie bekannt, ebenso wenig wie sich Faktoren auf Gewebeebene auf den Erfolg chirurgischer Eingriffe auswirken3.
Primärzellen anstelle von Zelllinien werden weithin als wesentlich für die translationale klinische Forschung anerkannt, da sie eine höhere physiologische Relevanz bieten4. Primärzellen werden direkt aus dem interessierenden Körpergewebe entnommen und können die In-vivo-Physiologie genauer nachahmen. Die Isolierung primärer Fibroblasten aus der menschlichen Vagina kann nützlich sein, um die biologischen Mechanismen des Beckenorganprolaps und die Modellierung von Krankheiten zu untersuchen, wobei wichtige Spendermerkmale wie Alter und Menopausenstatus berücksichtigt werden.
Ein Beckenorganprolaps betrifft häufig ältere oder postmenopausale Personen. Die Isolierung und Proliferation von primären Fibroblastenzellen bei der Untersuchung dieser Erkrankung ist aufgrund der reduzierten Zellpopulationen und der klonogenen Fähigkeit älterer Spender eine Herausforderung5. Nach unserer Erfahrung konnte bei der Verwendung der zuvor beschriebenen Protokolle zur Dissoziation von Vaginalgewebe keine Fibroblasten aus einer Standardbiopsie von 1 cm2 Gewebe extrahiert werden.
Durch eine Literaturrecherche fanden wir heraus, dass ähnliche Studien in zwei Gruppen unterteilt wurden: Tiermodelle, wie z.B. Maus6, und Humanmodelle 7,8. Bei der Befolgung des Mausprotokolls führte die Verwendung einer Schere für die Gewebeverarbeitung von menschlichem Vaginalgewebe zu einer unzureichenden mechanischen Verdauung. Die Extrapolation von Protokollen mit murinem Gewebe und anderen Gewebestellen9 war nicht erfolgreich.
Die meisten Arbeiten, die menschliche Vaginalproben verwendeten, verwendeten Gewebe von prämenopausalen Personen mit Beckenorganprolaps 7,10. Obwohl in einigen Arbeiten über die Verwendung von Proben sowohl von prämenopausalen als auch von postmenopausalen Personen berichtetwurde 11, wurde das Protokoll, das zur erfolgreichen Isolierung von Fibroblasten von älteren oder postmenopausalen Spendern verwendet wurde, nicht detailliert genug beschrieben. Die Isolierung und Modellierung von Krankheiten mit Fibroblasten aus postmenopausalem Gewebe kann für das Verständnis der zellulären Pathophysiologie des Beckenorganprolaps unerlässlich sein, da diese Erkrankung in den zehn Jahren nach der Menopause die höchste Prävalenz bei Personen aufweist12.
Wir beschreiben ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung einer mit Fibroblasten angereicherten Einzelzellsuspension aus humanem Vaginalgewebe unter Verwendung einer Kombination aus mechanischer und enzymatischer Dissoziation. Dieser Artikel beschreibt ein zuverlässiges Protokoll zur Gewinnung postmenopausaler oder alternder humaner vaginaler Fibroblasten. Bei den isolierten Zellen wurde durch morphologische Untersuchung mittels Phasenkontrastmikroskopie und Immunfluoreszenz (IF) bestätigt, dass es sich bei den isolierten Zellen um Fibroblasten handelte, um die Expression von Vimentin, F-Aktin und α-glattem Muskelaktin (α-SMA) zu beurteilen.
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Protokoll
Vaginalgewebe wurde von Frauen gewonnen, die sich einer Operation am Beckenorganprolaps unterzogen haben. Das nach der Operation gesammelte Vaginalgewebe galt als Abfallmaterial und würde sonst entsorgt werden. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Review Board of Massachusetts General Brigham genehmigt.
1. Entnahme von Vaginalgewebe bei der Patientin
- Diagnostizieren Sie einen Beckenorganprolaps durch Anamnese und Befunde der Beckenuntersuchung: In der Klinik wurden Messungen zur Quantifizierung des Beckenorganprolapses (POP-Q) durchgeführt, die Hinweise auf einen Beckenorganprolaps zeigten.
- Verwenden Sie die folgenden Einschlusskriterien: über 18 Jahre; symptomatischer Beckenorganprolaps in der Vorgeschichte; Entscheidung für eine chirurgische Korrektur des Beckenorganprolaps.
- Ausgenommen sind: Schwangere Frauen und Patientinnen, die eine Gewebespende verweigern.
- Schneiden Sie das überschüssige Vaginalgewebe als notwendigen Schritt der Operation des Beckenorganprolaps ab. Dieses Vaginalepithel wird nach den folgenden Operationen in seiner Gesamtdicke exzidiert: vordere Kolporrhaphie, hintere Kolporrhaphie und Kolpokleisis.
- Transportieren Sie das Gewebe in einem sterilen Probenentnahmebecher mit normaler Kochsalzlösung oder serumfreiem DMEM/F12 (Gibco) Medium zum Labor. Bleiben Sie auf Eis.
2. Gewebeverarbeitung und Verdauung
- Vorbereitung des Gewebes
- Messen und schneiden Sie das Gewebe so, dass es die gesamte Dicke des Vaginalepithels umfasst, wobei Segmente von ca. 1 cm2 entstehen.
- Stellen Sie sicher, dass die Biopsiegröße 1 cm2 präzise gemessen wird.
HINWEIS: Eine Überschätzung der Größe der Gewebebiopsie kann die Gewebeverdauung beeinträchtigen. - Bereiten Sie 2-3 weitere Vaginalbiopsien von je 1 cm2 von einem einzigen Spender vor und legen Sie die Biopsien beiseite.
- Mechanischer Aufschluss
- Legen Sie die Vaginalbiopsie in eine 10 cm große Zellkultur-Petrischale. Pipettieren Sie 500-1.000 μl serumfreies Medium, ergänzt mit 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 2,5 μg/ml Amphotericin Bonto, in das Vaginalgewebe, um das Gewebe vor dem Austrocknen zu schützen.
- Zerkleinern Sie das Vaginalgewebe mit zwei sterilen Skalpellen (Nr. 11 oder Nr. 15) in beiden Händen in kleine Fragmente.
- Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Klingen senkrecht zur Oberfläche des Gewebes stehen. Üben Sie mit zwei Skalpellen gleichmäßigen und gleichmäßigen Druck auf die Gewebeoberfläche aus. Führen Sie einen abwechselnden Zugvorgang aus, um das Gewebe in sehr kleine Stücke zu schneiden.
- Wiederholen Sie diese Zerkleinerungstechnik mit der Zwei-Skalpell-Technik, bis die Probe mit 1-2 mm großen Stücken eine gleichmäßige Konsistenz hat.
HINWEIS: Der mechanische Aufschluss mit dieser Zwei-Skalpell-Technik einer 1 cm2 Biopsie sollte ca. 15-20 Minuten dauern. - Geben Sie 2-3 ml serumfreies DMEM/F12-Medium, ergänzt mit 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin, 2,5 μg/ml Amphotericin B, auf die Platte und suspendieren Sie das zerkleinerte Gewebe. Pipettieren Sie die Lösung, die Gewebefragmente enthält, auf und ab, um eventuelle Klumpen aufzulösen.
- Enzymatischer Aufschluss
- Übertragen Sie die Lösung, die Gewebefragmente enthält, in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Geben Sie serumfreies DMEM/F12-Medium in die Gewebekulturschale, in der das Vaginalgewebe zerkleinert wurde, um verbleibende Gewebefragmente zu sammeln. Übertragen Sie die Lösung, die Gewebefragmente enthält, in das konische Röhrchen. Fügen Sie zusätzliches serumfreies DMEM/F12-Medium hinzu, bis das Gesamtvolumen 10 ml beträgt.
- 5 mg Liberase in 1 ml sterilem Wasser (5 mg/ml) auflösen. In 230 μl Aliquoten bei -20 °C für bis zu einem Monat oder -80 °C für 6 Monate lagern.
- Geben Sie 230 μl Liberase (Stamm 13 U/ml) in das Röhrchen mit einer Endkonzentration von 0,3 U/ml.
HINWEIS: Die Aktivität von Liberase kann zwischen den Chargen variieren. Tauen Sie jedes Aliquot unmittelbar vor Gebrauch mit einem Wasserbad auf. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. - Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.3 für 2-3 weitere Vaginalbiopsien derselben Spenderin.
HINWEIS: Bewahren Sie jede Lösung, die Gewebefragmente aus einer einzigen Biopsie enthält, in separaten konischen Röhrchen auf. Zum Beispiel 4 vaginale Biopsien in 4 Röhrchen. Dies ist wichtig für eine optimale Zellpelletierung nach der Zentrifugation. - Die Röhrchen werden 3 h lang bei 37 °C unter ständigem, kräftigem Rühren mit einem Probenmischer inkubiert.
- Stellen Sie einen Probenmischer in einen CO2 -Inkubator. Halten Sie konstante Bewegung aufrecht. (Einstellungen für den Beispielmischer: 25 U/min Rotationsbewegung für 5 s, 30° reziprok (Kippdrehung) für 5 s und 2° Vibrationsbewegung (Vortexing) für 3 s).
- Während der Inkubation die Röhrchen in Abständen von 30 Minuten vortexen.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 3.000 x g für 5 min. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 1-2 ml DMEM/F12-Medien mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin, 2,5 μg/ml Amphotericin B, um das Lierase-Enzym zu verdünnen. Pipettieren Sie kräftig, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist.
3. Zellkultur
- Entfernung von unverdauten Gewebefragmenten
- Legen Sie ein 100-μm-Zellsieb über einen sterilen konischen 50-ml-Behälter.
- Fassen Sie die Zellsuspension aus den mehreren Gewebebiopsien desselben Spenders zusammen.
- Die Gewebe-/Enzymsuspension abseihen und mit einem 5-ml-Spritzenkolben durchdrücken. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die restlichen Gewebefragmente vollständig durchgedrückt zu sein scheinen.
HINWEIS: Es kann sein, dass etwas Schleim aus den Gewebefragmenten der Vagina vorhanden ist, der nicht vollständig durch das Sieb gearbeitet wird. Entsorgen Sie den Schleim mit dem Zellsieb.
- Pooling von Zellkulturen
- Plattengepoolte Zellsuspension aus mehreren vaginalen Biopsien (vom selben Spender) auf einer Petrischale (60 mm x 15 mm).
- Inkubieren Sie die Petrischale über Nacht in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C.
- Beobachten und bestätigen Sie das Vorhandensein von nicht adhärenten Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop.
- Stellen Sie sicher, dass sich der Fokus des Mikroskops auf der Unterseite der Platte befindet.
HINWEIS: Es können viele Immunzellen im Vordergrund sein. Eine kleinere Anzahl von Fibroblasten wird an der Unterseite der Platte befestigt. - Warten Sie 18-24 Stunden, bevor Sie das Zellkulturmedium wechseln, um eine ausreichende Zelladhärenz sicherzustellen.
- Wechseln Sie das Kulturmedium alle drei Tage, bis eine Konfluenz von 80 % auftritt. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreichen, expandieren Sie in einen größeren Kolben oder frieren Sie die Aliquote der Zellen für die zukünftige Verwendung ein.
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Ergebnisse
Vaginalgewebe wurde von 10 unabhängigen Spendern entnommen, die sich einer Operation am Beckenorganprolaps unterzogen. Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurden Zellen aus menschlichem Vaginalgewebe isoliert. Die Zellpopulationen hatten ein charakteristisches längliches, flaches und spindelförmiges Aussehen. Wie in anderen Studien auch, beobachteten wir mit zunehmendem Alter des Spenders eine signifikant langsamere Zellverdopplungskapazität und eine verringerte klonogene Fähigkeit der Fibroblasten. Diese Unter...
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Diskussion
In vielen früheren Studien wurde berichtet, wie primäre Fibroblasten aus der menschlichen Vagina isoliert werdenkönnen 3,7. In mehreren Studien wurde menschliches Vaginalgewebe von prämenopausalen Personen mit Beckenorganprolaps verwendet. Obwohl einige Arbeiten über die Verwendung von Gewebe von prämenopausalen und postmenopausalen Personen berichteten 7,11, beschrieben ...
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Offenlegungen
Wir haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken allen Mitgliedern des Vincent Center of Reproductive Biology am Massachusetts General Hospital sowie der VIncent Memorial Hospital Foundation für ihre großzügige Unterstützung. Besonderer Dank geht an Dr. Bo Rueda und sein Labor für ihre wertvollen Anregungen und die Leihgabe von Laborgeräten.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Amphotericin B | Bio Techne | B23192 | |
| Zellsieb (100 μ m) | ThermoFisher Scientific | 22363549 | |
| konische Zentrifugenröhrchen (15 mL) | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Feder Einweg-Skalpell Nr. 15 | Socorex | FB.15 | |
| Fötales Rinderserum | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| konische Zentrifugenröhrchen mit hoher Klarheit (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| HulaMixer Probenmischer | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| Humanes Fibronektin DuoSet ELISA | R& D Systems | DY1918-05 | |
| Pro-Kollagen I alpha 1 DuoSet ELISA | R& D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| (5000U/ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Petrischale, Polystyrol (100 mm x 20 mm) | Millipore Sigma | P5606 | |
| Serologische Pipetten (10 mL) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| Sterile Spritzen (5 mL) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
Referenzen
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